專利名稱：利用scar標記鑒定甘蔗抗黑穗病性方法
技術領域：
本發明涉及一種植物的抗病性分子標記的鑒定方法，具體涉及利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
MMXSaccharum oiTiciaa/ )是最主要的糖料作物,鹿糖占我國食糖總產的90% 以上，甘鹿生產關系我國食糖安全。由黑粉菌引起的甘鹿黑穗病是一種世界性的也是我國最嚴重的甘蔗真菌性病害，目前主栽品種宿根黑穗病發病率高達 20%，造成嚴重損失，培育抗病品種是最經濟、最有效的控制措施，抗病性鑒定的效率和準確性直接影響抗病育種的進程和效果。目前，國內外甘蔗對黑穗病抗性鑒定還是采用用人工接種蔗莖后田間種植，在整個生長季觀察發病率進行抗病性鑒定，其不足在于首先至少需要根據兩個作物季(即2次新植或I次新植和I次宿根)的鑒定結果進行綜合判斷，周期長達2年；其次該方法工作量大，占地大，成本高，難以對大規模的樣品進行鑒定，而甘蔗高度雜合的異源多倍體作物， 也是無性繁殖作物，雜交F1代分離群體性狀高度分離，是進行選擇的最佳時期，但優良聚合基因型重組概率很低，通常從實生苗到育成品種的概率約為1/100，000，故鑒定和選擇的工作量極大。甘蔗抗黑穗病性狀的選擇也是以雜交分離的大群體作為選擇基礎，現有的鑒定方法與育種的大群體要求不相適應；再次田間抗病性表現是甘蔗基因型、環境和病原3個因素互作的結果，因此，環境對抗病性表現型影響大，不同年份間的鑒定結果有比較大的差
巳因此，甘蔗對黑穗病抗性的鑒定效率和準確性直接關系甘蔗生產的安全，而目前的抗病性鑒定方法效率低、周期長、耗費高，準確性也不足，需要更簡便、快速、準確的抗病性鑒定技術。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法。本發明利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括基因組DNA的提取、 SCAR-PCR標記的檢測體系建立和SCAR-PCR產物的檢測，其特征在于
1、SCAR-PCR標記的檢測使用的檢測引物是甘蔗SCAR-F和SCAR-R，其中，SCAR-F 是 5' -CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3'，SCAR-R 是 5’-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3’ ；
2、SCAR-PCR標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為總體積25μ I，內含2. 5 μ I 10XPCR 緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的檢測引物 SCAR-F 和 SCAR-R 各 I. 0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因組 DNA， ddH20 補足到 25 μ I ;SCAR-PCR 擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 58 °C I min, 72 0C 2 min，30個循環；72 °C 10 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；3、SCAR-PCR產物的檢測電泳檢測的SCAR-PCR擴增圖譜中，在分子量為331 bp的位置出現DNA條帶,為甘鹿感黑穗病的標志；在分子量為331 bp的位置未出現DNA條帶,為甘蔗抗黑穗病標志。本發明具有以下優點本發明的利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規的人工接種田間抗性鑒定相比，具有操作簡便、檢測時間短、準確性高、容易判斷、重復性好和不受環境條件影響等優點。I、操作簡便該檢測方法得到的顯性標記可顯著減少甘蔗抗黑穗病性鑒定的工作量，檢測時只需要SCAR-PCR擴增和產物檢測即可快速鑒定甘蔗抗黑穗病性；而常規的人工接種田間抗性鑒定則需要大量的人力和物力來開展人工接種和田間收據收集處理，當品種多時鑒定工作難以進行。2、檢測時間短該檢測方法所需時間為1-2天，而常規的人工接種田間抗性鑒定試驗所需時間至少為2年。3、準確性高、容易判斷、重復性好，而且不受環境因素的影響該檢測方法以基因組DNA為材料，DNA是穩定的遺傳物質，不受環境因素等的影響，同時它的331 bp的顯性判斷一目了然，減少了環境條件的影響和人為判斷的偏差，大大提高了準確性；而常規的人工接種田間抗性鑒定試驗中，受人工接種效果、田間抗性鑒定數據收集時間和種植環境的影響，給準確判斷造成困難。本發明為甘蔗種質資源的評價和新品種的審定工作，提供了更為簡便有效的抗黑穗病性鑒定體系，對加強我國抗黑穗病甘蔗種質資源的保護工作具有重要意義。


