專利名稱：：一種轉基因魚純合子的快速鑒定方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及水產動物遺傳育種
技術領域：
，更具體涉及一種鑒定轉生長激素(growthhormone,GH,以下同)基因魚純合子的方法，還涉及純合子轉基因魚在轉基因魚純系建立和新品種培育中的應用。采用常規PCR和定量PCR(real-timePCR，以下同)相結合的技術，通過比較純合子和半合子轉基因魚中轉植基因整合的相對拷貝數，分析轉植基因為陽性的轉基因魚的基因型，從而快速準確地鑒定出轉基因魚純合子，對于建立轉基因魚純系，加快轉基因魚新品種培育進程具有重要意義。
背景技術：
：從第一批快速生長的轉基因魚誕生迄今，世界范圍內已成功研制了30多種轉基因魚，這些轉基因魚包含了世界水產養殖的許多重要品種，如鯉魚、羅非魚、鲇類及鮭鱒魚類等(HuWeiandZhuZuoyan.IntegrationmechanismsoftransgenesandpopulationfitnessofGHtransgenicfish.ScienceinChinaSerC-LifeSci，2010，53:401-408.)。采用轉基因技術培育具有優良性狀的養殖魚類新品種，已成為水產養殖業可持續發展的主導性技術之一。在轉基因魚群體中獲得具有優良性狀的轉基因魚后，通過轉基因魚自交從而產生純合子轉基因魚，從轉基因魚自交群體中篩選出遺傳性狀穩定的純合子轉基因魚后，就可以以純合子轉基因魚為親本建立轉基因魚家系，從而培育出性狀優良、遺傳穩定的養殖新品種。但是，轉基因魚自交群體由純合子轉基因魚、半合子轉基因魚和同窩非轉基因魚組成，只有純合子轉基因魚的性狀才能在子代中穩定遺傳，而不會出現性狀分離現象。只有純合子轉基因魚才可以作為候選的優良養殖新品種。因此，如何快速、準確地鑒定和篩選出純合子轉基因魚是轉基因魚育種的關鍵之一。采用Dotblot、Southernblot和半定量PCR分析轉植基因整合的拷貝數后，再結合轉基因魚與對照魚的測交結果分析，是篩選純合子轉基因魚的常用方法，如在轉基因羅非魚和轉基因泥鰍中的相關研究(Rahman，Μ.Α.，Mak,R.，Ayad,H.，Smith,Α.，Maclean,N.,1998.Expressionofanovelpiscinegrowthhormonegeneresultsingrowthenhancementintransgenictilapia(Oreochromisniloticus).TransgenicRes7,357-369；Martinez,R.,Arenal,A.,Estrada,Μ.P.,Herrera,F.,Huerta,V.,Vazquez,J.,Sanchez,T.,delaFuente,J.,1999.Mendeliantransmission,transgenedosageandgrowthphenotypeintransgenictilapia(Oreochromishornorum)showingectopicexpressionofhomologousgrowthhormone.Aquaculture173,271-283；Nam,Y.K.,Cho,Y.S.,Cho,H.J.,Kim,D.S.,2002.Acceleratedgrowthperformanceandstablegerm-linetransmissioninandrogeneticallyderivedhomozygoustransgenicmudloach,Misgurnusmizolepis.Aquaculture209,257-270)。但是這些鑒定純合子轉基因魚的方法不僅費時費力，而且所鑒定結果的穩定性不高。
發明內容本發明的目的在于提供了ー種鑒定轉GH基因魚純合子的方法。該方法易行，操作簡便，可以對轉GH基因魚自交群體中的純合子和半合子轉基因魚進行準確、快速和高通量蹄選。本發明的另一目的是在于提供了ー種純合子轉基因魚在轉基因魚純系建立和轉基因魚新品種培育中的應用。篩選到轉基因魚純合子后，可以建立轉基因魚純系，從而培育出養殖性狀優良，遺傳性狀穩定的養殖魚類新品種。本發明對于加快遺傳性狀穩定的轉基因魚新品種的培育進程具有重要意義。為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施本發明利用STORGreenreal-timePCR的2-ΔACt方法(Haurogne，K.，Bach,J.