專利名稱：肝素黃桿菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的凍干保存方法
技術領域：
本發明涉及一種肝素酶I、II、III的凍干保存方法，尤其涉及一種由氯化鈣和海藻糖組成的保護劑，用于凍干過程中肝素酶I、II、III的活性保護。
背景技術：
肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發現并分離出來的，其后，又陸續在一些微生物和動物組織中發現存在肝素酶。肝素酶的應用十分廣泛，如清除血液中殘存肝素、防止凝血、生產低分子肝素、研究肝素的結構。目前有學術論文報道的肝素酶大約有10多種，得到較為細致研究的只有來自肝素黃桿菌的3種酶，分別是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分別是分子量大約 43、78、66kd的單體蛋白質，其等電點均在9.0左右，應用和研究非常廣泛。肝素酶是一種很容易失活的酶，Daniel等[Daniel etal, (1992) J. Bio. Chem. 267(34)24347-24355]簡述了對純化的三種肝素酶做的穩定性研究，肝素酶I溶液在 4°C短期保存即失活50%，而經過一次冷凍融化或凍干融化，只能分別保留45%和25%的活性。肝素酶II經過一次冷凍融化或凍干融化，都可保留大約75%活性。肝素酶III溶液在4°C短期保存基本不失活，而經過一次冷凍融化或凍干融化，只能保留20%到30%的活性。給肝素酶I溶液中添加2mg/ml牛白蛋白，可在三種處理條件下保持85 %以上的活性，而加入5%的半乳糖，則能保留40-80%的活性。肝素酶II溶液中即使添加了所述兩種保護劑，也基本無促進效果。添加牛白蛋白，可使肝素酶111活性收率提高20-25 %，但添加半乳糖反而使活性更加不穩定。對于需要保持生物活性的酶類物質的保存和使用，凍干粉是一種很有效的方法。 干燥的酶類一般具有更高的穩定性，也方便運輸。但是酶類一般都對熱敏感，所以需要采用冷凍干燥法。先將待干燥的酶液在低溫下凍結，然后低溫抽真空讓水分由固體狀態直接升華為水蒸氣并從酶中排除而實現干燥。但是在酶凍結過程中有些比較脆弱的酶仍會發生失活現象，需要加入某種保護劑，比如海藻糖、蔗糖、白蛋白、明膠等。不同的保護劑適用于不同的酶。對肝素酶做凍干保護的研究報道可檢索到的很少，主要在Daniel等 [Danieletal, (1992) J. Bio. Chem. 267(34)24347-24355]的研究中，但給出的信息也不全面，有些結果也與我們的結果有差異。其中肝素酶I在沒有保護劑的情況下經過一次凍干融化保留25%的活性的結果與我們的實驗結果接近(33. 8% )。肝素酶II經過一次凍干融化保留75%活性的結果則與我們的實驗結果(38. 3% )相差較大。肝素酶III經過一次凍干融化保留30%活性的結果與我們的實驗結果接近(47. 2% )。本發明給出一種以氯化鈣和海藻糖為內容的凍干保護劑，用于將肝素酶I、II、III 凍干，在保護劑作用下維持了較高的活性。這樣制得的酶凍干粉便于儲存、運輸、使用，提高了應用價值。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種肝素酶I、II、III的凍干保存方法，尤其涉及一種由氯化鈣和海藻糖組成的保護劑，用于凍干過程中肝素酶I、II、III的活性保護。該方法可對3種酶的凍干起到顯著保護作用，凍干粉復水后肝素酶I的活性回復率為 73. 9% (對照為33. 8% )，肝素酶II的活性回復率為98. 8% (對照為38. 3% )，的活性回復率為77. 4% (對照為47. 2% )。在本發明的第一方面，本發明提供了肝素酶I和/或II的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、制備肝素酶I、II溶液，采用TriS-HCl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈣緩沖液等作為溶解上述肝素酶的溶劑；步驟2、制備保護劑溶液制備海藻糖溶液以及任選的氯化鈣溶液，或者二者的混合溶液，采用Tris-HCl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈣緩沖液等作為溶解上述保護劑的溶劑；步驟3、將步驟2中獲得的保護劑溶液和步驟I中獲得的肝素酶I和/或II的溶液的混合；步驟4、將混合液凍干。