專利名稱：提供疾患特異性結合分子和靶的方法
技術領域：
本發明涉及識別蛋白的疾患相關表位(包括新表位)的新的特異性結合分子， 特別是人抗體及其片段、衍生物和變體，所述蛋白來自天然的內源蛋白，并且在患者體內以變體形式和/或脫離其正常生理環境普遍存在。另外，本發明涉及包含此類結合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和篩選治療各種疾病、特別是神經疾病(諸如阿爾茨海默病、淀粉樣蛋白病和￠-淀粉樣蛋白病變)的新的結合分子(可以是或可以不是抗體)、靶和藥物的方法。
背景技術：
成功產生單克隆抗體依賴于抗原刺激的B細胞與鼠骨髓瘤細胞系的有效和選擇性融合，然后選擇產生雜交體的穩定的抗體，最初描述于K 0 hler和Milstein，Nature 256 (1975)，495-497。然而，鑒于其非人來源，基于鼠的抗體在人中的治療效用受限于人抗鼠抗體(HAMA)應答。通過遺傳工程可獲得用于制備人或類人單克隆抗體的方法。然而，迄今可用的方法具有以下缺點它們不適合用來產生具有在生理的人類免疫應答過程中產生的抗體的特征的抗體。此外，由于在具有正常生理功能的情況下與其他蛋白和/或靶蛋白的交叉反應性，此類抗體可能不夠特異。例加，在阿爾茨海默病或帕金森病中，認為還以高親和力與淀粉樣前體蛋白(APP )或a突觸核蛋白的生理衍生物交叉反應的抗體表現出與生理靶結構的正常功能相關的副作用。在這方面，不希望的自身免疫病將完全被誘導一一種在采用生理上也存在變體形式的蛋白結構的主動免疫實驗的方案設計中幾乎不可估算的危險。與靶結構無關的副作用是例如過敏反應，其被預期為系統性施用外源蛋白的不希望的和可怕的副作用。根據近來的發現，在最初來自非人生物(通常來自小鼠)的所謂人源化抗體中也能發生這種情況。另一方面，病理相關抗原的主動免疫具有相當大的患者發展也識別此類蛋白的生理變體的抗體和T細胞應答的危險，并且因此導致危險的和不可控制的自身免疫應答。因此，需要提供特異于疾病涉及的靶并被人體耐受的物質。

發明內容
發明概述
本發明的一個目的是一種用于鑒定、驗證和產生診斷上和治療上有用的結合分子，特別是針對內源蛋白的病理變體的抗體的方法。更具體地，本發明涉及分離疾患相關蛋白特異性結合分子的方法，其包括(a)使獲自無癥狀，或臨床上異常穩定，但患有疾病或處于發展疾病危險的患者的樣品經受具有預定病理特征的病理改變的細胞或組織的試樣；和
(b)鑒定并任選地分離與所述試樣結合，但不與可來自健康對象的沒有此類病理特征的對應細胞或組織結合的結合分子。已知的事實是，在自身免疫病中，抗體針對自體細胞和由所述細胞表達的蛋白或諸如糖脂的其他化合物，同時避開已知的耐受機制。同樣已知的事實是，在內源贅生性發展中，贅生性細胞的細胞和體液免疫可發展，并且因此可影響針對贅生性組織變性的內源免
疫保護機制。本發明利用抗體也可針對內源蛋白的病理生理相關變體，特別是針對新表位的驚人發現，所述新表位是由于病理改變的轉錄、翻譯、或轉錄后或翻譯后修飾、或蛋白酶解加工、或聚集而形成的。此類抗體針對由于其偏離正常生理的新結構通過發展病理效應而變得與病理生理相關的內源蛋白。然而，由于免疫耐受，在此類病理變體中與對新表位的對應免疫應答有關的抗體未正常表現出針對生理功能性蛋白的任何交叉反應，這與自身免疫病中的情況相反。這是因為潛在交叉反應性抗體的形成被已知的耐受機制特異地抑制， 而對病理新表位的免疫應答的發展可逃避耐受。因此，本發明涉及通過與可識別病理結構的相互作用而從臨床上預選的人類對象中鑒定診斷上、治療上和預防上有活性的結合分子，特別是抗體和抗體片段的新方法。因此，本發明涉及能識別疾患相關蛋白的表位(包括新表位)的抗體或抗原結合片段和相似的抗原結合分子，所述疾患相關蛋白來自天然的內源蛋白，并且在患者體內以變體形式(例如作為病理蛋白)和/或脫離其正常生理環境普遍存在。此外，本發明涉及包含所述抗體的組合物，以及使用該組合物的免疫治療和免疫診斷方法。此外，在抗體鑒定中，根據本發明的方法可無需事先假設其分子靶結構的身份，而只是通過其與病理相關結構的結合來執行。除了因此可能鑒定迄今未知的、特定疾患的分子靶結構外，專門針對病理結構的抗體的進一步優勢基于它們的藥物動力學有效性不受與非疾患組織結合以使抗體的濃度和吸收效應被緩沖因此妨礙治療有效濃度的確定的方式負面影響的事實。此外，本發明的抗體和結合分子優選特征在于它們分別在體內與疾患相關蛋白的變體形式或與細胞或細胞膜反應，并且在具有病理特征的疾患組織的切片上，但不與或顯著更少程度地與同族蛋白的生理變體反應；還參見，例如，實施例2。