專利名稱：一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法
—種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及菠蘿蛋白酶的提取方法，特別涉及一種用殼聚糖羧化衍生物提取果菠蘿蛋白酶的方法。
背景技術：
菠蘿蛋白酶(簡稱菠蘿酶)是從菠蘿植株中提取的一類多肽水解酶的總稱，主要存在于菠蘿莖和果實中。根據提取部位的不同，分為莖菠蘿蛋白酶(EC3. 4. 22. 32)和果菠蘿蛋白酶(EC 3. 4. 22. 33)。從菠蘿皮、果中提取的為果菠蘿蛋白酶，從菠蘿莖中提取的為莖菠蘿蛋白酶。本發明是針對果菠蘿蛋白酶的分離提取。菠蘿蛋白酶屬于巰基蛋白酶，具有很強的水解活性，在食品、生物化學領域有廣泛應用。同時，由于其能加強體內纖維蛋白的水解作用，將阻塞于組織的纖維蛋白及血凝塊溶解，促進藥物對病灶的滲透和擴散，且不破壞凝血所必需的纖維蛋白原，因而在醫藥領域也有很好的應用前景。目前，受酶活力低和原料供應不穩定的限制，其在醫藥領域的應用還未完全開發。目前提取菠蘿蛋白酶的方法可歸為三類，即鹽析法、有機溶劑沉淀法和超濾法。鹽析法，如張桂香(張桂香，王元秀，矯強，等.鹽法提取菠蘿蛋白酶的研究.食品工業科技，2004，(6) :103-104.)報道了用(NH4)2SO4沉降提取菠蘿蛋白酶的方法。其提取菠蘿蛋白酶的工藝步驟為菠蘿皮-清洗-榨汁-過濾-收集濾液-加苯甲酸鈉-io°c加白陶土 _吸附沉降_收集沉淀物_復溶_加(NH4) 2SO4-洗脫-粗酶液_調節pH-精酶液。簡化的鹽析法在小型企業中比較常見，具體步驟為菠蘿皮-清洗-榨汁-過濾-收集濾液-加 (NH4)2SO4-收集沉淀-干燥。鹽析法所得酶的活力低，鹽使用量多、如(NH4)2SO4的添加量一般為菠蘿汁體積的20-25%，(NH4)2SO4F易回收，菠蘿汁也不能回用，工藝比較落后。有機溶劑沉淀法，如中國專利CN101696404A提供了一種通過有機溶劑沉降來提取菠蘿蛋白酶的方法。菠蘿經清洗榨汁后，濾液用聚丙烯酸吸附沉降，沉淀物用醋酸鈣溶液處理，使菠蘿蛋白酶游離出來，得到菠蘿蛋白酶粗酶液，再經透析、冷凍干燥后，得到菠蘿蛋白酶干粉。這種方法操作簡單、快速、高效、分離量大、聚丙烯酸原料來源廣泛，但實際操作中，聚丙烯酸受其單體制備方法的影響，其中常殘留丙烯酰胺，這是一種有毒有害成分，在食品等行業中是限制使用的，且聚丙烯酸具有成膜性，能快速地在溶液中形成分子膜，阻礙透析的進行，不利于菠蘿蛋白酶的純化。超濾法，如中國專利CN1908165A提供了一種超濾法提取菠蘿蛋白酶的方法。它包括以下步驟原料-清洗-粗粉碎-細粉碎-預處理-榨汁-離心-冷凍-過濾-超濾-干燥-成品，該工藝依靠先進分離提取手段，所用人工較少，酶活力也較高，缺點是菠蘿汁不經去糖、去雜碎細胞處理，直接超濾，超濾膜易被污染，每次使用前后都要進行清洗，清洗時間超過生產時間，而且重復使用效果差，需頻繁更換膜塊，生產成本較高。因此，目前還需要提供一種提取菠蘿蛋白酶的方法，該方法能夠解決鹽析法、有機溶劑沉淀法和超濾法提取菠蘿蛋白酶存在的不足。
發明內容本發明的目的在于提供一種原料是純天然產物、無毒無害、來源廣泛，工藝操作簡便、生產效率高，產品純度好、活力高的菠蘿蛋白酶的提取方法。具體地說，本發明提供了一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法。該方法包括如下步驟(I)殼聚糖羧化衍生物的制備；(2)菠蘿汁預處理；(3)菠蘿蛋白酶的吸附；(4)菠蘿蛋白酶的洗脫；(5)菠蘿蛋白酶的精制和干燥。該方法可以同時得到菠蘿蛋白酶和菠蘿汁兩種產品，二者的生產互不干涉，且菠蘿汁透明澄清，無需離心等處理，可直接回收再利用.本發明的具體實施方案如下(I)殼聚糖羧化衍生物的制備稱取適量的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成一定濃度的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入適量的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液，將該溶液置于一定溫度下的水浴中，邊緩慢攪拌邊向其中加入適量的固體氯乙酸，反應一定的時間后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在適當的溫度下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物；(2)菠蘿汁預處理將菠蘿果皮清洗后榨汁,過濾除去大顆粒雜質后，測量濾液體積，然后將其置于適當溫度下的冷藏罐中，向其中加入適量的粉末NaHSO3、半胱氨酸和 EDTA (乙二胺四乙酸)，緩慢攪拌均勻；(3)菠蘿蛋白酶的吸附稱取適量的步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物， 加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈；回收上清液，即是澄清的菠蘿汁，可直接利用，取下層溶液，在3000rpm條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物；(4)菠蘿蛋白酶的洗脫配制適量的一定濃度和pH的NaHCO3溶液，將步驟(3)得到的復合物溶于NaHCO3溶液中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至一定的范圍，再向其中加入適量的一定濃度的CaCl2溶液，攪拌均勻后靜置一定的時間，然后在3000rpm條件下，離心10 