專利名稱：一種抗菌蛋白has1編碼基因的克隆、表達及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)生的對植物病原菌存在抑菌活性的新抗菌蛋白，更具體地說，涉及一種來源于微生物的新抗菌蛋白的鑒定和應用。本發(fā)明是建立在生防菌株HAS對甘蔗黑穗病菌具有很好抑制作用的基礎之上。
背景技術(shù)：
甘鹿黑穗病是由scitaminea Sydow.引起的一種真菌病害,屬擔子菌綱黑粉菌屬。該病害最早是在1877年南非納塔爾發(fā)現(xiàn)，隨后在東半球的亞洲和非洲的大部分國家均有報道。1940年在美洲阿根廷發(fā)生，隨后西半球也發(fā)生該病害。20世紀70-90年代，夏威夷、弗羅里達、摩洛哥、澳大利亞等國家、地區(qū)也相繼有該病害發(fā)生的報道。中國于1932年在廣州發(fā)現(xiàn)該病害，之后各地也都出現(xiàn)該病。特別是近年來，隨著蔗種無性繁殖栽培技術(shù)的推廣，蔗種頻繁引進調(diào)運，蔗田長期連作同一品種以及宿根蔗年限的逐漸延長，造成甘蔗黑穗病在我國廣西、云南、廣東、福建、海南等省蔗區(qū)發(fā)生日趨嚴重，造成的損失多達10-30%,嚴重的宿根蔗幾乎絕收。甘蔗黑穗病危害嚴重，但對其的防治效果不理想。生物防治因?qū)Νh(huán)境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地發(fā)揮作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滯不前。國內(nèi)外也有利用微生物對甘蔗黑穗病菌孢子進行作用的報道。國外，Sinha和Singh報道四種真菌應 moniliforme [Gibberella fujikuroi] var. subglutinans,Aspergillus ni ger, A. flavus and Penici 11 iums^·)對甘鹿黑穗病的黑鞭的產(chǎn)生和對冬孢子萌發(fā)的抑制作用。國內(nèi)，廣西大學廖詠梅等采集甘蔗苗期、生長期的甘蔗土壤、健株及病株的種蔗、葉、莖、芽、根和土壤中分離篩選到一些對黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相關(guān)基因序列設計特異性引物，探討得到相關(guān)抑制因子的基因。但未見用生物防治措施有效控制黑穗病的系統(tǒng)報道。迄今為止，尚未見到利用微生物及其生防制劑成功用于防治甘蔗黑穗病的相關(guān)報導。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列及其在防治甘蔗黑穗病方面的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案
一種抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具體如
下
長度750bp
類型核酸 鏈型雙鏈 形態(tài)線性
分子類型基因組DNA序列描述
ATGGCGAAACCACTATCAAAGGGGGGAATTTTGATGAAAAAAGTATTGATTGCAGGTGCAGTAGGAACAGCA
GTTCTTTTCGGAACCCTTTCATCAGGTATACCAGGCTTACCAGCGGCAGACGCTCAAGTCGCAAAAGCAGCATCCCA
GCTGCCTAACGGAATCGGCGGCCGTGCCTACCTGAACAGTACGGGCGCCGTTTTTACAGCTAAAATCACGCTTCCTG
AAACTGTCAAAAATAACGACTCGGTCTCTACTCCCTATATTTATTCAGGCTTTAGGGCATCAAGCGGAACTGAAGCC
GATATCGGGCTTCAGTACAGCAAACAATACAACGTCTGGAAGCCCCTCATGAAGGTTGGGTCCAAAAATGAAGAAAC
GTACATCGAAGGAAAAGATAAATTCACATACAATAAAGGCTTCCGCCCTGGAAGCACAGTCCAAATGACAATCTATA
AAAATTTAAGCGGCAATACGCGCATGACCCTTTGGGGAACGAACAATGACGGCTACACCGGAAGGATTATCACAGAA
ATTCAAGGAACCAACATCGGCACGATTTCAAAATGGAAAACCCTTGCTACCGCGGCTGTTTCGTATGAAAGCCAGCG
TGATGCGATCAAAGCAACCTTTTCGACATCTTTTAACAACATCACAATCGACAATAAAGCCGTCACTCCTGTGGTAG
ATACACAGGATTTCGCAAAGGTTTCAGTTGCAGGAAATAACGTTACGATCTCTGTTAATAAAo所述的抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，具體如下
長度250 類型氨基酸 鏈型單鏈 形態(tài)線性 分子類型蛋白 序列描述