由于本發明允許在疾患細胞和組織中鑒定和分離分子靶結構，進一步的實施方案分別涉及由本發明的新表位特異抗體結合的抗原和病理蛋白(即疾患相關蛋白)。特別優選的實施方案是證明特征為下文表2和3所述的可變區Vh和/或\ 的任一抗體的免疫結合特征的人抗體或其抗原結合片段。可選地，抗體是人源化、異源、或嵌合人一鼠抗體，后者特別用于動物的診斷方法和研究。包括抗體或其活性片段、或激動劑和同族分子、或可選地(alternately)其拮抗劑的治療性組合物、此類組合物在使用這些組合物預防、診斷或治療疾患中的用途方法也包括在本發明中，其中將有效量的組合物施用于需要此類治療的患者。抗體的抗原結合片段可以是單鏈Fv片段、F(ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2 片段、或任何其他抗原結合片段。在下文特定的實施方案中，抗體或其片段是人IgG同種型抗體。自然地，本發明分別擴展至產生具有下文限定的特殊和獨特特征的抗體的永生化人類B記憶淋巴細胞和B細胞。本發明還涉及編碼本發明的抗體的免疫球蛋白鏈的至少可變區的多核苷酸。 優選地，所述可變區包括下文表2和3所述的Vh和/或\可變區的至少一個互補決定區 (OTR)。⑶R的對應組在下文表4中給出。相應地，本發明還包括包含所述多核苷酸的載體和用其轉化的宿主細胞，以及它們用于產生特異于指示和/或引起疾病(特別是腦疾病，諸如阿爾茨海默病和帕金森病)的新表位的抗體和等效結合分子的用途。抗體、免疫球蛋白鏈、其結合片段和與所述抗體結合的抗原可分別用在藥物組合物和診斷組合物中用于免疫治療和診斷。然而前述組合物在制備藥劑中的用途是優選的。因此，本發明的特定目的是提供用于治療或預防特征為中樞神經系統中蛋白的異常積累和/或沉積并且不干擾相應蛋白的天然功能的神經疾病的方法。該方法包括將有效濃度的抗體或抗體衍生物施用于對象，其中抗體與蛋白的病理形式或蛋白沉積物的結合親和力顯著高于與蛋白的正常生理形式的結合親和力。在優選實施方案中，本發明提供了用于治療或預防或減緩對象中與淀粉樣蛋白P肽的積累和沉積相關疾患的發病的方法，所述疾患諸如阿爾茨海默病、唐氏綜合征、輕度認知損害、腦淀粉樣蛋白血管病、血管性癡呆、多發性梗死性癡呆。該方法包括將有效濃度的抗體或抗體衍生物施用于對象，其中抗體與蛋白的病理形式或蛋白沉積物的結合親和力高于與蛋白的正常生理形式的結合親和力。相似的治療性方法預計用于治療帕金森病、亨廷頓病、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、囊性纖維化、高雪病(Gaucher’s disease)和類似疾病。根據以下的說明書，本發明的其他實施方案將是明顯的。附圖簡述
圖I:針對￠-淀粉樣蛋白的抗體。A:人抗體。B :用針對人￠-淀粉樣蛋白的已知抗體的對照染色。患有阿爾茨海默病的臨床上異常穩定的患者含有針對￠-淀粉樣蛋白斑塊的抗體。用來自臨床上異常穩定的患者的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學染色揭示了與由針對人￠-淀粉樣蛋白的已知抗體確認的淀粉樣蛋白斑塊結合的抗體。圖2 :針對神經原纖維纏結的抗體。A:人抗體。B:用針對人tau的已知抗體的對照染色。健康的人類對象含有針對神經原纖維纏結的抗體。用來自健康對象的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學染色揭示了與由針對人tau的已知抗體確認的神經原纖維纏結結合的抗體。圖3 :針對營養不良性軸突的抗體。A:人抗體。B:用針對人tau的已知抗體的對照染色。健康的人類對象含有針對營養不良性軸突的抗體。用來自健康對象的抗體對獲自患有病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片的免疫組織化學染色揭示了與營養不良性軸突結合的抗體。圖4 :針對0 -淀粉樣蛋白的抗體。該圖顯示從臨床上異常穩定的阿爾茨海默病患者中分離的重組人NI-101.11抗體與腦￠-淀粉樣蛋白斑塊的特異性結合。獲自患有神經病理上確認的阿爾茨海默病的患者的腦切片用指示濃度的重組人抗體染色。50 pM 濃度的抗體與P-淀粉樣蛋白斑塊的結合暗示了高親和力的結合。圖5 :線性的合成N-末端A ^多肽不競爭重組人NI-101. 