分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液；(5)菠蘿蛋白酶的精制和干燥配制一定濃度和pH的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，用其將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋一定的倍數，在一定的溫度條件下，先由分子截留量為100K的超濾除去大分子雜質，再經分子截留量為IOK的超濾濃縮一定的倍數，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得干酶粉；或將步驟(4)所得菠蘿蛋白酶溶液，經鹽析收集蛋白酶， 鹽析時，將菠蘿蛋白酶溶液置于一定的溫度下，調節溶液PH值至一定的范圍，邊緩慢攪拌邊向其中均勻地加入適量粉末(NH4)2SO4，然后靜置一定的時間，取下層溶液，在3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，真空冷凍干燥，得干酶粉。本發明所述的用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，作為步驟(I)，所述的殼聚糖異丁醇懸浮液的濃度，可優選的以質量濃度計為O. 8 I. I %，最優選的為1% ;所述飽和NaOH溶液的用量，可優選的是其溶質質量為殼聚糖的O. 65 O. 80倍，最優選的為
O.75倍；所述的固體氯乙酸的用量,可優選的為殼聚糖質量的I. I I. 3倍,最優選的為I.2倍；所述的反應溫度，可優選的為65 75°C，最優選的為70°C ;所述的反應時間，可優選的是2. 5 3. O小時，最優選的為2. 7小時；所述的烘干溫度，可優選的為60 70°C，最優選的為65°C。作為步驟(2)，所述的濾液置于的溫度，可優選的為8 14°C，最優選的為 I TC ;所述的單位體積菠蘿汁中粉末NaHSO3的加入量，可優選的為3X 10_4 4X 10_4g/L， 最優選的為3. 5X 10Vl ;所述的單位體積菠蘿汁中粉末半胱氨酸的加入量，可優選的為
5.5 X 10_5 6. 5 X 10_5g/L，最優選的6. O X 10_5g/L ;所述的單位體積菠蘿汁中粉末EDTA (乙二胺四乙酸)的加入量，可優選為4. 5X10—4 5. 5X10_4g/L，最優選的為5.0X10_4g/L。作為步驟(3)，所述的單位體積菠蘿汁中殼聚糖羧化衍生物的加入量，可優選的為I 3. 5g/ L，最優選的為2. 5g/L。作為步驟(4)，所述的NaHCO3溶液的濃度，可優選的為O. 05 O. 12mol/L，最優選的為O. IOmoI/L ;所述的NaHCO3溶液的pH值，可優選的為7. 8 8. 5，最優選的為8. O ;所述的NaHCO3溶液的用量，可優選的以質量計為菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物的7. 5 9倍，最優選的為8倍；所述的用飽和Na2CO3溶液調節殼聚糖-羧化衍生物復合物復溶后的溶液的pH值，可優選的為6. 5 7. 0，最優選的為6. 8 ;所述的CaCl2 溶液的濃度，可優選的以質量濃度計為5. O 7. O %，最優選的為5. 5%所述的CaCl2溶液的用量，可優選的為每千克菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物加入CaCl2溶液O. 5 O. 75L，最優選的為O. 64L ;所述的加入CaCl2后靜置一定的時間，可優選的為10 20分鐘，最優選的為12分鐘。作為步驟(5)所述的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液的濃度，可優選的為
O.03 O. 07mol/L,最優選的為O. 05mol/L ;所述的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液的pH值，可優選的為6. 5 7. 0，最優選的為6. 8 ;所述的菠蘿蛋白酶溶液的稀釋倍數，可優選的為4 8 倍，最優選的為5倍；所述的超濾過程的控制溫度，可優選的為8 14°C，最優選的為11°C; 所述的超濾的濃縮倍數，可優選的為4 6倍，最優選的為5倍；所述的鹽析過程控制溫度， 可優選的為12 18°C，最優選的為15°C ;所述的鹽析時，溶液pH值調節至一定的范圍，可優選的為4 5，最優選的為4. 5 ;所述的粉末(NH4)2SO4的用量，可優選的以質量-體積百分濃度計為18 25%，最優選的為20% ;所述的(NH4)2SO4加完后，靜置一定的時間，可優選的為8 16小時，最優選的為12小時。因此，本發明所述的用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，優選采用如下實施方案(I)殼聚糖羧化衍生物的制備稱取適量的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成質量濃度為O. 8 I. I %的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入含有溶質質量是殼聚糖O. 