專利名稱：一種高效分泌谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高產谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌，特別是一種能高效分泌谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌及其應用。
背景技術：
微生物谷氨酰胺轉胺酶(蛋白質-谷氨酸-谷氨酰胺轉胺酶，Microbial Transglutaminase, EC2. 3. 2. 13簡稱MTG)其生物學功能是直接改變蛋白質本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價值。因此，MTG在食品、紡織、生物制藥等領域有著廣泛的應用前景。盡管微生物MTG已實現了工業化生產，但依靠菌種篩選和過程優化的傳統發酵技術獲得的產量仍然較為有限，遠不能滿足市場對MTG日益增長的需求。隨著蛋白質表達技術的迅速發展，通過分子生物學的方法構建MTG高產重組菌成為國內外研究者關注的一個熱點。為進一步提高產量，日本味之素公司率先開展了 MTG重組菌構建的工作。隨后，德國Martin-Luther University、臺灣食品工業發展研究所、臺灣國立中興大學、中科院微生物研究所、華南理工大學及諾和諾德(中國)制藥有限公司等相關研究機構或企業相繼報導了重組MTG的制備策略。至此，鏈霉菌MTG已在大腸桿菌、酵母、鏈霉菌及谷氨酸棒桿菌等宿主中成功表達。由于MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外經活化蛋白酶活化成有活性 MTG,因此在在選擇大腸桿菌，酵母為表達宿主，不能夠直接得到有活性的蛋白，還需經過處理。由于MTG基因來源于鏈霉菌，且可以被鏈霉菌的胞外蛋白酶活化，因此鏈霉菌可以作為 MTG表達的理想宿主。

發明內容
為解決MTG產量低，成本高的問題，且基因工程菌無法分泌表達成熟酶的缺陷， 本發明提供一種能高效分泌谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌，可以實現MTG的高效分泌。在前期研究中，本研究室篩選出一株新的產谷氨酰胺轉胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062)，通過基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的啟動子和終止子(Genebank :EU477523)。本發明將MTG基因連接到表達載體pIJ86 (購于The John Innes center), 以 S. Iividan TK24 為表達宿主(Hopwood, D.，Bibb, Μ.，Chate, r. K.，Bruton, C.， 1985.Geneticmanipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundations，Norwich, England.)，構建了高產 MTG 的工程菌。本發明所用到的培養基YEME培養基葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、麥芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖 340g/L、MgCl2 · 6H20 5mmoL/L、甘氛酸 5g/L ；MS 培養基甘露醇 20g/L、黃豆粉 20g/L、瓊脂粉 20g/L，pH7. 2-7. 3 ；R5 培養基蔗糖 103g/L、K2SO4 0. 25g/L、MgCl2 · 6H20 10. 12g/L、葡萄糖 10g/L、Difco酪蛋白氨基酸O. lg/L、Oxoid酵母提取物5g/L、TES 5. 73g/L。稱取5. 5g Difco瓊脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115°C滅菌15min。使用時，將培養基融化， 每瓶中加入=KH2PO4(O. 5% )2. 5mL、CaCl2 · 2H20(5mol/l) lmL、L-脯氨酸(20% )3. 75mL、 NaOH(lmol/L)2. 5mL ；斜面培養基(g/L):葡萄糖4g/L、麥芽粉(Difco) 3g/L、酵母粉4g/L、瓊脂粉20g/ L, pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 種子培養基(SM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、 MgSO4 · 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L ；pH 7. 0 ；S. hygroscopicus發酵培養基(FM):酵母粉5g/L、甘油30g/L、蛋白胨20g/L、大豆粉 15g/L、K2HP044g/L、MgSO4 · 7H20 2g/L、CaC05g/L ；pH 7. 4 ；胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB) :0xoid胰胨豆湯粉(TSB) 30g/L;Ml :葡萄糖 10g/L、蛋白胨 20g/L、MgSO4 · 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、酵母粉 3g/L、甘氨酸 3g/L，pH 7.2。