圖I為使用甘蔗SCAR-F和SCAR-R檢測引物鑒定22個甘蔗品種抗黑穗病性的SCAR-PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準，C代表空白對照，S代表對應甘蔗品種人工接種田間抗性鑒定為感黑穗病，R代表對應甘蔗品種人工接種田間抗性鑒定為抗黑穗?。?-22代表22個品種，具體為1，FN91-4710; 2，GT96-44; 3，R0C5; 4， FN95-1702; 5， YZ92-19; 6， R0C26; 7， YT93-159; 8， YT85-177; 9， YT89-240; 10， FN27; 11，Brazil45; 12，ColOOl; 13，CP85-1308; 14，GN95-108; 15，FN95-0403; 16，HoCP92-648; 17，CP89-1509; 18，MT92-649; 19，HoCP93_750; 20，CP72-1210; 21， HoCP91-555; 22， LCP85-384。圖2為使用甘蔗SCAR-F和SCAR-R檢測引物鑒定23個甘蔗品種抗黑穗病性的SCAR-PCR擴增圖譜。其中各泳道中，M代表分子量標準，S代表對應甘蔗品種人工接種田間抗性鑒定為感黑穗病，R代表對應甘蔗品種人工接種田間抗性鑒定為抗黑穗??； 23-45 代表 23 個品種，具體為 23，CP88-1726; 24，GT93-103; 25，R0C16; 26，R0C22; 27， RB72-454; 28， FN94-0744; 29， FR93-435; 30, GT94-119; 31， FR93-344; 32， MT86-2121; 33， HoCP93_746; 34， MEX105; 35， R0C27; 36， GT90-95; 37， R0C10; 38， R0C25; 39， R0C20; 40， R0C24; 41， FN91-4621; 42， YT96-244; 43， FN02-3924; 44， Q170; 45, FN91-3623。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的闡述。實施例I 一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括以下步驟
I、基因組DNA的提取
(1)取5克待檢測甘蔗植株的嫩葉，置研缽，加入液氮迅速磨粹成粉末，并在解凍前轉入50 ml的離心管中；
(2)加入15ml,65 °C預熱的SDS提取液，混勻后在65 1水浴保溫40 min ；
(3)加8 ml 3 mol/L KAC 混勻后，冰浴 30 min ；
(4)25000 g，4 °C離心，20 min ;收集上清液，并加入12 ml于4°C預冷的異丙醇；
(5)-20°C放置30 min后，鉤出漂浮在液面的DNA，置于一干凈的I. 5 ml離心管中，晾干后加入750 μ I TE ;加等體積的平衡飽和酚，搖勻，12000 g，4 °C離心，10 min ；
(6)轉移上清至另一干凈的I.5 ml離心管中，加等體積的氯仿，12000 g，4 °C，離心10 min后移出上層水相；
(7)在水相中加2倍體積的無水乙醇，12000g，4 °C離心10 min，留沉淀，用體積濃度為70%的乙醇清洗2次，并晾干；
(8)加滅菌后的TE溶液200μ I溶解后，置-20 °C冰箱中保存備用。2、SCAR-PCR標記的檢測建立
SCAR-PCR擴增體系為總體積25 μ 1，內含2. 5 μ I 10XPCR緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/ L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP，10 mmol/L 的檢測引物 SCAR-F 和 SCAR-R 各 I. 0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因組 DNA，ddH20 補足到 25 μ I。
SCAR-PCR擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min, 58 °C I min, 72 °C 2 min, 30 個循環；72 °C 10 min。所述專用檢測弓I物SCAR-F和SCAR-R，是采用RAPD-PCR技術，經過大量的篩選試驗，獲得了感黑穗病甘蔗的特異DNA片段，以此片段的DNA序列為基礎，設計甘蔗抗黑穗病性鑒定的檢測引物。所述檢測弓I物SCAR-F和SCAR-R的具體內容為
