專利名稱：肝素酶i的固定化方法
技術領域：
本發明涉及一種肝素酶I的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖為固定化材料對肝素酶I進行固定化的方法，實現肝素酶I的高固定化效率，高穩定性和可重復利用性。
背景技術：
肝素酶是指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，最初是從肝素黃桿菌中發現并分離出來的，其后，又發現在一些微生物和動物組織中也有肝素酶存在。肝素酶具有清除血液中殘存肝素、防止凝血等功能，同時對生產低分子肝素、研究肝素的結構有重要的作用。然而游離的肝素酶容易失活，尤其是肝素酶I溶液在保存96h后活性只有原來的23%，此外，游離的肝素酶在發生反應時需要將其加入底物中，反應以后酶溶液、底物和產物混合在一起不容易分離，導致肝素酶無法重復使用，酶的利用效率低下，這為肝素酶的應用帶來很多不便，因此，需要尋找一種既能提高肝素酶的利用效率，又能延長酶的保存時間的方法。 與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控等一系列優點，因此，對肝素酶I的固定化是一種提高使用效果的理想選擇。目前對肝素酶 I 進行固定化的研究較少，Howard Bernstein 等[Bernstein, H. , (1987), AppI.Biochem. Biotech. 16, 129-143]以 CNBr-activated Sepharose 4B 為固定化材料，對肝素酶I進行了共價交聯法的固定化，實現了肝素酶的固定，但是該方法的固定化效率低，我們采用相同的材料和方法得到的結果只能達到每毫升材料固定IIU的肝素酶I，而且以CNBr-activated Sepharose 4B為固定化材料成本較高。經過長期研究，本發明的發明人發現了一種高效并且低成本的肝素酶I的固定化方法。籍此，本發明給出了一種以殼聚糖微球為材料對肝素酶I固定化的方法，固定化效率較其他方法有顯著提高，且與CNBr-activated Sepharose 4B等材料相比,殼聚糖更加廉價，成本更低，同時該方法也成功實現了肝素酶I與底物和產物的分離，固定化以后的酶貯存穩定性更強，應用潛力更大。

發明內容
本發明提供了一種用殼聚糖微球固定肝素酶I的方法，包括下述步驟
(1)肝素酶I溶液的制備選擇Tris-HCl緩沖液(pH7.0，含CaCl2)作為肝素酶I的溶齊IJ，將肝素酶I溶解在該緩沖液中，制得肝素酶I溶液；
(2)肝素酶I與殼聚糖微球的交聯將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液(pH7. 0，含IOmM CaCl2)充分溶脹，再取步驟(I)獲得的肝素酶I溶液，將其加入該殼聚糖微球中，進行交聯；
(3)用乙酸-乙酸鈉和Tris-HCl兩種緩沖液分別洗滌上述交聯后的殼聚糖微球至洗脫液無酶活性；(4)利用還原劑對步驟(3)中獲得的固定了肝素酶I的殼聚糖微球進行處理，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶I。在上述實施方案中，優選步驟(I)中用于溶解肝素酶I的溶劑Tris-HCl的濃度為IO-IOOmM, CaCl2 濃度為 10_50mM，最優選 50mM Tris-HCl (pH 7.0，含 IOmM CaCl2)；
在上述實施方案中，優選步驟(I)中肝素酶I在溶液中的濃度為0. l-100IU/ml，更優選為 1-10 IU/ml，最優選為 2-5 IU/ml。在上述實施方案中，步驟(2)中所述殼聚糖微球可以通過現有技術中已知的制備方法進行制備，例如，可以采用反相懸浮法進行制備，其中使用的交聯劑可以由本領域技術人員適當選擇，例如應用最為廣泛的交聯劑為戊二醛。所述溶脹時間可以根據溶脹程度由本領域技術人員進行控制，例如，溶脹20分鐘。在上述實施方案中，優選步驟(2)中使用的殼聚糖微球與肝素酶I溶液的體積比為 1/10-10/1，更優選 1/5-5/1，最優選 1/2-2/10在上述實施方案中，優選在步驟(2)中，交聯溫度為4-10°C，交聯時間為8_24h，更 優選的交聯溫度為8-10°C，交聯時間為12-20h。在上述實施方案中，優選步驟(3)中使用的緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH
6.0-8. 0)，更優選為 50-150mM 乙酸-乙酸鈉(pH 6. 5-8. 0,含 50_200mM NaCl)緩沖液，最優選為IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，含IOOmM NaCl)緩沖液。在上述實施方案中，優選步驟(3)中使用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液，更優選為50mM Tris-HCl (pH 6. 5-8. 0,含 10-1 OOmM CaCl2, 50-200mM NaCl)緩沖液，最優選為 50mMTris-HCl (pH 7.5，含 5OmM CaCl2, IOOmM NaCl)緩沖液。在上述實施方案中，在步驟(4)的還原劑處理步驟中，是對殼聚糖上的氨基與戊二醛上的醛基共價交聯后產生的不穩定C=N雙鍵進行還原，該還原步驟中可以使用任何已知的可以用于還原該雙鍵的還原劑，比如硼氫化物、氫化鋁鋰、雷尼鎳等，優選硼氫化物，比如堿金屬硼氫化物，例如硼氫化鈉、硼氫化鉀等。在上述實施方案中，優選步驟(4)中使用的NaBH4濃度為l-10mg/ml，反應0. 5-10h ;最優選擇濃度為l_5mg/ml的NaBH4,反應l_3h。在上述實施方案中，優選步驟(4)中使用Tris-HCl緩沖液沖洗除去剩余的還原劑，更優選該緩沖液為50mM Tris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2X在上述實施方案中，在進行步驟(4 )之后，為了能夠對該方法進行評價，獲得固定化酶活與上樣的游離酶活相比能夠得出整個固定化過程的效率，以及對固定化酶進行定量，可以在進行還原劑處理步驟之后，測固定化酶活。在上述實施方案中，在獲得固定化的肝素酶I之后，保存條件為保存在Tris-HCl緩沖體系中，PH 6. 5-8. 0，添加金屬鹽CaCl2和NaCl，保存溫度為0_25°C，最優條件為保存在 50mM Tris-HCl (pH 7.5，含50禮 CaCl2, IOOmM NaCl)，溫度為 4_10°C環境中。在使用時，該固定在載體上的酶可以和底物直接反應，反應完后經分離，固定在載體上的酶可以再次使用。固定化肝素酶可以應用于血液中肝素的清除，用于低分子肝素的生產制備，用于肝素和低分子肝素樣品的部分或完全降解。在上述實施方案中，優選步驟(2)中的反相懸浮法為
取市售殼聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將分散劑加入油相中，然后將酸性殼聚糖溶膠加入油相中，乳化之后，加入戊二醛進行交聯，交聯完畢后加入等體積的NaOH和無水乙醇的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球。在上述實施方案中，用于溶解殼聚糖的溶劑為2%的乙酸溶液，殼聚糖的質量分數為2%。優選分散劑為Span 80，優選油相為液體石蠟，優選轉速為500-800rpm;優選的交聯劑為25%的戊二醛，優選的交聯時間為l_2h，優選的2. 5M NaOH與無水乙醇的體積比為1/1。在上述實施方案中，優選使用的固定化酶測定方法為天青A法[Linhardt, R. J.
,(1984), Appl. Biochem. Biotech. 9, 41-55]和 232nm法[Bernstein, H. , (1987),Appl. Biochem. Biotech. 16, 129-143]。在最優選的實施方案中，本發明的肝素酶I的固定化方法包括下述步驟
(la)、殼聚糖微球的制備
取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span 80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入戊二醛作為交聯劑，交聯溫度為40°C，交聯完畢后加入2. 5M NaOH和無水乙醇(體積比1/1)的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球；
(1)配制緩沖液50mMTris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2),將其作為肝素酶I的溶劑，制得肝素酶I溶液，調整濃度至酶活力2-5IU/ml ；
(2)取步驟(I)獲得的肝素酶I溶液，將其加入用50mMTris-HCl (pH 7.0，含IOmMCaCl2)充分溶脹過的步驟(Ia)獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，4-10°C交聯 12-20h ；
(3)配制IOOmM 乙酸-乙酸鈉(pH 7.5，含 IOOmM NaCl)和 50mM Tris-HCl (pH 7.5，含50mM CaCl2, IOOmM NaCl)緩沖液，先后對交聯后的殼聚糖微球進行洗滌，緩沖液IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7.5，含IOOmM NaCl)洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7.5，含5OmM CaCl2, IOOmM NaCl)洗滌，收集洗脫液測酶活，直至洗脫
液中無游離酶；