在本發明的第二方面，本發明提供了肝素酶III的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、制備肝素酶III溶液，采用Tris-HCl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈣緩沖液等作為溶解上述肝素酶的溶劑；步驟2、制備保護劑溶液制備海藻糖溶液，采用Tris-HCl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈣緩沖液等作為溶解上述保護劑的溶劑；步驟3、將步驟2中獲得的保護劑和步驟I中獲得的肝素酶III的溶液的混合；步驟4、將混合液凍干。在上述實施方案中，優選步驟I中用于溶解肝素酶I、II和/或III的溶劑為 Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，更優選該溶劑為10 50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，最優選 IOmM 的 Tris-HCl 緩沖液(pH7. 0)；在上述實施方案中，優選步驟I中肝素酶I、II和/或III在溶液中的濃度為 0. l-100IU/ml，更優選為 l-10IU/ml，最優選為 2_5IU/ml。在上述實施方案中，優選步驟2中使用的溶劑為Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，更優選該溶劑為10 50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)，最優選IOmM的Tris-HCl緩沖液 (pH7. 0)；在上述實施方案中，優選步驟2中氯化鈣溶液的濃度為40mM_2M，更優選 IOOmM-IM ;優選海藻糖的濃度為20-50% (w/v)，更優選50% (w/v)。在上述實施方案中，優選步驟3中，保護劑溶液與步驟I中獲得的肝素酶I、II和 /或III的體積比為1/1-20/1，更優選2/1-10/1，最優選5/1-10/1。在優選的實施方案中，在步驟3中，可以同時或者順序加入氯化鈣和海藻糖溶液；在優選的實施方案中，在步驟3中，當僅僅用于肝素酶I時，混合之后，氯化鈣的濃度為20mM，海藻糖的濃度為5% (w/v(g/ml)，即5g/100ml)。
在優選的實施方案中，在步驟3中，當用于肝素酶II時，混合之后，氯化鈣的濃度為IOmM,海藻糖的濃度為10% (w/v(g/ml))。在優選的實施方案中，在步驟3中，當用于肝素酶III時，混合之后，海藻糖的濃度 % 10% (w/v(g/ml))。在上述實施方案中，優選在步驟4中，通過以下方式將溶液凍干將加有保護劑的肝素酶在-70°C冷凍結冰，然后置于冷凍干燥器凍干腔內，抽真空過夜干燥。在進一步優選的實施方案中，本發明的肝素酶I、II的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、肝素酶I、II溶液的制備取制備的肝素酶I、II在100倍體積的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)中透析過夜，測定活性后，調整濃度至酶活力2-5IU/ml，分別裝入I. 5ml EP (實驗室用小型塑料離心管，1.5ml裝量規格)管中。步驟2、保護劑氯化鈣溶液和海藻糖溶液的制備預先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)以及任選的含 IOOmM 氯化鈣的 IOmM Tris-HCl 緩沖液(pH7. 0)。步驟3、保護劑和肝素酶I、II溶液的混合將適當量的上述氯化鈣溶液和海藻糖溶液分別加入到肝素酶溶液中，定容到 IOOul。輕輕振蕩搖勻，使氯化鈣含量達到0-20mM(0 <= c <= 20mM)，海藻糖含量達到 5-10 % (w/v)。步驟4、混合液凍干將加有保護劑的肝素酶在_70°C冷凍結冰，然后置于冷凍干燥器凍干腔內，抽真空過夜干燥。在上述步驟3中，加入保護劑之后，還可以測定酶活力，以進行活性對比。在另一進一步優選的實施方案中，本發明的肝素酶III的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、肝素酶III溶液的制備取制備的肝素酶III在100倍體積的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)中透析過夜，測定活性后，調整濃度至酶活力2-5IU/ml，裝入I. 5ml EP(實驗室用小型塑料離心管， 1.5ml裝量規格)管中。步驟2、保護劑海藻糖溶液的制備預先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)。步驟3、保護劑和肝素酶III溶液的混合將適當量的上述海藻糖溶液加入到肝素酶溶液中，定容到lOOul。輕輕振蕩搖勻， 使海藻糖含量達到5-10% (w/v)。步驟4、混合液凍干將加有保護劑的肝素酶在_70°C冷凍結冰，然后置于冷凍干燥器凍干腔內，抽真空過夜干燥。在上述步驟3中，加入保護劑之后，還可以測定酶活力，以進行活性對比。在上述實施方案中，