11抗體與P -淀粉樣蛋白斑塊的結合。代表位置I至16的可達I PM濃度的N-末端A ￠-衍生多肽不能競爭針對腦￠-淀粉樣蛋白的重組抗體(0.5 nM)的結合。圖6 :重組人NI-101. 11抗體識別單體A P中不存在的構象A P表位。A ^ 1-42原纖維而不是線性的合成A ^ 1-42單體可競爭腦切片上NI-101. 11與P -淀粉樣蛋白斑塊的結合。圖7 :蛋白質印跡上重組人NI-101. 11抗體不與線性、單體的合成A @結合。 單體A ^制品通過非變性PAGE分離。印跡蛋白用針對￠-淀粉樣蛋白的人重組抗體和針對N-末端線性A ^序列的對照抗體(6E10)來探測。沒有檢測到NI-101. 11與單體A ^ 的結合。這一觀察暗示該抗體識別構象A ^表位。圖8 :人NI-101. 11抗體結合從合成的A ^ 1-42肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維。以同樣包被密度包被于ELISA板上的合成的A ^原纖維或單體的合成A ^與指示濃度的針對腦￠-淀粉樣蛋白的重組人抗體一起孵育。針對腦￠-淀粉樣蛋白的人抗體與人工淀粉樣蛋白原纖維的結合活性(空心方塊)比單體A ^ (實心方塊)高100多倍。對照抗體22C4優先與單體A ^ (實心圓圈)結合，而與原纖維(空心圓圈)結合得不太好。這暗示NI-101.11識別也存在于從合成的A ^肽制備的人工淀粉樣蛋白原纖維上的構象表位。圖9 :重組人NI-101. 11抗體與細胞全長APP或者存在于培養細胞中的任何其生理衍生物沒有交叉反應性。與結合細胞表面APP的對照抗體(6E10)相反，NI-101. 11 不與存在于細胞表面的全長APP結合。這些數據說明NI-101. 11與生理的細胞全長APP沒有交叉反應性。

圖10A-C:通過大小排阻層析NI-101. 11不與單體A P結合。圖IOA和IOB 顯示NI-101. 11或不相關的對照抗體不與單體FITC-標記的A ^ 1-42結合，而圖IOC顯示識別存在于A P的C-末端的線性表位的抗體22C4的顯著結合。圖11:競爭性ELISA顯示與過量濃度的單體AP肽預孵育后，抗體6E10 (針對A P的N-末端的線性表位的抗體)的結合可被完全阻抑，而與過量濃度的這些單體A ^ 肽制品的預孵育沒有破壞NI-101. 11的結合。圖12 =NI-IOl. 13A和NI-101. 13B與獲自阿爾茨海默病的Tg2676轉基因小鼠模型的腦切片的結合。圖13: ELISA顯示與單體A P相比，NI-101. 13A和NI-101. 13B優先結合人
工淀粉樣蛋白原纖維。圖14A-B:圖14A顯示ELISA中重組NI-101. 12與合成的A3 1_42肽的結合。 圖14B顯示過量的A P 1-42肽競爭NI-101. 12的結合。圖15:在阿爾茨海默病的轉基因小鼠模型中，針對腦淀粉樣蛋白的重組人NI-101. 11抗體穿越血腦屏障,并在體內與腦P -淀粉樣蛋白斑塊結合。圖16A-B :在阿爾茨海默病的轉基因小鼠模型中，重組人NI-101. 11抗體改善了異常認知行為。24個月大的arcAP小鼠每周用3 mg/kg抗體i. p.治療2個月。在治療完成之前和之后進行Y-迷宮行為測試。
圖17:通過外周施用NI-101. 11的淀粉樣蛋白斑塊的血腦屏障穿透和修飾( decoration)。在NI-101. 11治療小鼠中(左圖)，NI-101. 11可穿越血腦屏障，并與￠-淀粉樣蛋白沉積物結合，而在用人對照抗體治療的動物中(右圖)，沒有此類染色可見。在系統性治療兩個月之后，重組人NI-101. 11抗體減少了腦￠-淀粉樣蛋白斑塊的負載。圖18:用NI- 101. 11的被動免疫減少了 arcAP小鼠中P _淀粉樣蛋白的負載。(A，B)硫代黃素S和剛果紅斑塊負載分析揭示了與對照抗體治療的動物相比超過50%的顯著減少(曼-惠特尼U; ThioS:皮層p=0. 02，海馬p=0. 009，和剛果紅分析皮層p=0.009， 海馬p=0. 04)。比例尺200 u m。(C-E)硫代黃素S分析揭示了與對照治療的動物相比， NI-101. 11治療的arcAP小鼠中￠-淀粉樣蛋白負荷(C)、P -淀粉樣蛋白斑塊的數目⑶ 和平均斑塊大小(E)的顯著減少。曼-惠特尼U統計皮層斑塊面積p=0. 02;海馬斑塊面積p=0. 009;皮層斑塊數目p=0. 047 ;海馬斑塊數目p=0. 047 ;皮層斑塊大小p=0. 009;海馬斑塊數目P=O. 009。