65 O. 80倍的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液；將該溶液置于 65 75°C水浴中，邊緩慢攪拌邊向其中加入質量是殼聚糖I. I I. 3倍的固體氯乙酸,反應2. 5 3. O小時后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在60 70°C下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物。(2)菠蘿汁預處理將菠蘿果皮清洗后榨汁,過濾除去大顆粒雜質后，測量濾液體積，然后將其置于8 14°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，單位體積菠蘿汁中的加入量分別為3 X 10_4 4 X 10_4g/L、5. 5 X 10_5
6.5 X l(T5g/L 和 4. 5 X I(T4 5. 5 X l(T4g/L，緩慢攪拌均勻。(3)菠蘿蛋白酶的吸附按照單位體積菠蘿汁中殼聚糖羧化衍生物的用量I 3. 5g/L，稱取步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物，稱好后用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)中所得菠蘿汁，向其中均勻地加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈。回收上清液，即是澄清的菠蘿汁，可直接利用，取下層溶液，在3000rpm條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物。(4)菠蘿蛋白酶的洗脫配制濃度為O. 05 O. 12mol/L、pH7. 8 8. 5的NaHCO3溶液，使其質量為菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物的7.5 9倍，將步驟(3)所得的復合物溶于NaHCO3溶液中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至6. 5 7. O范圍內，然后向其中加入質量濃度為5. O 7. O %的CaCl2溶液，加入量為每千克菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物O. 5 O. 75L，攪拌均勻后靜置10 20分鐘，在3000rpm條件下，離心10分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液。(5)菠蘿蛋白酶的精制和干燥配制濃度為O. 03 O. 07mol/L、pH值為6. 5 7. O 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，用其將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋4 8倍，8 14°C 的條件下，先由分子截留量為100K的超濾除去大分子雜質，再經分子截留量為IOK的超濾濃縮4 6倍，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得干酶粉；或將步驟(4)所得菠蘿蛋白酶溶液， 經鹽析收集蛋白酶，鹽析時，將菠蘿蛋白酶溶液置于12 18 V的溫度下，調節溶液pH值至4 5，然后邊緩慢攪拌邊均勻地加入粉末(NH4)2SO4，其用量以質量-體積百分濃度計為 18 25%，靜置8 16小時，取下層溶液，在3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物， 真空冷凍干燥，得干酶粉。本發明的技術關鍵點在于(I)甲殼素是蝦、蟹和昆蟲等外殼的重要成分，其脫乙酰基后得到殼聚糖。殼聚糖學名聚脫乙酰氨基葡萄糖，是一種高分子多糖，也是良好的陽離子絮凝劑。殼聚糖是天然產物，安全無毒，無刺激、無熱源，可溶于水或弱酸，對化合物有良好的吸附和離子交換性能。 改性后的殼聚糖，由圖I可以看出，在HOOcnT1波長處有明顯的特征峰，說明羧基已經鏈接到殼聚糖的分子鏈中，其不僅可增強殼聚糖的水溶性，而且可與菠蘿蛋白酶的氨基結合，形成菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物。(2)用殼聚糖羧化衍生物吸附菠蘿蛋白酶時，單位菠蘿汁中加入的殼聚糖羧化衍生物不能超過3. 5g/L，否則將對菠蘿蛋白酶起到分散的作用。(3)菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物溶于NaHCO3溶液后，溶液的pH值須在6. 5
7.O范圍內，若超出此范圍，則用飽和Na2CO3溶液調節，否則會影響殼聚糖羧化衍生物的洗脫效果。本發明用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，具有如下優點(I)殼聚糖是天然產物，安全無毒，無刺激、無熱源，具有良好的水溶性、吸附性，非常適合具有熱敏性的菠蘿蛋白酶的提取，所得酶純度好、活力高、安全可靠；(2)經過吸附沉降、洗脫和pH調節后，菠蘿蛋白酶溶液中只含微量的糖分和膠質， 超濾提純和濃縮時，對濾膜污染小、通量大，膜塊使用壽命長、生產效率高；(3)經殼聚糖羧化衍生物吸附沉降后，每噸菠蘿汁可產菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物約8kg，該復合物可冷凍保存6個月，因而在收獲季節可大量進行沉降處理， 待到菠蘿淡季時，再行提酶，可大大提高產值；(4)可以同時得到菠蘿蛋白酶和菠蘿清汁兩種產品；