MAKPLSKGGILMKKVLIAGAVGTAVLFGTLSSGIPGLPAADAQVAKAASQLPNGIGGRAYLNSTGAVFTAKITLPETVKNNDSVSTPYIYSGFRASSGTEADIGLQYSKQYNVWKPLMKVGSKNEETYIEGKDKFTYNKGFRPGSTVQMTIYKNLSGNTRMTLWGTNNDGYTGRIITEIQGTNIGTISKWKTLATAAVSYESQRDAIKATFSTSFNNITIDNKAVTPVVDTQDFAKVSVAGNNVTISVNK。一種原核表達載體，它含有上述抗菌蛋白編碼基因HASl的基因序列。所述抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的應用，及在轉(zhuǎn)基因作物育種中的應用。本發(fā)明在研究微生物對甘蔗黑穗病進行生物防治時，成功分離到一株對甘蔗黑穗病菌有較好抑制作用和防治效果的生防菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Mcillus sub tills )HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏編號=CGMCC NO. 6590。本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌HAS菌株，分離自我國海南省蔗區(qū)的甘蔗根際土壤，經(jīng)形態(tài)學、培養(yǎng)性狀、常規(guī)生理生化和16S rDNA序列鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌心subti I is)的一個新菌株，命名為枯草芽孢桿菌UaciJAz1Ssubtilis)WkS0本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5· subtilis)WkS的基本生物學特性為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9X1. 8 2. 4 Mm之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。本發(fā)明通過對生防菌株HAS抑菌機理進行研究，成功分離到一種抗菌蛋白，并通過其氨基酸測序結(jié)果推到出其核苷酸序列，進行特異性表達引物的設計，獲得了其全長基因編碼序列。通過原核表達證明該編碼基因表達的蛋白存在生物活性，通過網(wǎng)上比對，該編碼基因序列同枯草芽孢桿菌基因組序列同源性達99%，是一個沒有注釋功能的編碼基因序列，因此暫把該編碼基因命名為HASl，新的抗菌蛋白命名為抗菌蛋白HASl。對于甘蔗黑穗病的防治，到目前為止還沒有一種有效的防治措施，抗病育種被認為是一種最為有效的方法，但由于抗原材料的缺乏，進展緩慢。本發(fā)明的技術(shù)方案一是發(fā)現(xiàn)了一個新的抗菌蛋白，二是可以為今后的抗病育種提供一個新的抗原材料。
圖1為抗菌蛋白HASl編碼基因HASl的PCR擴增，圖中M為Marker，1、2、3為PCR擴增產(chǎn)物；
圖2為原核表達載體pET32a-HASl結(jié)構(gòu) 圖3為編碼序列的網(wǎng)上比對結(jié)果，其結(jié)果表明該序列為枯草芽孢桿菌基因組序列的一部分，但沒有注釋功能，即是一個未知功能的序列；
圖4為抗菌蛋白HASl編碼基因HASl的原核表達，泳道I和2為空白載體；泳道3為Marker ;泳道4、5、6、7、8、9、10分別為加入IPTG誘導2、3、4、5、6、7、8h后的表達結(jié)果；
圖5為表達產(chǎn)物對甘蔗黑穗病菌的抑制活性，左為原始表達載體表達后的產(chǎn)物(用作對照)，右為構(gòu)建有HASl基因序列的表達載體表達廣物；由圖可看出在右側(cè)的表達廣物周圍有一明顯抑制甘蔗黑穗病菌的抑菌圈，而左側(cè)的對照組沒有，這充分說明該表達產(chǎn)物具有抑制甘蔗黑穗病菌的能力，具有生物抑菌活性；
圖6為HASl蛋白的網(wǎng)上同已知毒蛋白的比對結(jié)果，其結(jié)果表明，HASl蛋白與已知的毒蛋白沒有相似性，可以不經(jīng)改造直接使用的蛋白；
圖7為HASl蛋白同網(wǎng)上有致敏性蛋白的比對結(jié)果，結(jié)果表明該蛋白同致敏性蛋白的相似性為0，該蛋白沒有致敏性；
圖8為HASl蛋白同網(wǎng)上有抗營養(yǎng)因子的蛋白的比對結(jié)果，結(jié)果表明該蛋白沒有抗營養(yǎng)因子的特性。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。實施例11、植物病原真菌拮抗菌的篩選及其鑒定