圖19:減少的P -淀粉樣蛋白負載伴隨著減少的星形膠質細胞增生和小膠質細胞增生。A)抗GFAP染色的定量揭示，當與對照治療的轉基因動物相比時，NI-101. 11治療的arcAP小鼠皮層中反應性星形膠質細胞數目的顯著減少。B) Iba-I染色的定量顯示在 NI-101. 11治療的小鼠皮層和海馬中傾向于減少數目的活化小膠質細胞。比例尺200 iim。圖20:用重組人NI-101. 11抗體治療兩個月后，腦微出血沒有增加。患有已證實的塊狀嗜剛果紅淀粉樣蛋白血管病的24個月大的arcAP小鼠每周用3 mg/kg抗體i.p.治療2個月。arcAP小鼠腦微出血的代表圖片由Perl氏普魯士藍染色顯示(左側)。定量分析說明與其野生型同窩小鼠相比，arcA^轉基因小鼠中顯著增加的微出血( micorhemorrhages)頻率。用NI-101. 11的慢性治療沒有導致微出血(micorhemorrhages) 頻率的增加。比例尺20iim。圖21:重組人NI-101. 11抗體在體外抑制合成的AP原纖維的形成。重組人 NI-101.11抗體對AP原纖維形成的影響通過熒光分析測量與聚集的AP結合的硫代黃素 S來測定。圖22 BV-2小膠質細胞中抗體-介導的劑量依賴性的FITC-A ^ 1-42原纖維的吞噬作用在抑制了清除受體系統后測量。NI-101. 11觸發強有力的劑量依賴性的Fcy受體-介導的AP原纖維的吞噬作用。發明詳述
I.定義
應注意，術語“一個(a) ”或“一個(an)"實體指一個或多個該實體；例如，“一個抗體(an antibody)”理解為代表一個或多個抗體。因此，術語“一個(a)”(或“一個 (an) ”)、“一個或多個”和“至少一個”在本文可互換使用。如本文所用，術語“多肽”預期包括單個“多肽(polyp印tide) ”以及兩個以上“多肽(polyp印tides)”，并且指主要由通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術語“多肽”指兩個或多個氨基酸的任一條或幾條鏈，并且不指特定長度的產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質”、“氨基酸鏈”或用來指兩個或多個氨基酸的一條或幾條鏈的任何其他術語都包括在定義“多肽”內，并且術語“多肽”可代替或與任何這些術語互換使用。
術語“多肽”也意指多肽的表達后修飾產物，包括但不限于已知保護/封閉基團的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、或非天然存在的氨基酸的修飾。多肽可來自天然生物來源或通過重組技術產生，但不是必然地從指定的核酸序列翻譯而來。多肽可以任何方式產生，包括通過化學合成。本發明的多肽的大小可以是約3個或更多、5個或更多、I 0個或更多、20個或更多、25個或更多、50個或更多、75個或更多、100個或更多、200個或更多、500個或更多、 1000個或更多、2000個或更多個氨基酸。多肽可以具有確定的三維結構，盡管它們不必然地具有這樣的結構。具有確定三維結構的多肽被稱為折疊的，而不具有確定三維結構而是可采用多種不同構象的多肽被稱為未折疊的。如本文所用，術語糖蛋白指與通過氨基酸殘基(例如，絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基)的含氧或含氮側鏈與蛋白相連的至少一個碳水化合物部分偶聯的蛋白。“分離”多肽或其片段、變體或衍生物意指不處于其天然環境的多肽。不需要特定水平的純化。例如，分離多肽可從其天然或自然環境脫離。為了本發明的目的，在宿主細胞中表達的重組產生的多肽和蛋白被認為是分離的，通過任何適合的技術而分離、分級分離、或部分或基本純化的天然或重組多肽也被認為是分離的。本發明的多肽還包括前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體及其任何組合。 當指本發明的抗體或抗體多肽時，術語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”包括保留對應的天然結合分子、抗體或多肽的抗原結合特性的至少一些的任何多肽。本發明的多肽片段包括蛋白水解片段和缺失片段，以及在本文其他地方討論的特定抗體片段。本發明的抗體和抗體多肽的變體包括上述片段，還包括由于氨基酸置換、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可以天然存在或者是非天然存在的。