(5)完成上述步驟(4)后，可由超濾法或鹽析法收集菠蘿蛋白酶，若用鹽析法，菠蘿蛋白酶溶液的體積只有原菠蘿汁的1/20，所用鹽量大大減少，又可節約超濾設備的投入， 適合小型企業生產。

圖I為殼聚糖及其羧化衍生物的紅外圖譜，改性后的殼聚糖在HOOcnT1波長處有明顯的特征峰，說明羧基已經鏈接到殼聚糖的分子鏈中。
具體實施方式實施例I (超濾收集菠蘿蛋白酶)(I)將質量為IOOg的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成質量濃度為O. 8%的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入含65g溶質的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液；將該溶液置于65°C水浴中，邊緩慢攪拌邊向其中加入固體氯乙酸110g，反應2. 5小時后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在60°C下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物。(2)稱取20kg菠蘿果皮，清洗后壓榨，過濾除去大顆粒雜質后，得菠蘿汁11L，將其置于8°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0033g、半胱氨酸O. 0006g、EDTA (乙二胺四乙酸)O. 0049g,緩慢攪拌均勻。(3)取步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物llg，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)中所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠蘿汁9. 3L，取下層溶液，在 3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物 85g0(4)配制O. 05mol/L pH 7. 8的NaHCO3溶液640mL,將步驟(3)所得的菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物溶于其中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至6. 5，再向其中加入質量濃度為5%的CaCl2溶液43mL，攪拌均勻后靜置10分鐘，在3000rpm的條件下，離心10 分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液710mL。(5)制備 O. 03mol/L pH 6. 5 的 Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液 3. 2L，用其將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋，8°C的條件下，先后經分子截留量為100K和IOK的膜進行超濾，待其體積減少到約O. 8L時，停止超濾，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得到干酶粉9g，經測其酶活力為 L 72X 106U/g。實施例2 (超濾收集菠蘿蛋白酶)(I)將質量為IOOg的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成質量濃度為I. I %的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入含80g溶質的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液。將該溶液置于75°C水浴中，邊緩慢攪拌邊向其中加入固體氯乙酸130g，反應3. O小時后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在70°C下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物。(2)稱取30kg菠蘿果皮，清洗后壓榨，過濾除去大顆粒雜質后，得菠蘿汁16L，將其置于14°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0064g、半胱氨酸O. OOlOg, EDTA O. 0088g,緩慢攪拌均勻。(3)取步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物56g，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)中所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠蘿汁12. 6L，取下層溶液，在 3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物 134g0(4)取O. 12mol/L pH 8. 