Μ.,Lieubeau,B.,2007.EasyandrapidmethodofzygositydeterminationintransgenicmicebySYBRGreenreal-timequantitativePCRwithasimpledataanalysis.TransgenicResearch.16,127—131；Sakurai,Τ.,Kamiyosni,Α.,Watanabe,S.,Sato,Μ.,Shindo,Τ.,2008.RapidzygositydeterminationinmicebySYBRGreenreal-timegenomicPCRofacrudeDNAsolution.TransgenicResearch.17,149-155.),通過分析轉基因魚基因組中整合的轉植基因的基因型，在轉GH基因魚自交子代群體中快速、準確地鑒定和篩選到候選的純合子轉GH基因魚。該方法鑒別轉基因魚純合子和半合子不僅準確、快速，而且簡單、高通量、低廉，特別適合在轉基因魚群體中進行大規模快速篩選純合子，可以加快遺傳性狀穩定的轉基因魚新品種的培育進程。ー種轉基因魚純合子的快速鑒定方法，其步驟是1.DNA提取剪取約0.5-lcm2的轉GH基因魚尾鰭組織，按“血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒”操作指南(北京天根生物技術公司產品)，提取轉GH基因魚基因組DNA。2.陽性轉GH基因魚鑒定采用常規PCR技術鑒定陽性轉GH基因魚。PCR體系總體積為25ul，包括20ngDNA,0.5μ1dNTP(lOmM)，2.5ul緩沖液，2.5ulMgCl2,IUnitΤ.AquaticusDNA聚合酶，引物(IOmM)(Invitrogen公司，下同)各1μ1。上下游引物序列分別為GH(F5'-CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA-3‘)和GH(R5‘-AGCACCACCGACAACAGCACTAATG-3‘)。反應程序94"C預變性5min，擴增30個循環(94°C,30s；58°C,30s；72°C，30s)，最后72°C延伸5min。取反應產物5ul置于1%(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳，預期擴增的轉植基因片段大小為32!3bp。3.純合子鑒定與篩選轉植基因gcGH(草魚生長激素，下同)在純合子轉基因魚基因組中的拷貝數是其在半合子轉基因魚基因組中拷貝數的2倍。通過Real-timePCR分析轉基因魚中轉植基因gcGH的基因型來鑒別轉基因魚純合子和半合子以在黃河鯉魚(遺傳資源表見附件)基因組中拷貝數恒定不變的GnRH-III基因為(GonadotropinReleasingHormone,GnRH)內參基因，以轉植的gcGH為目標基因，進行實時定量PCR。取20ngDNA，50mMdNTP,IOulSYBRGreenMix(Τ0Υ0Β0，Japan)通過熒光定量PCR對gcGH和GnRH-III基因進行分析。實驗采用ABIPRISM7000定量PCR儀(AppliedBiosystems公司)，反應條件為95°C，2min,95V，15s,60V，30s,72V，45s,40個循環。20ul反應體系包括SYBRGreenMixPCR(TOYOBO)10ul，20_50ng純化DNA，上下游引物(1OmM)各2u1。gcGH基因上下游引物分別為(F5，-TGTCTGGCACATCTGAGG-3，，R5’-GAAAGCATCATATCCATACC-3’)所擴增的片段全長為205bp。GnRHIII基因上下游引物分別為(F:5，-ATGGAGTGGAACGGAAGGT-3，，R:5，-CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA-3，)，所擴增的片段全長為169bp。實時定量PCR的數據由ABIPrism7000SDS11軟件(AppliedBiosystems公司)編譯和收集。采用相對定量2_ΔΔ"方法ACt=Ct(gcGH)-Ct(GnRH-III),ΔΔCt=ΔCt(待檢測魚)-ΔCt(已知的半合子基因型魚，為經過測交驗證的實驗魚)，當2_Δ=2時，則檢測的實驗魚為純合子，當2_Δ=1時，檢測的魚為半合子。4.純合子驗證將步驟3篩選出的純合子轉基因黃河鯉魚與對照黃河鯉魚雜交后，按步驟1和2所示方法鑒定雜交子代的陽性率。根據孟德爾遺傳定律，純合子轉基因魚與對照魚雜交子代的陽性率為100%，半合子轉基因魚與對照魚雜交子代的陽性率為50%(圖1)。一種純合子轉基因魚在轉基因魚純系建立和轉基因魚新品種培育中的應用。其步驟是將鑒定的雄性轉基因黃河鯉魚純合子與雌性轉基因黃河鯉魚純合子按常規方法在池塘中養殖，待其發育到性成熟后，按常規方法進行人工催產；將雄性轉基因黃河鯉魚純合子精液與雌性轉基因黃河鯉魚卵子進行人工授精；自交得到的子代即為遺傳性狀穩定的轉基因魚純合子家系，將獲得的轉基因黃河鯉魚純合子家系按常規方法在池塘中養殖和培育，從而培育出優良養殖魚類新品種。