專利名稱：提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種提高藥物/基因靶向性和轉染效率的多肽載體及用途。
背景技術：
近年來，惡性腫瘤已經成為最常見的發病和死亡原因之一，全世界每年新增病例 1000多萬，最新的世界衛生組織報告稱其中20%發生在中國。傳統的抗癌化療藥物缺乏靶向性，在殺死癌細胞的同時也導致正常細胞死亡，毒副作用大，使患者的生存質量嚴重下降。因此研制高效且具有靶向性的基因/藥物載體在惡性腫瘤的治療中有著至關重要的作用。細胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides, CPPs)是一類具有細胞穿透功能的短肽(少于30個氨基酸)，能夠有效地將蛋白質、多肽、核酸片段等以多種方式導入多種哺乳動物細胞，其轉導效率高且不會造成細胞損傷，是一種良好的基因/藥物載體。其中， MPGp (由M. C. Morris, P. vidal, G. Divita最先公開發表，并以三人名字的首字母命名的多肽)就是一種高效安全的細胞穿膜肽，它由人自身免疫缺陷病毒1型(HIV-I)的gp41蛋白的融合蛋白結構域和猿猴空泡病毒(simian vacuolating virus 40，SV40)大T抗原的核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)區域組成。MPGp含有較多的堿性氨基酸， 可與帶負電荷的DNA或RNA通過靜電作用形成納米級顆粒，并保護其免受核酸酶的降解。 MPGΔNLSp通過將MPGp的NLS區域中一個氨基酸進行突變(序列為GALFLGFLGAAGSTMGAWSQ PKSKRKV)，從而使其攜帶的DNA或RNA在細胞質中大量釋放，因此適合作為siRNA遞送載體。由于MPGAMp為直接穿膜進入細胞而非依賴受體，因此缺乏組織細胞靶向性。提高載體腫瘤靶向性的主要策略是用對腫瘤細胞具有特異性識別的分子對載體進行修飾，使其對腫瘤細胞具有更高的選擇性并借此提高腫瘤細胞對基因/藥物的攝入。研究發現，促黃體生成素釋放激素受體(luteinizing hormone-releasing hormone receptor, LHRHR)在肝癌及多數性激素依賴腫瘤如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等細胞膜上過量表達，明顯高于在相應組織正常細胞膜上的表達，且在正常的肝、腎、脾、心、肺、腦、胸腺和骨骼肌組織的細胞膜上未有可檢測到的表達。促黃體生成素釋放激素(LHRHp)是由10 個氨基酸組成的短肽(序列EHWSYGLRPG)。已有體外細胞實驗證明，LHRHp修飾可明顯提高所載藥物對乳腺癌、卵巢癌細胞的靶向性。鑒于以上討論的問題，期望提供一種針對腫瘤的具有靶向性且高效的載體。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的基因/藥物載體靶向性差及轉染效率低的難題，提供一種提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體。本發明的第二個目的是提供一種提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體的用途。
本發明的技術方案概述如下一種提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體，所述多肽載體具有式 ⑴的結構LHRHP-MPG^lsP (I)所述多肽載體的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 3所示。所述LHRHp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 1所示；所述MPG"NLSp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 2所示。上述多肽載體的用途。與現有技術相比，本發明的優點如下本發明涉及的一種提高藥物/基因的靶向性和轉染效率的多肽載體，其帶有大量的正電荷，具有良好的水溶性，具有很強的針對性激素依賴性腫瘤及肝癌的靶向性，可直接攜帶帶負電荷的核酸或藥物并介導其進入細胞，也可修飾其它基因或藥物載體提高其腫瘤靶向性和轉染效率。為基因/藥物輸送提供了一種新型載體。


圖1.多肽載siRNA復合物粒徑變化情況。圖2.細胞轉染siRNA48小時后進行RT-PCR后瓊脂糖凝膠電泳結果。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1一種提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體，所述多肽載體具有式 ⑴的結構LHRHp-MPG^LSp (I)所述多肽載體的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 3所示。SEQ ID NO. 3N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly -Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-L ys-Val ；所述LHRHp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 1所示；所述MPG"NLSp的氨基酸序列是序列表SEQ ID N0. 2所示。SEQ ID N0. 2N 端-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-Lys-ValSEQ ID N0. 3N 端-Gly-Arg-Leu-Trp (D型)-Tyr-Ser-Trp-His-Glu-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly -Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Ser-Lys-Arg-L ys-Val ；