5的NaHCO3溶液1200mL，將步驟(3)所得的菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物溶于其中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至7. 0，再向其中加入質量濃度為7%的CaCl2溶液IOOmL,攪拌均勻后靜置20分鐘，在3000rpm的條件下，離心10 分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液1340mL。(5)制備 O. 07mol/L pH 7. O 的 Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液 9. 1L，用其將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋，14°C的條件下，先后經分子截留量為IOOK和IOK的膜進行超濾，待其體積減少到約I. 5L時，停止超濾，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得到干酶粉18g，經測其酶活力為 1.85X 106U/g。實施例3 (超濾收集菠蘿蛋白酶)(I)將質量為IOOg的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成質量濃度為O. 9%的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入含70g溶質的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液。將該溶液置于70°C水浴中，向其中緩慢攪拌加入固體氯乙酸120g，反應2. 8 小時后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在65°C下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物。(2)稱取50kg菠蘿果皮，清洗后壓榨，過濾除去大顆粒雜質后，得菠蘿汁28L，將其置于10°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0098g、半胱氨酸O. 0017g、EDTA O. 014g，緩慢攪拌均勻。(3)取步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物76g，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)中所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠蘿汁25. 2L，取下層溶液，在 3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物 220g。(4)取O. 08mol/L pH 8. 2的NaHCO3溶液1800mL,將步驟(3)所得的菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物溶于其中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至6. 8，再向其中加入質量濃度為6%的CaCl2溶液135mL，攪拌均勻后靜置15分鐘，在3000rpm的條件下，離心10 分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液1960mL。(5)制備 O. 05mol/L pH 6. 8 的 Na2HPO4-NaH2PO4 緩沖液 12L，用其將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋，10°c的條件下，先后經分子截留量為IOOK和IOK的膜進行超濾，待其體積減少到約2. 4L時，停止超濾，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得到干酶粉39g，經測其酶活力為 2. 25X 106U/g。實施例4 (超濾收集菠蘿蛋白酶)(I)將質量為IOOg的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成質量濃度為I. O %的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入含75g溶質的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液。將該溶液置于70°C水浴中，邊緩慢攪拌邊向其中加入固體氯乙酸120g，反
9應2. 7小時后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在65°C下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物。(2)稱取40kg菠蘿果皮，清洗后壓榨，過濾除去大顆粒雜質后，得菠蘿汁24L，將其置于11 °C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0085g、半胱氨酸O. 0014g、EDTA O. 012g，緩慢攪拌均勻。(3)取步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物60g，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)中所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠蘿汁21. 