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果1.與采用Dotblot,Southernblot和半定量PCR分析轉植基因整合的拷貝數后，再結合測交結果鑒定純合子轉基因魚技術比較，本發明結合STORGreenreal-timePCR和相對定量比較ACT的方法鑒定純合子，不需要樣品濃度一致，也不需要復雜的數據分析，操作簡單，快速，準確，而且可以高通量分析待檢測轉基因魚樣品。2.鑒定出來的純合子轉基因魚可以作為親本用于建立轉基因魚純系，從而培育出養殖性狀優良，遺傳性狀穩定的養殖魚類新品種，加快遺傳性狀穩定的轉基因魚新品種的培育進程。圖1為一種純合子和半合子轉GH基因魚測交子代的PCR陽性檢測結果示意圖。純合子，半合子轉GH基因魚及對照雄魚分別與對照雌魚雜交，提取子代魚苗基因組DNA，PCR(30循環)后取5ul產物進行瓊脂糖凝膠(1%)電泳，片段長度為32!3bp，如圖所示，純合子(Α，η=20)，半合子(B和C，η=20)及對照魚(Cl，C2，C3，C4，4條/組)，PCR陰性對照采用無菌水做為模板(NTC:notemplatecontrol).根據孟德爾遺傳定律，純合子(A)子代的轉植基因陽性率為100%，而半合子(B和C)子代的轉植基因陽性率為50%左右ο圖2為一種純合子(n=11)和半合子(n=42)轉GH基因黃河鯉STORReal-timePCR定量分析結果示意圖。純合子轉GH基因黃河鯉2_ΔΔα=2.02士0.31，半合子轉GH基因黃河鯉2_δδ"=1.01士0.16，所擴增的轉植基因相差一倍，統計學分析具有顯著差異(Student'st-test,ρ<0.001)，以轉基因魚(n=53)的基因組DNA(25-50ng)為模板，分別擴增gcGH和sGnRH基因片段，2_ΔΔα數據分析方法如下ACt=Ct(gcGH)-Ct(sGnRH)，ΔΔCt=ΔCt(待檢測)-ΔCt(已知半合子)，上下誤差線表示標準差。具體實施例方式實施例1ー種轉基因魚純合子的鑒定方法，其步驟是1.DNA提取剪取約0.5-lcm2的轉GH基因魚尾鰭組織，按“血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒”操作指南(北京天根生物技術公司產品)，提取轉GH基因魚基因組DNA。2.轉GH基因魚陽性鑒定采用常規PCR技術進行轉GH基因魚陽性鑒定。PCR體系總體積為25u1，包括20ngDNA,IOOuMdNTP,2.5ulBuffer(25mM)，2.5ulMgCl2(25mM)，IUnitΤ.AquaticusDNA聚合酶(Fermentas，USA),引物(IOmM)(Invitrogen公司，下同)各1μ1。引物序列GHf(5‘-CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA-3‘)和GHr(5‘-AGCACCACCGACAACAGCACTAATG-3')。反應程序94°C預變性5min，擴增30個循環(94°C,30s；58°C,30s；72°C,30s),最后72°C延伸5min，PCR反應在GeneAmpSystem9600型儀器進行。取反應產物5ul置于1%(g/ml)瓊脂糖凝膠電泳。預期擴增的轉植基因片段大小為32!3bp(圖1)。3.純合子鑒定與篩選轉植基因gcGH在純合子轉基因魚基因組中的拷貝數是其在半合子轉基因魚基因組中拷貝數的2倍。通過Real-timePCR分析轉基因魚中轉植基因gcGH的基因型來鑒別轉基因魚純合子和半合子以在黃河鯉魚(遺傳資源表見附件)基因組中拷貝數恒定不變的GnRH-III基因為(GonadotropinReleasingHormone,GnRH)內參基因，以轉植的gcGH為目標基因，進行實時定量PCR。取20ngDNA，50mMdNTP,IOulSYBRGreenMix(Τ0Υ0Β0，Japan)通過熒光定量PCR對gcGH和GnRH-III基因進行分析。實驗采用ABIPRISM7000定量PCR儀(AppliedBiosystems公司)，反應條件為95°C，2min，95"C,15s,60"C,30s,72"C,45s,40個循環。20ul反應體系包括SYBRGreenMixPCR(Τ0Υ0Β0)10ul，20_50ng純化DNA，上下游引物(IOmM)(Invitrogen公司)各0.5μ1。gcGH基因上下游引物分別為(F:5，-TGTCTGGCACATCTGAGG-3，，R:5，-GAAAGCATCATATCCATACC-3，)所擴增的片段全長為205bp。GnRHIII基因上下游引物分別為(F:5，-ATGGAGTGGAACGGAAGGT-3，，R5，-CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA-3，)，所擴增的片段全長為169bp。