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實施例2LHRHp-MPGΔNLSp載siRNA納米粒子的制備及穩定性測定將多肽載體(LHRHp-MPGAmsp)和siRNA分別溶于水中制得水溶液，然后分別將兩種水溶液于37°C水浴10分鐘；按LHRHp-MPGAMp中的氨基所帶正電荷與siRNA中的磷酸根所帶的負電荷的摩爾比分別為20 1、15 1和10 1將兩種溶液混勻并漩渦震蕩50 秒，即得LHRHp-MPGAasp載siRNA納米粒子。圖1為pH = 7. 0時不同N/P的LHRH-MPGΔasP載siRNA形成的納米復合物的粒徑檢測，其中代表按LHRHp-MPG"asP中氨基所帶的正電荷與siRNA中磷酸根所帶的負電荷的摩爾比為20 1混合后形成的納米復合物；代表按LHRHp-MPGAmp中氨基所帶的正電荷與siRNA中磷酸根所帶的負電荷的摩爾比為15 1混合后形成的納米復合物；j代表按LHRHp-MPGgSp中氨基所帶的正電荷與siRNA中磷酸根所帶的負電荷的摩爾比為10 1混合后形成的納米復合物。實驗表明LHRHp-MPGAMp中的氨基所帶正電荷與siRNA中的磷酸根所帶的負電荷的摩爾比可以在2 1 20 1中選擇；震蕩時間可以在40 60秒中選擇，得到的LHRHp-MPG"msP載siRNA納米粒子，其平均粒徑約為80 llOnm。實施例3LHRHp-MPG"NLSp載siRNA納米粒子的細胞轉染實驗按照實施例2的LHRHp-MPGAasp載siRNA納米粒子的制備方法，制備 LHRHp-MPG"nlsp載針對人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的SiRNA的納米粒子；以上述siRNA含量為30nmol/L、50nmol/L、100nmol/L或200nmol/L的納米粒子分別轉染人肝癌細胞HepG2 和人正常肝細胞L02，陰性對照為單純的200nmol/L的針對人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的 siRNA，空白對照中只加入培養基而不加入任何納米粒子或多肽或siRNA，陽性對照為脂質體(Iipo)載濃度為200nmol/L針對人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因siRNA。轉染48小時后提 ^(Mft^fflIfiW^RNAii^fRT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)。結果如圖2所示，圖2A為LHRHp-MPGAasp載針對人甘油醛_3_磷酸脫氫酶基因的 siRNA納米粒子轉染人正常肝細胞48小時后，進行RT-PCR的電泳結果圖，其中1為陽性對照組；2為含siRNA 200nmol/L的納米粒子轉染組；3為含siRNA IOOnmol/L的納米粒子轉染組；4為含siRNA 50nmol/L的納米粒子轉染組；5為含siRNA 30nmol/L的納米粒子轉染組；6陰性對照組；7為空白對照組。圖2B為LHRHp-MPGAWp載針對人甘油醛_3_磷酸脫氫酶基因的siRNA納米粒子轉染人肝癌細胞48小時后，進行RT-PCR的電泳結果圖，其中8為陽性對照組；9為含siRNA 200nmol/L的納米粒子轉染組；10為含siRNA IOOnmol/L的納米粒子轉染組；11為含siRNA 50nmol/L的納米粒子轉染組；12為含siRNA 30nmol/L的納米粒子轉染組；13陰性對照組； 14為空白對照組。用天能圖像處理軟件測定圖2中各個條帶的凈光值，即亮度，反應該條帶經 RT-PCR后的基因表達量的多少。將上述各實驗組的凈光值與空白對照的凈光值分別進行除法計算得到百分數值(表1所示)，即得到該實驗組相對于空白組的基因表達的多少，可反映轉染進入細胞的siRNA數量進入細胞的siRNA越多，相應基因沉默的數量越多，表達的量越少，該比值越低。表 權利要求
1.一種提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體，其特征是所述多肽載體具有式⑴的結構LHRHp-MPG^LSp (I)所述多肽載體的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 3所示。
2.根據權利要求1所述的多肽載體，其特征是所述LHRHp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 1所示；所述MPG"NLSp的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO. 2所示。
3.權利要求1或2所述多肽載體的用途。
全文摘要
本發明公開了一種提高藥物/基因腫瘤靶向性和轉染效率的多肽載體，所述多肽載體具有式(I)的結構LHRHp-MPGΔNLSp(I)所述多肽載體的氨基酸序列是序列表SEQ ID NO.3所示。本發明的多肽載體，其帶有大量的正電荷，具有良好的水溶性，具有很強的針對性激素依賴性腫瘤及肝癌的靶向性，可直接攜帶帶負電荷的核酸或藥物并介導其進入細胞，也可修飾其它基因或藥物載體提高其腫瘤靶向性和轉染效率。為基因/藥物輸送提供了一種新型載體。
文檔編號C12N15/87GK102558363SQ20121004718
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者冷希崗, 劉蘭霞, 宋麗萍, 張海玲, 朱敦皖, 朱琳, 董霞 申請人:中國醫學科學院生物醫學工程研究所