2L，取下層溶液，在 3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物 203go(4)取O. IOmoI/L pH 8. O的NaHCO3溶液1620mL,將步驟(3)所得的菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物溶于其中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至6. 8，再向其中加入質量濃度為5. 5%的CaCl2溶液130mL，攪拌均勻后靜置12分鐘，在3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液1800mL。(5)制備O. 05mol/L pH 6. 8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液9L，用其將步驟⑷所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋，ll°c的條件下，先后經分子截留量為100K和IOK的膜進行超濾，待其體積減少到約I. 8L時，停止超濾，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得到干酶粉43g，經測其酶活力為 3. 12X106U/g。實施例5 (鹽析收集菠蘿蛋白酶)(I)將質量為IOOg的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成質量濃度為I. O %的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入含75g溶質的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液。將該溶液置于70°C水浴中，向其中緩慢攪拌加入固體氯乙酸210g，反應2. 7 小時后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在65°C下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物。(2)稱取40kg菠蘿果皮，清洗后壓榨，過濾除去大顆粒雜質后，得菠蘿汁24L，將其置于11 °C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0085g、半胱氨酸O. 0014g、EDTA O. 012g，緩慢攪拌均勻。(3)取步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物60g，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)中所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠蘿汁21. 2L，取下層溶液，在 3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物 203go(4)取O. IOmoI/L pH 8. O的NaHCO3溶液1620mL,將步驟(3)所得的菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物溶于其中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至6. 8，再向其中加入質量濃度為5. 5%的CaCl2溶液130mL，攪拌均勻后靜置12分鐘，在3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液1800mL。(5)將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液置于15°C的溫度下，調節溶液pH至4. 5， 邊緩慢攪拌邊均勻地加入粉末(NH4)2S04360g，然后靜置12小時，取下層溶液，在3000rpm 的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，真空冷凍干燥，得干酶粉46g，經測其酶活力為
I.41X106U/g。
應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外，應理解，在閱讀本發明內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價變化同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)殼聚糖羧化衍生物的制備稱取適量的殼聚糖溶脹在異丁醇中，制成一定濃度的懸浮液，邊攪拌邊向其中加入適量的飽和NaOH溶液，加完后在室溫下繼續攪拌30分鐘，得到殼聚糖原料溶液，將該溶液置于一定溫度下的水浴中，邊緩慢攪拌邊向其中加入適量的固體氯乙酸，反應一定的時間后，過濾，收集沉淀物，用乙醇反復洗滌后，在適當的溫度下烘干，得到殼聚糖羧化衍生物；(2)菠蘿汁預處理將菠蘿果皮清洗后榨汁，過濾除去大顆粒雜質后，測量濾液體積， 