非天然存在的變體可使用本領域已知的誘變技術產生。變體多肽可包含保守或非保守的氨基酸置換、缺失或添加。新表位特異性結合分子(例如本發明的抗體和抗體多肽)的衍生物是已被改變以便表現出未發現于天然多肽的其他特點的多肽。實例包括融合蛋白。變體多肽在本文也稱為“多肽類似物”。如本文所用，結合分子或其片段、抗體或抗體多肽的“衍生物”指具有通過功能性側基的反應而化學衍生化的一個或多個殘基的主題多肽。“衍生物”還包括含有20種標準氨基酸的一種或多種天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥脯氨酸可置換脯氨酸； 5-羥賴氨酸可置換賴氨酸；3_甲基組氨酸可置換組氨酸；同型絲氨酸可置換絲氨酸；鳥氨酸可置換賴氨酸。術語“多核苷酸”預期包括單個核酸以及兩個以上的核酸，并且指分離核酸分子或構建體，例如，信使RNA (mRNA)或質粒DNA ( pDNA)。多核苷酸可包含常規的磷酸二酯鍵或非常規的鍵(例如，酰胺鍵，諸如發現于肽核酸(PNA)中)。術語“核酸”指存在于多核苷酸的任一個或多個核酸區段，例如，DNA或RNA片段。“分離”核酸或多核苷酸意指從其天然環境脫離的核酸分子(DNA或RNA)。例如，為了本發明的目的，包含于載體中的編碼抗體的重組多核苷酸被認為是分離的。分離多核苷酸的其他實例包括保持于異源宿主細胞中的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或基本純化的)多核苷酸。分離的RNA分子包括本發明的多核苷酸的體內或體外RNA轉錄物。根據本發明的分離多核苷酸或核酸進一步包括合成產生的此類分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調節元件，諸如啟動子、核糖體結合位點、或轉錄終止子。
如本文所用，“編碼區”是由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸的一部分。盡管“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，其可被認為是編碼區的一部分，但是例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子以及類似序列的任何側翼序列不是編碼區的一部分。本發明的兩個或多個編碼區可存在于單個多核苷酸構建體中(例如，在單個載體上)，或在分開的多核苷酸構建體中(例如，在分開的(不同的)載體上)。此外，任何載體可含有單個編碼區，或可包含兩個或多個編碼區，例如，單個載體可分別編碼免疫球蛋白的重鏈可變區和免疫球蛋白的輕鏈可變區。另外，本發明的載體、多核苷酸、或核酸可編碼與編碼結合分子、抗體、或其片段、變體、或衍生物的核酸融合或不融合的異源編碼區。異源編碼區包括但不限于特定的元件或基序，諸如分泌信號肽或異源功能性結構域。在某些實施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況中，包含編碼多肽的核酸的多核苷酸正常可包括啟動子和/或可操作地與一個或多個編碼區相連的其他轉錄或翻譯控制元件。可操作連接是基因產物(例如，多肽)的編碼區與一個或多個調節序列以使基因產物的表達置于調節序列的影響或控制下的方式相連。如果啟動子功能的誘導引起編碼需要的基因產物的mRNA的轉錄，以及如果兩個DNA片段之間的鍵合性質不干擾表達調節序列指引基因產物表達或不干擾DNA模板被轉錄的能力，那么兩個DNA片段(諸如多肽編碼區和與其結合的啟動子)是“可操作連接”。因此，如果啟動子能影響該核酸的轉錄，那么啟動子區將與編碼多肽的核酸可操作連接。啟動子可以是指引DNA僅在預定細胞中基本轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、阻遏子和轉錄終止信號)可與多核苷酸可操作地連接以指引細胞特異性轉錄。適合的啟動子和其他轉錄控制區公開于本文。多種轉錄控制區對本領域技術人員是已知的。這些轉錄控制區包括但不限于在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如但不限于，來自巨細胞病毒(即時早期啟動子，連同內含子-A)、猿猴病毒40 (早期啟動子)、和反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)的啟動子和增強子區段。