LB 培養基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. 0 ；本發明中谷氨酰胺轉胺酶活力的測定比色法測定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY為作用底物，L-谷氨酸-Y單羥胺酸做標準曲線。I個單位谷氨酰胺轉胺酶酶活定義為37°C時每分鐘催化形成lymol L-谷氨酸-Y單羥胺酸的酶量(U/mL)。試劑A : IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL O. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入 O. 2mol/L ρΗ6· O 的 Tris-HC 緩沖液 4mL，0. lmol/L 羥胺 2mL，0. Olmol/L 的還原型谷胱甘肽 2mL,并調節pH至6. O。試劑B 3mol/L 的 HCL, 12% TCA, 5% FeCL3 按 I : I : I 混合。配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標準溶液。取ImL試劑A與O. 4mL 不同濃度的L-谷氨酸-Y -單異羥肟酸標準溶液混合，37°C水浴10分鐘。加O. 4mL試劑B 終止反應，在525nm比色，繪制出標準曲線。以O. 4mL經適當稀釋的酶液代替標準溶液，在相同條件下保溫和比色，從標準曲線求出酶活。以100°C加熱10分鐘的離心后的上清液為空白。酶活力(u/mL) = (6. 8548XOD525-O. 0164) X 稀釋倍數本發明以pIJ86為表達載體，利用TGase天然啟動子、信號肽構建了 TGase表達載體pIJ86/tgl,并將它們轉化表達宿主S. Iividans TK24。在較優的發酵條件下,S. Iividans TK24(pIJ86/tgl)搖瓶發酵的TGase活力可達到3. OU/mL，3L發酵罐培養最高酶活為2. 3 U/ mL。通過本發明提供的工程菌及發酵方法，實現了 MTG在S. Iividan TK24中高效率分泌性表達，適合工業化生產。


圖I表達載體pIJ86/tgl構建流程2 (A) tglPCR產物和(B) pi J86/tgl酶切電泳驗證(A)M :DL10000DNA 標準分子量；1 :tglPCR 片段；(B)M DL 10000 DNA 標準分子量；I S. hygroscopicus 基因組 DNA ；2 Kpn I 和 Bgl II 酶切表達質粒 pIJ86/tgl圖3重組菌表達上清
I :蛋白Marker ；2 :含表達質粒pIJ86/tgl ；3 :含空質粒；4 :不含質粒圖4S. Iividans TK24 (pIJ86/tgl) 3L 罐發酵優化
具體實施例方式實施例I :表達載體的構建質粒構建如圖I所示，HS. hygroscopicus基因組DNA為模板，根據反向PCR 的得到的TGase上下游基因序列，設計含有Kpn I和Bgl II位點的兩端引物TGF : CGGGGTACCCCGTAGCGGGTGGCGAAGAT 和 TGR GGAAGATCTCACGAGGACACCGAACGACTG 引物均由上海生工生物工程公司合成。將上述PCR片段膠回收，經Kpn I和Bgl II酶切后，回收的目的片段，再與經過同樣酶切處理后的PIJ86片段，用連接酶solution I連接過夜，連接產物轉化E. coli JM109。得到的轉化子經菌落PCR驗證后，挑選陽性克隆接種到液體LB，培養 10-12h，提取質粒，并采用酶切電泳和測序鑒定(圖2)。最終得到含有正確序列的表達載體 pIJ86/tgl。 實施例2 :重組MTG工程菌的構建將構建好的pIJ86/tgl轉化鏈霉菌原生質體,具體步驟如下(I)在250mL三角瓶中加入50mL的YEME，接種100 μ L的孢子懸液，于30°C搖床中培養36 40h。(2)將培養物倒入離心管中，3500r/min離心lOmin。(3)棄上清，將菌絲體懸浮于15mL的10. 3 %的鹿糖溶液中，3500r/min離心 IOmin,棄上清。同此法洗兩次。(4)取ImL菌絲體，加入4mL的溶菌酶溶液(溶菌酶母液為50mg/mL P Buffer,終濃度為2mg/mL,用P Buffer稀釋),于30°C水浴30 60min (間隔5min輕輕搖動)至上清
呈乳狀。(5)加入5mL的PBuffer并用5mL的吸管吹吸幾次,繼續溫浴lOmin。(6)用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉入無菌干凈的離心管中，3500r/min離心 7min,原生質體沉淀呈黃色。(7)棄上清，輕柔打散原生質體，用PBuffer洗兩次(洗去溶菌酶)。每次仍使用 3500r/min 離心 7min。(8)棄上清，用槍頭將原生質體打散，分裝，于_70°C保存。(9)將最多5 μ L的DNA (質粒或酶連產物)加于已經裝有50 μ L原生質體的離心管(I. 5mL)的管壁上(不與原生質體接觸)。(10)吸取200 μ L的25% PEG4000，將DNA沖入原生質體中，小心抽吸幾次，混勻。(11)將混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。(12)30°C培養14 20h后，用含有適當抗生素的ImL無菌水溶液覆蓋。