實時定量PCR的數據由ABIPrism7000SDS1.1軟件編譯和收集。采用相對定量2-“ct方法Δα=ct(gcGH)-Ct(GnRH-III)，ΔΔCt=ΔCt(待檢測魚)-ΔCt(已知的半合子基因型魚，為經過測交驗證的實驗魚)，當2_ΔΔα=2吋，則檢測的轉基因魚為純合子，當2_δ=1時，檢測的轉基因魚為半合子(圖2)。4.純合子驗證將步驟3篩選出的純合子轉基因魚與對照魚雜交后，按步驟1和2所示方法鑒定雜交子代的陽性率，根據孟德爾遺傳定律，純合子轉基因魚與對照魚雜交子代的陽性率為100%，雜合子轉基因魚與對照魚雜交子代的陽性率為50%(圖1)。實施例2:篩選出來的一種純合子轉基因黃河鯉魚在培育優良養殖魚類品種中的應用。其具體過程是A、將鑒定的雄性轉基因黃河鯉魚純合子與雌性轉基因黃河鯉魚純合子按常規方法在池塘中養殖，待其發育到性成熟后，按常規方法進行人工催產；B、將雄性轉基因黃河鯉魚純合子精液與雌性轉基因黃河鯉魚卵子進行人工授Ib；C、自交得到的子代即為遺傳性狀穩定的轉基因魚純合子家系，將獲得的轉基因黃河鯉魚純合子家系按常規方法在池塘中養殖和培育，從而培育出優良養殖魚類新品種。權利要求1.ー種轉基因魚純合子的快速鑒定方法，其步驟是A、DNA提取剪取0.5-lcm2的轉GH基因魚尾鰭組織，按血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒操作指南，提取轉GH基因魚基因組DNA；B、陽性轉GH基因魚鑒定采用常規PCR技術鑒定陽性轉GH基因魚，PCR體系總體積為25ul，包括20ngDNA,0.5μ1dNTP，2.5ul緩沖液，2.5ulMgCl2,IUnitΤ.AquaticusDNA聚合酶，引物各1μ1；上下游引物序列分別為F5‘-CATTTACAGTTCAGCCATGGCTAGA-3‘和R:5‘-AGCACCACCGACAACAGCACTAATG-3‘，反應程序94°C預變性5min，擴增30個循環940C，30s；58°C，30s；72°C，30s，最后72°C延伸5min，取反應產物5ul置于1%g/ml瓊脂糖凝膠電泳，預期擴增的轉植基因片段大小為32!3bp；C、純合子鑒定與篩選轉植基因gcGH在純合子轉基因魚基因組中的拷貝數是其在半合子轉基因魚基因組中拷貝數的2倍，通過Real-timePCR分析轉基因魚中轉植基因gcGH的基因型來鑒別轉基因魚純合子和半合子在黃河鯉魚基因組中拷貝數恒定不變的&1RH-III基因為內參基因，以轉植的gcGH為目標基因，進行實時定量PCR；取20ngDNA，50mMdNTP,IOulSYBRGreenMix通過熒光定量PCR對gcGH和GnRH-III基因進行分析，實驗采用ABIPRISM7000定量PCR儀，反應條件為95°C，2min，95°C，15s，60°C，30s，72°C，45s，40個循環，20ul反應體系包括SYBRGreenMixPCRlOul，20_50ng純化DNA，上下游引物各2ul，gcGH基因上下游引物分別為F:5，-TGTCTGGCACATCTGAGG-3，，R5，-GAAAGCATCATATCCATACC-3，所擴增的片段全長為205bp，GnRHIII基因上下游引物分別為F:5，-ATGGAGTGGAACGGAAGGT-3，，R:5，-CAGACAAATGAGAACAAGAGGAA-3，，所擴增的片段全長為169bp；D、純合子驗證將步驟C篩選出的純合子轉基因黃河鯉魚與對照黃河鯉魚雜交后，按步驟A和B所示方法鑒定雜交子代的陽性率，根據孟德爾遺傳定律，純合子轉基因魚與對照魚雜交子代的陽性率為100%，半合子轉基因魚與對照魚雜交子代的陽性率為50%。2.權利要求1所述的ー種純合子轉基因魚在轉基因魚純系建立中的應用。3.權利要求1所述的ー種純合子轉基因黃河鯉魚在培育養殖魚類品種中的應用。全文摘要本發明公開了一種轉基因魚純合子的快速鑒定方法及應用，其步驟A剪取約0.5-1cm2的轉基因魚尾鰭組織，提取DNA；B采用常規PCR技術檢測轉植基因陽性；C采用SYBRGreenreal-timePCR的2△△Ct方法分析轉植基因為陽性的轉基因魚的基因型，比較純合子和半合子轉基因魚中轉植基因整合的相對拷貝數，鑒定和篩選出轉基因純合子，并通過測交試驗進一步確證。本發明方法易行，快速準確，操作簡便。鑒定和篩選的轉基因魚純合子對于建立轉基因魚純系，加快轉基因魚新品種培育進程具有重要意義。文檔編號C12Q1/68GK102534039SQ20121004780公開日2012年7月4日申請日期2012年2月28日優先權日2012年2月28日發明者宋焱龍,朱作言,汪亞平,胡煒,鐘成容申請人:中國科學院水生生物研究所