其他轉錄控制區包括來自脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱激蛋白、牛生長激素和兔￠-珠蛋白)的轉錄控制區，以及能在真核細胞中控制基因表達的其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子，以及淋巴因子誘導型啟動子(例如， 可由干擾素或白介素誘導的啟動子)。相似地，多種翻譯控制元件對本領域普通技術人員是已知的。這些翻譯控制元件包括但不限于核糖體結合位點、翻譯起始和終止密碼子和來自小RNA病毒的元件(特別是內部核糖體進入位點或IRES，也稱為CITE序列)。在其他實施方案中，本發明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。本發明的多核苷酸和核酸編碼區可與編碼指引由本發明的多核苷酸編碼的多肽的分泌的分泌或信號肽的其他編碼區締合。根據信號假說，哺乳動物細胞分泌的蛋白具有信號肽或分泌前導序列，一旦正在生成的蛋白鏈起始了穿過粗面內質網的輸出，信號肽或分泌前導序列從成熟蛋白上切下。本領域普通技術人員了解，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽的N-末端融合的信號肽，信號肽從完整或“全長”多肽上切下以產生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些實施方案中，使用天然信號肽(例如，免疫球蛋白重鏈或輕鏈的信號肽)，或者保留了指引與其可操作連接的多肽的分泌的能力的那些序列的功能性衍生物。可選地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，可用人組織纖溶酶原激活物(TPA)或小鼠￠-葡糖醛酸酶的前導序列來置換野生型前導序列。除非另外指明，術語“疾病”和“疾患”在本文可互換使用。在本發明上下文使用的“結合分子”主要涉及抗體及其片段，但也可指與新表位結合的其他非抗體分子，包括但不限于激素、受體、配體、主要組織相容性復合體(MHC)分子、諸如熱激蛋白(HSP)的分子伴侶，以及細胞-細胞粘著分子，諸如I丐粘著蛋白、整聯蛋白(intergrin)、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成員。因此，僅為清楚起見，并且不限制本發明的范圍，下述實施方案的大多數是就代表用于治療和診斷劑開發的優選結合分子的抗體和類抗體分子而討論的。術語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文可互換使用。抗體或免疫球蛋白是包含重鏈的至少可變結構域、并且正常包含重鏈和輕鏈的至少可變結構域的抗原結合分子。脊椎動物系統的基本免疫球蛋白結構了解得相對清楚。參見,例如,Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual (抗體實驗指南)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版， 1988)。如下文將更詳細地討論，術語“免疫球蛋白”包含可生化地區別的多種類別的多肽。本領域技術人員將理解，重鏈分為Y、U、a、6或e ( y , u , a , 6 , e )，其中有一些亞類(例如，Yl- Y 4)。鏈的性質確定了抗體的“類別”分別為IgG、IgM、IgA IgG或 IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等，表征得很清楚，并且已知其賦予功能專門化。鑒于本公開內容，這些類別和同種型的每一個的修飾形式對熟練的技術人員來說是容易辨別的，并且相應地在本發明的范圍內。所有的免疫球蛋白類別都清楚地在本發明的范圍內，下述討論一般將針對免疫球蛋白分子的IgG類。關于IgG，標準的免疫球蛋白分子包含兩條相同的分子量大約23，000道爾頓的輕鏈多肽和兩條相同的分子量53，000-70, 000的重鏈多肽。四條鏈一般以“Y”構型由二硫鍵相連，其中輕鏈支持重鏈，在“Y”的口處開始并延續經可變區。輕鏈分為K或入(k, A)0每重鏈類別可與K或入輕鏈結合。