(13)再培養I 2d后，即可看到小的轉化子菌落長出。實施例3 :重組MTG工程菌的發酵優化種子培養接一鏟生長良好的斜面培養物(也可以直接接種孢子懸液)至裝有 IOOmL種子培養基的500mL三角瓶中培養，搖瓶轉速為200r/min，溫度30°C，培養時間24h。搖瓶培養將培養好的種子按8%的接種量接入發酵瓶中，培養溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，500mL三角瓶裝液量為50mL，培養時間42_72h。3L NBS發酵罐培養裝液量I. 5L，接種量400mL，攪拌550r/min，通氣2. Ovvm,溫度 30。。。各培養基使用前添加阿泊拉霉素至終濃度為50yg/mL。將表達載體pIJ86/tgl轉化至S. Iividans TK24,經過抗性平板篩選和質粒酶切驗證，得到正確的重組菌S. Iividans TK24 (piJ86/tgl)，通過SDS-PAGE電泳(圖3)可以檢測到重組MTG條帶，且最高酶活可達3U/ml。為進一步考察S. Iividans TK24(pIJ86/tgl)的工業化前景，在3L發酵罐上驗證了重組菌的TGase生產能力。不控制環境pH的情況下，重組菌細胞干重在36h達到最大 (17. 6g/L)，甘油在60h時即全部消耗，TGase產量在42h到達最大值，I. 60U/mL。值得注意的是，在整個發酵過程中PH有明顯波動，先下降后升高，在發酵后期升高至pH 8. 5 ;為了考察環境pH對TGase表達的影響，在發酵過程恒定pH 7.5。實驗結果如圖2_10所示，重組菌細胞干重顯著提高，可以到達22. 7g/L，比不控制環境pH的條件下提高了 28. 9%;甘油在 60h被消耗完全，在發酵36h時TGase產量達到最值(2. 3U/mL)，較不控制不控制環境pH時提前 6h，TGase 產量提高 43. 75%。由此可見，pH 對 S. Iividans TK24 (pIJ86/tgl)生產重組TGase有重要影響(圖4)。
權利要求
1.一種高效分泌谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌(streptomyces Iividan),其特征在于細胞內含有高效表達MTG基因的載體pIJ86/tgl，MTG基因如Genebank EU477523所示。
2.構建權利要求I所述變鉛青鏈霉菌的方法，其特征在于包括如下步驟通過基因克隆得到菌株吸水鏈霉菌CCTCC No. M203062谷氨酰胺轉胺酶編碼基因序列及其上下游序列； 將得到的tgl基因克隆到表達載體pIJ86轉化變鉛青鏈霉菌TK24原生質體，構建高效分泌谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌。
3.應用權利要求I所述變鉛青鏈霉菌發酵生產谷氨酰胺轉胺酶的方法，其特征在于步驟如下將培養好的變鉛青鏈霉菌種子液按8%的接種量接入發酵培養基，培養溫度30°C， 搖瓶轉速200r/min，500mL三角瓶裝液量為50mL，培養時間42_72h。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于變鉛青鏈霉菌種子液的制備方法為接種一鏟生長良好的斜面培養物或直接接種孢子懸液至裝有IOOmL種子培養基的500mL三角瓶中培養，搖瓶轉速為200r/min，溫度30°C，培養時間24h。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于發酵培養基配方為酵母粉5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、大豆粉 15g/L、K2HPO4 4g/L、MgSO4 · 7H20 2g/L、CaCO3 5g/L ；pH 7. 4， 使用前添加阿泊拉霉素至終濃度為50 μ g/mL。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于種子培養基配方為酵母粉5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、MgS04 · 7H20 2g/L、K2HP04 2g/L、KH2P04 2g/L ；pH 7.0，使用前添加阿泊拉霉素至終濃度為50 μ g/mL。
全文摘要
本發明公開了一種高效分泌谷氨酰胺轉胺酶的變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividan)，其細胞內含有高效表達MTG基因的載體pIJ86/tg1，MTG基因如GenebankEU477523所示，通過發酵優化本發明以pIJ86為表達載體，利用TGase天然啟動子、信號肽構建了TGase表達載體pIJ86/tg1，并將它們轉化表達宿主S.lividans TK24。在較優的發酵條件下，S.lividansTK24(pIJ86/tg1)搖瓶發酵的TGase活力可達到3.0U/mL，3L發酵罐培養最高酶活為2.3 U/mL。通過本發明提供的工程菌及發酵方法，實現了MTG在S.lividan TK24中高效率分泌性表達，適合工業化生產。
文檔編號C12N9/10GK102586164SQ201210034340
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者劉松, 堵國成, 張東旭, 楊怡敏, 陳堅, 陳康康, 馬建龍 申請人:江南大學