步驟I所述的酶液的緩沖體系為IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)。步驟2所述的凍干保護劑的緩沖體系為IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)。步驟2所述的凍干保護劑的組成為氯化鈣(0_20mM)，海藻糖(5_10% w/v)。步驟3所述的凍干保護劑，用于肝素酶I的組成為氯化鈣20mM，海藻糖5%。步驟3所述的凍干保護劑，用于肝素酶II的組成為氯化鈣10mM，海藻糖10%。步驟3所述的凍干保護劑，用于肝素酶III的組成為海藻糖10%。對用本發明方法保存的混合凍干粉進行活性測定，證明活性保留率極高。活性保留率的測定方法如下將凍干的肝素酶以IOOul純化水復水溶解，測定酶活力，與凍干前酶活力相比較，
計算酶活保留率。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例所用肝素酶為來自肝素黃桿菌發酵培養后由菌體中分離純化得到，酶制備過程見發明人早先提交的發明專利“一種肝素酶I、II、III的制備方法”申請號201110241260. 4。a、取制備的肝素酶I、II、III在100倍體積的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)中透析過夜，測定活性后，調整濃度至酶活力2IU/ml，分別裝入I. 5ml EP管中，每管50ul ；b、將適當量的預先配制的含IOOmM氯化鈣的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)和含50% (w/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. 0)分別加入到肝素酶溶液中，定容到 lOOul，輕輕振蕩搖勻，使肝素酶I溶液中除緩沖液外含氯化鈣20mM、海藻糖5%，使肝素酶 II溶液中除緩沖液外含氯化鈣10mM、海藻糖10%，使肝素酶III溶液中除緩沖液外含海藻糖 10 ;C、將加有保護劑的肝素酶在_70°C冷凍結冰，然后置于冷凍干燥器凍干腔內，抽真空過夜干燥；d、將凍干的肝素酶以IOOul純化水復水溶解，測定酶活力，與凍干前酶活力相比較，計算酶活保留率。在步驟d中，測定酶活力的具體方法如下肝素酶I、II活性測定在5ml石英比色皿中加入在30°C預熱過的2. 5ml肝素濃度為 lmg/ml 的 1^8-11(1(501111，含0&(12101111，？117. 0)緩沖液，移取 5-20 酶液，搖勻后在 232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據摩爾消光系數計算單位時間產生的雙鍵的摩爾數，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。肝素酶III (硫酸乙酰肝素酶)(肝素酶III實際上是一種硫酸乙酰肝素酶，測定時采用的底物不是肝素，而是硫酸乙酰肝素)活性測定在Iml石英比色皿中加入在30°C 預熱過的0. 5ml硫酸乙酰肝素濃度為lmg/ml的Tris-HCl (50mM，含CaCl2IOmM, pH7. 0)緩沖液，移取5-20 u I酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據摩爾消光系數計算單位時間產生的雙鍵的摩爾數，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)。對照組的試驗在上述步驟進行實驗時，設立獨立的對照組，在步驟b時添加不含氯化鈣和/或海藻糖的Tris-HCl緩沖液，其余處理和測定都相同。
經測定，本發明實施例中，肝素酶I的活性回復率為73. 9% (對照為33.8%)，肝素酶II的活性回復率為98. 8% (對照為38. 3%)，肝素酶III的活性回復率為77. 4% (對照為47. 2% )。其中尤其顯著的是對肝素酶II的保護，經過多次實驗驗證活性回復率都接近 100%。總的來說，與已報道方法相比，對肝素酶II、III的凍干保護效果均優于報道的牛白蛋白和半乳糖。對肝素酶I的凍干保護效果略低于報道的牛白蛋白，而高于半乳糖。但是牛白蛋白是個分子量接近肝素酶的蛋白質，其大量加入對于監測酶蛋白的存在有不利影響，而CaCl2和海藻糖都是小分子，而且非蛋白類，不影響酶蛋白的監測。