一般而言，當免疫球蛋白通過雜交瘤、B細胞或遺傳改造的宿主細胞產生時，輕鏈和重鏈彼此共價鍵合，并且兩條重鏈的“尾”部通過共價二硫鍵合或非共價鍵合彼此鍵合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構型叉末端的N-末端延伸到每條鏈底部的C-末端。輕鏈和重鏈都分成結構和功能同源區。術語“恒定”和“可變”功能地使用。 在這方面，應理解，輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分的可變結構域決定抗原的識別和特異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定結構域賦予重要的生物學特性，諸如分泌、 經胎盤的遷移率、Fe受體結合、補體結合及類似特性。按照慣例，恒定區結構域的編號隨著它們變得與抗體的抗原結合位點或氨基末端更遠而增加。N-末端部分是可變區，而C-末端部分是恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包括重鏈和輕鏈的羧基末端。如上文所示，可變區允許抗體選擇性地識別和特異地結合抗原上的表位。也就是說，抗體的VL結構域和VH結構域、或互補決定區(CDR)的亞型組合形成確定三維抗原結合位點的可變區。這種四級抗體結構形成了存在于Y的每個臂末端的抗原結合位點。 更具體地，該抗原結合位點由每條VH和VL鏈上的三個CDR定義。含有足以特異結合抗原的結構的任何抗體或免疫球蛋白片段在本文可交換表示為“抗原結合片段”或“免疫特異性片段”。在天然存在的抗體中，每個抗原結合結構域中存在的六個“互補決定區”或 “CDR”是特異地定位以便當抗體在水環境中采取其三維構型時形成抗原結合結構域的短的、不相鄰的氨基酸序列。抗原結合結構域中剩余的氨基酸(稱為“構架”區)顯示更低的分子間可變性。構架區主要采取￠-折疊構象，而⑶R形成連接的環，在一些情況中，⑶R形成￠-折疊結構的一部分。因此，構架區的作用是形成提供CDR通過鏈間非共價相互作用以正確取向定位的支架結構。定位的CDR形成的抗原結合結構域定義了與免疫反應性抗原上的表位互補的表面。該互補表面促進抗體與其同族表位的非共價結合。本領域普通技術人員可容易地鑒定任何特定重鏈或輕鏈可變區的分別包含CDR和構架區的氨基酸，因為這些氨基酸已被精確定義(參見，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” (具有免疫學重要性的蛋白序列)Kabat，E.等，美國衛生及公共服務部，(1983);和Chothia 和Lesk, JMol. Biol. ,196:901-917 (1987)，其通過引用整體并入本文)。在本領域使用和/或接受的術語有兩種或多種定義的情況中，本文所用的術語的定義預期包括所有這些含義，除非明確指明為相反的意思。具體實例是使用術語 “互補決定區”(“CDR”)來描述重鏈和輕鏈多肽可變區內發現的不相鄰的抗原組合位點。 這一特定區域已描述于Kabat等,美國衛生及公共服務部,“Sequences of Proteins of Immunological Interest” (具有免疫學重要性的蛋白序列)(1983)和Chothia等,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)，其通過引用并入本文，其中當彼此比較時，定義包括重疊的氨基酸殘基或氨基酸殘基的亞型。然而，指抗體或其變體的CDR的任一定義的應用預期在本文定義和使用的術語的范圍內。由上文引用的每個參考文獻定義的包含CDR的適當氨基酸殘基描述于下文的表I中作為比較。包含特定CDR的確切殘基數將根據CDR的序列和大小而變化。本領域技術人員常規地可根據抗體的可變區氨基酸序列來確定哪些殘基包含特定的 CDR。表I :CDR 定義 權利要求
1.一種分離疾病相關蛋白特異性結合分子的方法，所述方法包括(a)使獲自無癥狀但患有疾病或處于發展疾病的危險的患者、或具有異常穩定的疾病進程的患者的樣品經受具有預定臨床特征的病理上改變的細胞或組織試樣；和(b)鑒定并任選地分離與所述試樣結合、但不與健康對象的對應細胞或組織結合的結合分子。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述樣品包括體液或細胞樣品，最好其中(a)所述體液是腦脊液、血漿或尿液；并且/或者(b)所述樣品包括或來自B細胞或記憶B細胞。
3.如權利要求I或2中所述的方法，其中所述結合分子是抗體。