(4)在固定化酶中加入還原劑，反應后除去殘余還原劑在固定了肝素酶I的殼聚糖微球中加入NaBH4l-5mg/ml，反應l_3h進行還原，反應完畢后，以50mM Tris-HCl (pH 7. 0,含IOmM CaCl2)為緩沖液，對殼聚糖微球進行洗滌，所用緩沖液體積是殼聚糖微球體積的3_5倍。本發明的有益效果
通過以上所述的發明內容，本發明實現了肝素酶I的高固定化效率，高穩定性和可重復利用性。該方法可對肝素酶I達到顯著的固定化效果，每毫升的殼聚糖微球可以固定化4. 228 IU的肝素酶I，交聯效率可達到94. 4%，在特定的保存條件中可以使固定化的肝素酶在保存96h后仍保持100%的活性(對照組游離酶為23%)。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例
所用肝素酶為從肝素黃桿菌發酵培養后的菌體中分離純化得到的，酶制備過程見發明專利申請號200910039360. I “一種肝素黃桿菌肝素酶I的制備方法”中的實施例。a、取Ig市售的純度為99%的殼聚糖粉末溶于50ml 2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將0.6g市售化學純的Span 80 (國藥集團化學試劑有限公司，化學純)加入IOOml液體石蠟中，以SOOrpm的轉速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入5ml質量分數為25%的戊二醛作為交聯劑，交聯溫度為40°C，Ih后加入IOOml的等體積的2. 5M NaOH和無水乙醇的混合液,攪拌后IOmin后靜置,棄去油層和水層,用超純水沖洗5次，棄去水層即得殼聚糖微球。b、選擇50mM Tris-HCl (pH 7. 0，含IOmM CaCl2)緩沖液作為肝素酶I的溶劑，制得用天青A法測得酶活為104. 39 U/ml，用232nm法測定酶活為4. 48 IU/ml的肝素酶I溶液，取Iml該肝素酶液加入裝有Iml殼聚糖微球的小柱中，搖勻，10°C冷庫中交聯15h，交聯后的上清液，用天青A法測得酶活為3. 73 U/ml，用232nm法測得酶活為0. 16 IU/ml。C、用2ml的IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7. 5，含IOOmM NaCl)緩沖液洗滌上述交聯肝 素酶后的殼聚糖微球，再用約 IOml 的 50mM Tris-HClCpH 7. 5，含 5OmM CaCl2, IOOmM NaCl)緩沖液洗滌上述交聯后的殼聚糖微球，至洗脫液檢測無酶活為止。d、在上述固定了肝素酶I的殼聚糖微球中加入Iml的lmg/ml的硼氫化物陰離子的堿金屬鹽NaBH4，反應Ih，用IOml的5OmM Tris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2)緩沖液洗滌，以除去殘余的NaBH4，得到固定化酶lml。用天青A法測得固定化酶活性為98. 52 U/ml,換算為肝素酶國際酶活單位(即232nm法測定的酶活值)為4. 228 IU/ml。肝素酶I的固定化效率為94. 4%，每Iml殼聚糖微球可固定4. 228 IU/ml的肝素酶I。e、將上述固定化酶置于 2ml 的 50mM Tris-HCl (pH 7.5，含 5OmM CaCl2, IOOmMNaCl)，溫度為4-10°C的環境中保存。在保存96h后固定化酶的活力經測定為保存前的100. 07%，而作為對照實驗的游離酶的活性只有保存前的23. 02%。在實施例中，測定酶活力的具體方法如下
I) 232nm法測酶活在5ml石英比色皿中加入在30°C預熱過的2. 5ml肝素濃度為Img/ml的50mM Tris-HCl (pH 7. 0，含IOmM CaCl2)緩沖液，移取20W酶液，搖勻后在232nm測定吸光值，讀取每分鐘的變化量。根據摩爾消光系數計算單位時間產生的雙鍵的摩爾數，并由此計算酶液的單位活性(IU/ml)，該方法測得的酶活為肝素酶的國際酶活單位。2)天青A法測酶活取固定化酶加入一定濃度的肝素底物，45°C水浴中反應5min,取樣,測定剩余肝素的濃度,測定方法為將未知濃度的肝素底物用50mM Tris-HCl(pH 7. 0，含IOmM CaCl2)緩沖液稀釋一定倍數，在5ml玻璃比色皿中加入2. 5ml的濃度為20mg/L的天青A溶液，再加入25W稀釋后的肝素溶液，搖勻后測定620nm處的吸光值，根據天青A法測定肝素濃度的標準曲線求得酶解后剩余的肝素濃度，以每小時降解Img肝素所需的酶量為一個酶活單位，由此計算固定化酶的單位活性(U/ml)。232nm法是測定肝素酶活性的最通用方法，可用于游離肝素酶活性的測定，但用于固定化酶活性測定時微球帶來很大干擾而難以使用；天青A法可用于游離酶和固定化肝素酶活性的測定。本發明中通過對相同濃度的游離肝素酶的天青A法和232nm法分別測定，得到兩種測定方法的換算關系，天青A法測得的酶活數值是232nm法測定數值的23. 3倍，以此對固定化的肝素酶酶活進行國際單位活性換算。