權利要求
1.一種肝素酶I和/或II的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、制備肝素酶I和/或II溶液；步驟2、制備保護劑溶液制備海藻糖溶液以及任選的氯化鈣溶液；步驟3、將步驟2中得到的保護劑溶液和步驟I中得到的肝素酶I、II溶液混合；步驟4、將混合液凍干。
2.一種肝素酶III的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、制備肝素酶III溶液；步驟2、制備保護劑溶液制備海藻糖溶液，；步驟3、將步驟2中獲得的保護劑和步驟I中獲得的肝素酶III的溶液的混合；步驟4、將混合液凍干。
3.根據權利要求I或2的凍干保存方法，其中，步驟I所述的酶溶液中，Tris-HCl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈣緩沖液等作為溶解上述肝素酶的溶劑。
4.根據權利要求I或2的凍干保存方法，其中，步驟2所述的保護劑溶液中，Tris-HCl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈣緩沖液作為溶解上述保護劑的溶劑。
5.根據權利要求I的凍干保存方法，其中，步驟2所述的凍干保護劑的組成為氯化鈣0-20mM，海藻糖5-10% (w/v)。
6.根據權利要求I的凍干保存方法，其中，步驟3所述的凍干保護劑，用于肝素酶I的組成為氯化鈣20mM，海藻糖5% (w/v)。
7.根據權利要求I的凍干保存方法，其中，步驟3所述的凍干保護劑，用于肝素酶II的組成為氯化鈣10mM，海藻糖10% (w/v)。
8.根據權利要求2的凍干保存方法，其中，步驟3所述的保護劑為海藻糖10% (w/v)。
9.根據權利要求I的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、肝素酶I和/或II溶液的制備取制備的肝素酶I和/或II在100倍體積的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. O)中透析過夜，測定活性后，調整濃度至酶活力2-5IU/ml，分別裝入I. 5ml EP管中；步驟2、制備保護劑溶液預先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. O)以及任選的含IOOmM 氯化鈣的IOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ7· O)；步驟3、混合保護劑溶液和肝素酶I、II溶液將適當量的上述氯化鈣溶液和海藻糖溶液分別加入到肝素酶溶液中，定容到IOOul ； 振蕩搖勻，使氯化鈣含量達到0-20mM，海藻糖含量達到5-10% (w/v)；步驟4、混合液凍干將加有保護劑的肝素酶在_70°C冷凍結冰，然后置于冷凍干燥器凍干腔內，抽真空過夜干燥。
10.根據權利要求2的凍干保存方法，包括下述步驟步驟I、制備肝素酶III溶液取制備的肝素酶III在100倍體積的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH7. O)中透析過夜，測定活性后，調整濃度至酶活力2-5IU/ml，裝入I. 5ml EP管中；步驟2、制備保護劑溶液預先配制含50% (m/v)海藻糖的IOmM Tris-HCl緩沖液(ρΗ7· O)；步驟3、混合保護劑溶液和肝素酶III溶液將適當量的上述海藻糖溶液加入到肝素酶溶液中，定容到IOOul ;振蕩搖勻，使海藻糖含量達到5-10% (w/v)；步驟4、混合液凍干將加有保護劑的肝素酶在_70°C冷凍結冰，然后置于冷凍干燥器凍干腔內，抽真空過夜干燥。
全文摘要
本發明涉及一種肝素酶I、II、III的凍干保存方法，尤其涉及一種由任選的氯化鈣和海藻糖組成的保護劑，用于凍干過程中肝素酶I、II、III的活性保護。在保護劑作用下，維持了較高的活性。這樣制得的酶凍干粉便于儲存、運輸、使用，提高了應用價值。
文檔編號C12N9/96GK102586217SQ20121004675
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優先權日2011年12月16日
發明者史紹鵬, 李鋰, 馬小來 申請人:深圳市海普瑞藥業股份有限公司