4.如權利要求I至3中任一項所述的方法，其中所述患者和對象分別為人。
5.如權利要求I至4中任一項所述的方法，其中所述患者已通過有或沒有替代標志物而被確定患有尚未表現的疾病或處于發展疾病的危險，最好其中所述替代標志物選自老年、腦淀粉樣蛋白負載，ApoE基因型、APP基因型、PSl基因型、體液中AP肽的水平、異前列腺素、Tau和磷酸-Tau。
6.如權利要求I至5中任一項所述的方法，其中所述疾病選自神經疾病、自身免疫病和腫瘤，最好其中所述疾病是阿爾茨海默病。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述樣品獲自滿足以下標準的患者(i)年齡為65歲或更大；(ii)具有完全的認知能力和良好的健康；和(iii)沒有癡呆的臨床體征；或(iv)具有異常緩慢的疾患進展速度，盡管存在可能為阿爾茨海默病的確定的臨床診斷。
8.如權利要求I至7任一項所述的方法，其進一步包括以下步驟(i)從已鑒定含有與所述試樣結合但不與健康對象的對應細胞或組織結合的例如抗體的結合分子的樣品中純化B細胞或B記憶細胞；(ii)從所述B細胞或B記憶細胞獲得所述抗體的免疫球蛋白基因譜系；和(iii)使用所述譜系表達所述抗體，最好其中步驟(ii)包括以下步驟(iv)從所述B細胞或記憶B細胞獲得mRNA；(V)從步驟(iv)的mRNA獲得cDNA ;和(vi)使用引物延伸反應從所述cDNA擴增對應于所述抗體的重鏈(HC)和K輕鏈(LC) 的片段。
9.一種結合分子，其可通過權利要求I至8任一項所述的方法獲得，所述結合分子能選擇性地識別疾病相關蛋白的新表位，最好其中所述的結合分子基本不識別以其非疾病相關形式存在的所述蛋白。
10.如權利要求9所述的結合分子，其為抗體或其抗原結合片段，最好其中的抗體為人抗體。
11 如權利要求9或10中所述的結合分子，其中所述疾病為神經疾病，最好其中所述疾病是腦疾病。
12.如權利要求9至11任一項所述的結合分子，其選自單鏈Fv片段(scFv)、F (ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2片段。
13.一種多核苷酸，其編碼權利要求9至12任一項所述的結合分子。
14.一種載體，其包含權利要求13所述的多核苷酸，任選地與編碼所述抗體的其他免疫球蛋白鏈的可變區的權利要求13所述的多核苷酸組合。
15.一種宿主細胞，其包含權利要求13所述的多核苷酸或權利要求14所述的載體。
16.一種用于制備疾病相關蛋白特異性結合分子、抗體或其結合片段或免疫球蛋白鏈的方法，所述方法包括(a)培養權利要求15所述的細胞；和(b)從所述培養物中分離所述結合分子、抗體或其結合片段或免疫球蛋白鏈。
17.一種結合分子、抗體、或其免疫球蛋白鏈或結合片段，其由權利要求13所述的多核苷酸編碼，或者可通過權利要求16所述的方法獲得。
18.如權利要求9至12或17中任一項所述的結合分子、抗體或結合片段(a)其被可檢測地標記，最好其中所述可檢測標記選自酶、放射性同位素、熒光團和重金屬；并且/或者(b)其與藥物相連。
19.一種組合物，其包含權利要求9至12，17或18中任一項所述的結合分子、抗體或結合片段，權利要求13所述的多核苷酸，權利要求14所述的載體或權利要求15所述的細胞，其中(a)組合物為藥物組合物，并且進一步包含藥學可接受的載體，還可以進一步包括用于治療阿爾茨海默病的其他物質，所述其他物質選自小有機分子、抗Abeta抗體及其組合；或者(b)組合物為診斷組合物，并且進一步包含常規用在基于免疫或核酸的診斷方法中的試劑。
全文摘要
提供疾患特異性結合分子和靶的方法，本發明提供了識別疾患相關蛋白新表位的新的特異性結合分子、特別是人抗體及其片段、衍生物和變體，所述疾患相關蛋白來自天然的內源蛋白，但在患者體內以變體形式和／或脫離其正常生理環境普遍存在。另外，描述了包含此類結合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和篩選治療諸如阿爾茨海默病的神經疾病的新的結合分子(可以是或可以不是抗體)和靶的方法。
文檔編號C12N15/13GK102603893SQ201210046808
公開日2012年7月25日 申請日期2008年1月7日 優先權日2007年1月5日
發明者克里斯托夫·愛瑟蘭格, 克里斯托夫·霍克, 凱瑟琳·蒂索, 簡·格林, 羅格·尼奇, 馬倫·科諾布洛赫 申請人:蘇黎世大學