菌株篩選稱取5克根際土壤(我國海南省臨高縣甘蔗黑穗病發(fā)生嚴重的地塊中甘蔗植株的根際土壤)，放入有IOOml無菌水的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后，靜置15min。取Iml稀釋至10_4、10_5、10_6濃度梯度，從各濃度梯度懸浮液中取O. 1ml，用無菌涂棒涂于LB培養(yǎng)基(配方為每升含有蛋白胨10g， 酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉12g，pH7.0 7. 2)平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天，挑取菌落形態(tài)不同的菌株再次劃線純化保存?zhèn)溆?。在倒好的PDA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超凈工作臺內(nèi)晾干后，用無菌牙簽點接篩選純化后的菌株進行對峙培養(yǎng)，篩選抑菌作用最強(抑菌活性最強)的菌株，結(jié)果得到一株對甘蔗黑穗病菌有很強拮抗作用的菌株，將該菌株命名為枯草芽孢桿菌(feci77心HAS，其已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號=CGMCCNo. 6590。菌株HAS的基本生物學特性革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9 X1. 8 2.4 Mffl之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。在LB培養(yǎng)基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。菌株16S rDNA保守序列的測定將篩選得到的菌株(枯草芽孢桿菌UaciJAz1S仰辦HAS)的基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA序列通用引物P0、P6作為引物，PCR擴增出約1. 5kb左右的產(chǎn)物片段，測序結(jié)果表明擴增出的序列長度為1518個堿基；將該序列通過互聯(lián)網(wǎng)比對(http: / /www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/B last, cgi),擴增的片段序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA部分序列的同源性達98%以上，確定該菌株歸屬為枯草芽抱桿菌(也<^77心subtilis、。2、菌株HAS抑菌功能蛋白的分離
將菌株HAS在LB培養(yǎng)基平板上活化，然后接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中170rpm下培養(yǎng)36h，除菌體，在上清液中加入硫酸銨至硫酸銨飽和度80%，4°C冰箱內(nèi)靜置過夜后離心收集蛋白，用O. OlM PBS (磷酸緩沖液，pH7. O)溶解蛋白后將蛋白液分為兩份，一份直接用來做抑菌試驗，另一份100°C水浴30分鐘后離心除去變性蛋白，做抑菌實驗并進行PAGE電泳，結(jié)果經(jīng)100°C水浴30分鐘后的那份蛋白液同不經(jīng)處理的蛋白液具有基本相同的抑菌作用，PAGE電泳后得到單一條帶的蛋白帶，將該蛋白帶切下來后送去測序，得到一個同源性為58%的氨基酸序列，同時推導出其核苷酸序列。
3、抗菌蛋白HASl編碼基因的克隆 通過網(wǎng)上比對，設計引物如下
HASF 5’ -TAAGGATCCATGGCGAAACCACTATCAAAG-3’
HASR: 5’ -GGAGAGCTCTTATTTATTAACAGAGATCG-3’
以菌株HAS基因組DNA為模板，擴增菌株HAS的抗菌蛋白HASl編碼基因片段。預期擴增片段大小為750bp左右。PCR反應體系25 μ L，內(nèi)含IOXbuffer (含1. 5 mmol/L Mg2+) 2. 5μ L, dNTPs(2. 5 mmol/L each) 2 μ L、HASF (10 μ mol/L) I μ L、HASR (10 μ mol/L)lyL、Taq 酶(5 U/μ L) 0· 15 μ L、模板 DNA IyUddH2O 17. 35 μ L。PCR 反應程序為94°C3min，94°C lmin,53°C 50s，72°C lmin，30 個循環(huán)，最后 72°C下延伸 lOmin。所得到的 PCR產(chǎn)物在1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離檢測，將得到的純化PCR產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci，挑陽性克隆并送上海生工生物有限公司測序。對測序結(jié)果序列進行分析，得到了抗菌蛋白HASl編碼基因的全長序列，為一個750bp長片段的完整ORF閱讀框，編碼249個氨基酸，結(jié)果見圖1和2。將該序列用BLAST 軟件在線分析(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/blast/Blast.cgi)進行同源性測定，以確定該編碼序列的同源序列，同時尋找其有關(guān)序列的相關(guān)信息，比對結(jié)果見圖3。經(jīng)過比較其有關(guān)序列信息，該基因序列為枯草芽孢桿菌全基因組序列的一部分，同時該有關(guān)序列的信息表明，該基因是一段沒有被注釋功能的基因，表明該編碼基因表達的產(chǎn)物可能是一個未注釋功能的新的抗菌蛋白。4、抗菌蛋白HASl編碼基因的原核表達及功能驗證