然后將其置于適當溫度下的冷藏罐中，向其中加入適量的粉末NaHSO3、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，緩慢攪拌均勻；(3)菠蘿蛋白酶的吸附稱取適量的步驟(I)所得的殼聚糖羧化衍生物，用少量菠蘿汁溶解，緩慢攪拌步驟(2)所得菠蘿汁，向其中均勻加入溶解后的殼聚糖羧化衍生物，加完后繼續攪拌5分鐘，然后靜置，直到上層溶液十分清澈，回收上清液，即是澄清的菠蘿汁，可直接利用，取下層溶液，在3000rpm條件下,離心10分鐘，收集沉淀物，得到菠蘿蛋白酶-殼聚糖羧化衍生物復合物；(4)菠蘿蛋白酶的洗脫配制適量的一定濃度和PH的NaHCO3溶液，將步驟⑶得到的復合物溶于NaHCO3溶液中，用飽和Na2CO3溶液調節pH至一定的范圍，再向其中加入適量的一定濃度的CaCl2溶液,攪拌均勻后靜置一定的時間，然后在3000rpm條件下,離心10分鐘， 收集上清液，得到菠蘿蛋白酶溶液；(5)菠蘿蛋白酶的精制和干燥配制一定濃度和pH的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，用其將步驟(4)所得的菠蘿蛋白酶溶液稀釋一定的倍數，在一定的溫度條件下，先由分子截留量為100K的超濾除去大分子雜質，再經分子截留量為IOK的超濾濃縮一定的倍數，收集濃縮液，真空冷凍干燥，得干酶粉；或將步驟(4)所得菠蘿蛋白酶溶液，經鹽析收集蛋白酶，鹽析時，將菠蘿蛋白酶溶液置于一定的溫度下，調節溶液PH至一定的范圍，邊緩慢攪拌邊向其中均勻地加入適量粉末(NH4)2SO4，然后靜置一定的時間，取下層溶液，在3000rpm的條件下，離心10分鐘，收集沉淀物，真空冷凍干燥，得干酶粉。
2.根據權利要求I所述的一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(I)所述的殼聚糖異丁醇懸浮液的質量濃度在O. 8 I. I %的范圍內；飽和NaOH溶液的用量在其溶質質量為殼聚糖的O. 65 O. 80倍范圍內；固體氯乙酸的用量在殼聚糖質量的I. I I. 3倍的范圍內；反應溫度在65 75°C的范圍內；反應時間在2. 5 3. O小時的范圍內；烘干溫度在60 70°C的范圍內。
3.根據權利要求I所述的一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(2)所述的菠蘿汁預處理，過濾后的菠蘿汁需置于8 14°C的冷藏罐中，單位體積菠蘿汁中粉末NaHSO3、半胱氨酸和EDTA (乙二胺四乙酸)的加入量分別在3X 10_4 4Xl(T4g/L、5. 5Χ1(Γ5 6. 5Xl(T5g/L 和 4. 5Χ1(Γ4 5. 5Xl(T4g/L 的范圍內。
4.根據權利要求I所述的一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(3)所述的單位體積菠蘿汁中殼聚糖羧化衍生物的加入量在I 3. 5g/L的范圍內。
5.根據權利要求I所述的一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟⑷所述的NaHCO3溶液的濃度在O. 05 O. 12mol/L的范圍內，NaHCO3溶液的pH值在7. 8 8. 5的范圍內，NaHCO3溶液的用量以質量計為菠蘿酶_殼聚糖羧化衍生物復合物的7. 5 9倍的范圍內，用飽和Na2CO3溶液調節殼聚糖-羧化衍生物復合物復溶后的溶液的pH值在6. 5 7. O的范圍內，CaCl2溶液的質量濃度在5. O 7. 0%的范圍內，CaCl2溶液的用量在每千克菠蘿酶-殼聚糖羧化衍生物復合物加入CaCl2溶液O. 5 O. 75L的范圍內，加入CaCl2溶液后需靜置的時間在10 20分鐘的范圍內。
6.根據權利要求I所述的一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，其特征在于，步驟(5)所述的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液的濃度在O. 03 O. 07mol/L的范圍內， Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液的pH值在6. 5 7. O范圍內，菠蘿蛋白酶溶液的稀釋倍數在4 8倍的范圍內，超濾過程的控制溫度在8 14°C的范圍內，超濾的濃縮倍數在4 6倍的范圍內；所述的將步驟(4)所得菠蘿蛋白酶溶液，經鹽析收集蛋白酶，鹽析過程控制溫度為 12 18°C，溶液pH值調節至4 5，鹽析時粉末(NH4)2SO4的用量以質量-體積百分濃度計在18 25%的范圍內，加完后靜置的時間在8 16小時的范圍內。
全文摘要
本發明提供了一種用殼聚糖羧化衍生物提取菠蘿蛋白酶的方法，包括如下步驟(1)殼聚糖羧化衍生物的制備；(2)菠蘿汁預處理；(3)菠蘿蛋白酶的吸附；(4)菠蘿蛋白酶的洗脫；(5)菠蘿蛋白酶的精制和干燥；本發明的優點在于(1)所得酶活力高、安全可靠；(2)工藝對超濾膜污染小，同時生產效率高；(3)使菠蘿蛋白酶的生產不受菠蘿采收期的限制；(4)可以同時得到菠蘿蛋白酶和菠蘿清汁兩種產品；(5)工藝靈活，可選超濾或鹽析收集菠蘿蛋白酶，使用鹽析法時，菠蘿蛋白酶溶液的體積只有原菠蘿汁的1/20，所用鹽量大大減少。
文檔編號C12N9/50GK102586213SQ20121004782
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日 公開號201210047823.0
發明者李普旺, 韓志萍, 黃茂芳 申請人:中國熱帶農業科學院農產品加工研究所