SCAR-F 5/ -CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3',
SCAR-R :5’-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3’。3、SCAR-PCR擴增產物的檢測
具體的檢測方法為，取SCAR-PCR擴增產物10 μ ，加5 μ I含有溴酚藍的上樣緩沖液， 混勻后點樣于含有0. 5 μ g/ml溴化乙錠的I. 5 %瓊脂糖凝膠上，于0. 5 X TBE緩沖液中，10 V/cm恒定電壓下電泳1.5 h，結束后在凝膠成像系統上成像并進行凝膠分析。SCAR-PCR產物的檢測結果采用檢測弓I物SCAR-F和SCAR-R對甘蔗進行SCAR-PCR 擴增，結果如圖I、圖2所示，只有感黑穗病甘蔗出現分子量為331 bp的DNA條帶，而抗黑穗病甘鹿不出現331 bp的DNA條帶。本發明采用的主要試劑如下(所有化學試劑均為分析純)
1、SDS提取液NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 I. 44 g、KH2 PO4 0. 24 g、SDS 2 g、甘油 50 ml,滅菌去離子I L, pH值7· 4 ;
2、TE溶液10 mmol/L Tris HCl, I mmol/L EDTA ；
3、上樣緩沖液0.1%溴酚藍，40%蔗糖；4、0.5 X TBE 緩沖液44. 5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3,1 mmol/L EDTA ；
5、PCR擴增試劑購自大連寶生物公司；
本發明所使用的儀器主要如下
1、PCR擴增儀德國Eppendorf5331 PCR擴增儀；
2、電泳儀北京六一儀器廠DYCZ-20ADNA序列分析電泳儀；
3、離心機德國Eppendorf5810/5810R多功能臺式離心機；
4、凝膠成像系統美國BIO-RADGel Doc 2000凝膠成像系統。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1. 一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括基因組DNA的提取、SCAR-PCR 標記的檢測體系建立和SCAR-PCR產物的檢測，其特征在于SCAR-PCR標記的檢測使用的檢測引物是甘蔗SCAR-F和SCAR-R，其中SCAR-F 是 5' -CTTTGTTTCCCGTAGTGTCTTGT-3'，SCAR-R 是 5’-ATAGCCTGCCTTCTCTCCTTT-3’ ；(2)SCAR-PCR標記的檢測建立SCAR-PCR擴增體系為總體積25 μ I，內含2. 5 μ I 10XPCR 緩沖液，2. 5 μ I 25 mmol/L MgCl2,0. 5 μ I 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L 的檢測引物 SCAR-F 和 SCAR-R 各 I. 0 μ I, I. 25 U Taq DNA Polymerase, 20-50 ng 基因組 DNA， ddH20 補足到 25 μ I ； SCAR-PCR擴增程序如下94 °C 4 min ；94 °C I min，58 °C I min, 72 °C 2 min，30個循環；72 °C 10 min ;所述 10XPCR緩沖液組成成分為 100 mmol/L pH8. 5 Tris-HCl，500 mmol/L KCl 和 15 mmol/L MgCl2 ；(3)SCAR-PCR產物的檢測電泳檢測的SCAR-PCR擴增圖譜中，在分子量為331bp的位置出現DNA條帶,為甘鹿感黑穗病的標志；在分子量為331 bp的位置未出現DNA條帶,為甘蔗抗黑穗病標志。
全文摘要
一種利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法，包括基因組DNA的提取、SCAR-PCR標記的檢測體系建立和SCAR-PCR產物的檢測。本發明的利用SCAR標記鑒定甘蔗抗黑穗病性的方法，具有靈敏度高，所需要的DNA用量少的特點；與常規的人工接種田間抗性鑒定相比，具有操作簡便、檢測時間短、準確性高、容易判斷、重復性好和不受環境條件影響等優點。為甘蔗種質資源的評價和新品種的審定工作，提供了簡便有效的抗黑穗病性鑒定體系，對科研和生產具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102586440SQ20121005154
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者徐景升, 許莉萍, 闕友雄, 陳如凱 申請人:福建農林大學