提取陽性克隆質(zhì)粒PMD19-T/HAS1，經(jīng)及麗Y I和5^ I雙酶切后電泳回收小片段，將實驗室保存的原核表達載體pET32a質(zhì)粒同樣經(jīng)及麗Y I和fee I雙酶切后電泳回收大片段，使用連接試劑盒將得到的小片段和大片段進行連接、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達細胞BL2KDE3)，挑取陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒進行酶切驗證，將證實為陽性克隆的菌落接種于裝有200ml新鮮無菌的LB液體培養(yǎng)基(內(nèi)含Amp+50 μ mol/mL和IPTGO. 01 μ mol/mL)的三角瓶中進行擴大培養(yǎng)，在37°C恒溫搖床上170rpm振蕩培養(yǎng)8小時后離心除去菌體，加硫酸銨至80%飽和度，靜置過夜后12000rpm離心收集蛋白，用2ml0. Olmol/L磷酸緩沖液(pH7. O)充分溶解，同時以轉(zhuǎn)入表達載體pET32a的大腸桿菌表達細胞BL21 (DE3)的菌落的培養(yǎng)基收集蛋白為對照，在混有甘蔗黑穗病菌孢子的固體LB平板上，放置兩個滅菌的牛津杯，分別加入上述收集到的兩種蛋白液各100 μ L，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，做抑制甘蔗黑穗病菌的對峙培養(yǎng)試驗。結(jié)果表明，加入抗菌蛋白HASl編碼基因的原核表達產(chǎn)物的牛津杯周圍出現(xiàn)明顯的抑制圈，表明該蛋白液對甘蔗黑穗病菌有抑制活性，而對照組沒有，這充分表明了抗菌蛋白的生物抑菌活性，結(jié)果見圖4和5。5、抗菌蛋白HASl的毒理學分析
以OECD文件為參考，以抗菌蛋白HASl蛋白為目標，在NCBI中檢索已知毒蛋白與其氨基酸相似性進行比較，其結(jié)果見圖6。從圖中可知，抗菌蛋白HASl為一個新的抗菌蛋白，其編碼基因與已知的毒蛋白相似性極低，具有毒性的可能性極小。根據(jù)http://ambl. lsc. pku. edu. cn的資料，對抗菌蛋白HASl的致敏性進行評估，結(jié)果也沒有發(fā)現(xiàn)與致敏序列相似的序列(No Signigicant Similarity was found)(http://ambl. lsc. pku. edu. cn),(見圖 7)。
同樣以OE⑶文件為參考，以抗菌蛋白HASl為目標，在NCBI中檢索已知抗營養(yǎng)因子與其氨基酸相似性進行比較，其結(jié)果見圖8。從圖中可知，新的抗菌蛋白HASl編碼的基因序列同已知的抗營養(yǎng)因子無相似性。綜上分析可知，抗菌蛋白HASl為無毒、無過敏性、無抗營養(yǎng)因子的新型抗菌蛋白，因此其可以作為一種新的抗原材料用在轉(zhuǎn)基因作物的育種上。
權(quán)利要求
1.一種抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.一種原核表達載體，它含有權(quán)利I所述抗菌蛋白編碼基因HASl的基因序列。
4.權(quán)利要求1所述抗菌蛋白編碼基因HASl基因序列在防治甘蔗黑穗病方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌蛋白編碼基因HAS1基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。該序列是以生防菌株HAS為研究對象，經(jīng)過對其抑菌機理的研究得到的，然后以菌株HAS的基因組DNA為模板，并用特異性表達引物進行PCR法擴增得到其編碼基因的全表達序列，隨后構(gòu)建了原核表達載體進行表達，并以甘蔗黑穗病菌為靶標進行了表達產(chǎn)物抑菌實驗，結(jié)果表明其表達產(chǎn)物同樣具有抗甘蔗黑穗病菌的能力，通過網(wǎng)上比對表明該抗菌蛋白是一種新的抗菌蛋白，編碼該抗菌蛋白的基因序列可為今后的抗病育種提供新材料。
文檔編號A01N47/44GK103031309SQ201210553669
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者熊國如, 伍蘇然, 趙更峰, 馮翠蓮, 張樹珍 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所