權利要求
1.一種肝素酶I的固定化方法，包括下述步驟 (1)肝素酶I溶液的制備選擇Tris-HCl緩沖液(pH7.O，含CaCl2)作為肝素酶I的溶齊IJ，將肝素酶I溶解在該緩沖液中，制得肝素酶I溶液； (2)肝素酶I與殼聚糖微球的交聯將殼聚糖微球用Tris-HCl緩沖液(pH7. O，含IOmM CaCl2)充分溶脹，再取步驟(I)獲得的肝素酶I溶液，將其加入該殼聚糖微球中，進行交聯； (3)用乙酸-乙酸鈉(pH6. 5-8.0，含 NaCl)和 Tris-HCl (pH 6. 5-8. 0,含 CaCl2 和NaCl)兩種緩沖液分別洗滌上述交聯后的殼聚糖微球，至洗脫液無酶活性； (4)利用還原劑處理步驟(3)中獲得的固定了肝素酶I的殼聚糖，隨后，如果需要，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶I。
2.根據權利要求I的固定化方法，其特征在于，步驟(I)中用于溶解肝素酶I的溶劑Tris-HCl 的濃度為 IO-IOOmM, CaCl2 濃度為 10_50mM。
3.根據權利要求2的固定化方法，其特征在于，步驟(I)中使用的Tris-HCl溶劑為50mM Tris-HCl (pH 7.0，含 IOmM CaCl2X
4.根據權利要求I 3任一項的固定化方法，其特征在于，步驟(2)中使用的殼聚糖微球與肝素酶I溶液的體積比為1/10-10/1，更優選1/5-5/1，最優選1/2-2/1。
5.根據權利要求I的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中使用的乙酸-乙酸鈉緩沖液為 50-150mM 乙酸-乙酸鈉(pH 6. 5-8. 0，含 50_200mM NaCl)緩沖液。
6.根據權利要求I的固定化方法，其特征在于，步驟(3)中使用的Tris-HCl緩沖液為50mM Tris-HCl (pH 6. 5-8. 0,含 10-1 OOmM CaCl2, 50-200mM NaCl)緩沖液。
7.根據權利要求I的固定化方法，其特征在于，步驟(4)中使用的還原劑為堿金屬硼氫化物。
8.根據權利要求I的固定化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 (la)、殼聚糖微球的制備 取殼聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性殼聚糖溶膠，將Span 80加入液體石蠟中，高速攪拌混合，將酸性殼聚糖溶膠逐滴加入液體石蠟中，乳化Ih后，加入戊二醛作為交聯劑，交聯溫度為40°C，交聯完畢后加入2. 5M NaOH和無水乙醇(體積比1/1)的混合液，攪拌后靜置，棄去油層和水層，并用超純水反復洗滌，即得殼聚糖微球； (1)配制緩沖液50mMTris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2),將其作為肝素酶I的溶劑，制得肝素酶I溶液，調整濃度至酶活力2-5IU/ml ； (2)取步驟(I)獲得的肝素酶I溶液，將其加入用50mMTris-HCl (pH 7.0，含IOmMCaCl2)充分溶脹過的步驟(Ia)獲得的殼聚糖微球中，殼聚糖與肝素酶的體積比為1/2-2/1，4-10°C交聯 12-20h ； (3)配制IOOmM 乙酸-乙酸鈉(pH 7.5，含 IOOmM NaCl)和 50mM Tris-HCl (pH 7.5，含50mM CaCl2, IOOmM NaCl)緩沖液，先后對交聯后的殼聚糖微球進行洗滌，緩沖液IOOmM乙酸-乙酸鈉(pH 7.5，含IOOmM NaCl)洗脫體積為殼聚糖微球體積的兩倍，然后用緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7.5，含5OmM CaCl2, IOOmM NaCl)洗滌，收集洗脫液測酶活，直至洗脫液中無游離酶； (4)在固定了肝素酶I的殼聚糖微球中加入NaBH4l-5mg/ml，反應l_3h，反應完畢后，以50mM Tris-HCl (pH 7.0，含IOmM CaCl2)為緩沖液，對殼聚糖微球進行洗滌，所用緩沖液體積是殼聚糖微球體積的3-5倍，除去殘余的還原劑，由此得到固定在殼聚糖微球上的肝素酶I。
全文摘要
本發明涉及一種肝素酶I的固定化方法，尤其涉及一種以殼聚糖微球為固定化材料，對肝素酶I進行固定化的方法。肝素酶I固定化以后具有可回收，可重復利用，酶與底物和產物易分離，穩定性增強等優越性。
文檔編號C12N11/10GK102796723SQ201210332940
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者白佳珂, 史紹鵬, 馬小來, 李鋰 申請人:深圳市海普瑞藥業股份有限公司