專利名稱：小反芻獸疫疫苗株病毒熒光rt-pcr檢測用引物和探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及熒光RT-PCR檢測用引物和探針，更具體地說，涉及一種小反芻獸疫疫苗株病毒熒光RT-PCR檢測用弓I物和探針。
背景技術：
小反會獸疫(peste des petits ruminants, PPR)又稱小反會獸假性牛痕,是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒引起的急性、烈性傳染病。小反芻獸疫臨床以突然發熱、口炎、腹瀉和肺炎為特征，主要感染山羊、綿羊及一些野生小反芻動物，對羊，尤其是
山羊危害嚴重。小反芻獸疫于1942年在西非科特迪瓦首次發現，隨后證實該病存在于非洲的尼日利亞、塞內加爾和加納。近年來該病呈蔓延的趨勢，并且越來越明顯，由西非、中非和東非向東擴散，目前已經傳播到西亞和南亞地區，且有上升趨勢。2007年7月，我國西藏自治區阿里地區發生該病，已鑒定為小反芻獸疫病毒IV系。由于發生疫情的西藏阿里地區交通不便、對外交流少，限制了疫區的進一步擴大。但是之前我國從未發生過小反芻獸疫，易感動物的發病率和死亡率都很高，一旦該病傳入內地，經濟損失將是非常巨大的。目前，在西藏防控該病主要采取活疫苗免疫接種的防控措施，輔以一定的抗體監測手段。為了有效防控該病，監測病原的工作顯得異常重要，然而免疫防控中使用的活毒疫苗使得目前的病毒核酸檢測方法實效不大，實際工作中迫切需要鑒別疫苗株和野毒株的核酸檢測方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于，針對上述小反芻獸疫疫苗株病毒檢測困難的問題，提供一種小反芻獸疫疫苗株病毒熒光RT-PCR檢測用引物和探針。本發明解決上述技術問題采用的技術方案是，提供一種小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，所述引物序列包括由上游引物PPrV-YMl和下游引物 PPrV-YM2 組成的引物對，其序列分別為 AGGCAGCAAGCCGCAGA 和 TCCGGTGGTGTCGGAT GTGT，或者所述引物序列包括由上游引物的互補序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互補序列 AGGCCACCACAGCCTACACA 組成的弓 I 物對。在本發明所述的小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，中所述的引物序列包括由上游引物PPrV-YMl位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。在本發明所述的小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物序列中，所述引物序列包括由下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基區、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。本發明還提供一種小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，所述的探針PPrV-YMp序列為CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG，或其互補序列
3GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC。在本發明所述的小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的探針序列中，所述的探針序列包括由探針PPrV-YMp向3’端方向延伸10個堿基區和向5’端方向延伸10 個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。本發明的小反芻獸疫疫苗株病毒熒光RT-PCR檢測用引物和探針，可應用于熒光 RT-PCR檢測，充分結合PCR技術的高效擴增型、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術的快速敏感性，具有結果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本，提高檢查效率等優點，特別適合大規模樣品的快速檢測以及緊急疫情的快速診斷。本發明可解決小反芻獸疫疫苗株和野毒株鑒別檢測的難題，從而可以使動物防疫部門及口岸動植物檢疫部門有針對性的防控該病，準確掌握疫病的發展趨勢。


圖I為小反芻獸疫疫苗株實時熒光RT-PCR引物和探針濃度篩選結果圖。圖2為小反芻獸疫疫苗株實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗檢測曲線圖。圖3為小反芻獸疫疫苗株實時熒光RT-PCR方法的靈敏度試驗檢測曲線圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明通過對我國西藏地區使用的小反芻獸疫活疫苗毒株進行全基因組序列測定，并將其與美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)建立的DNA序列數據庫中公布的西藏分離株病毒基因組序列進行比對分析，選取核酸差異較明顯的區段進行引物和探針的設計與合成，探針的5’端標記FAM熒光報告基團。本發明的用于檢測小反芻獸疫疫苗株病毒核酸的熒光RT-PCR檢測用引物序列包括由上游引物PPrV-YMl和下游引物PPrV-YM2組成的引物對，其序列分別為 AGGCAGCAAGCCGCAGA和TCCGGTGGTGTCGGATGTGT。上述的引物對也可采用由上游引物的互補序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互補序列AGGCCACCACAGCCTACACA組成的引物對代替，或者由上游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、下游引物位置向3’端方向延伸10個喊基區域范圍內得到的引物序列及互補序列等。本發明的用于檢測小反芻獸疫疫苗株病毒核酸的熒光RT-PCR檢測的探針序列包括探針PPrV-YMp序列為CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG及互補序列為 GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC，或該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。引物和探針設計一種用于實時熒光RT-PCR檢測小反芻獸疫疫苗株的特異性引物和探針，其主要特點是上下游長度分別為17bp和19bp的核苷酸，探針長度為23bp的核苷酸，并在5’端標記上FAM熒光基因，3’端標記上TAMARA淬滅基團，最優引物、探針序列如下
PPrV-YMl :5，-AGGCAGCAAGCCGCAGA-3，PPrV-YM2 :5’ -TCCGGTGGTGTCGGATGTGT-3’PPrV-YMp :5’ -CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG-3’將上述引物、探針序列優化組合后，建立檢測小反芻獸疫疫苗株病毒的實時熒光 RT-PCR檢測方法。小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測方法采用以下步驟(I)制備待測模板。小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測方法中的待測模板的制備可采用商品化RNA提取試劑盒或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取各種來源樣品中小反芻獸疫病毒的基因組RNA。(2)反應體系的建立，參照AgPath-ID one-step RT-PCR Kit的說明書配制，采用 25 μ L反應體系，利用系列梯度方陣測定篩選法確定最佳的引物濃度和探針濃度。(3)反應程序的建立，確定最佳的退火溫度。(4)選擇儀器的檢測通道。(5)上機檢測。反應體系的建立和優化利用滅活的小反芻獸疫疫苗株病毒作為待檢樣品，利用商品化RNA提取試劑盒或 Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分裝后置_20°C保存備用。(I)引物濃度的優化。在反應體系中其他條件相同的情況下，將引物濃度分別從 O. I μ M/L倍比稀釋至O. 8 μ M/L，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物濃度終濃度為 O. 4yM/L (圖 I)。(2)探針濃度的優化。在反應體系中其他條件相同的情況下，將探針濃度分別從
O.I μ M/L倍比稀釋至O. 8 μ M/L,通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針濃度終濃度為
O.2yM/L (圖 I)。通過對引物和探針濃度的優化，最后確定采用的實時熒光PCR反應體系為25 μ L， 包括 12.5yL 2Xreal time PCR Buffer(包含有 dNTPs，Mg2+等)，I μ L25Xenzyme mix, 濃度分別為O. 4 μ M/L和0. 2 μ M/L的引物和探針，5 μ L模板，用水補足至25 μ L。根據檢測樣品來源的不同，可適當調整模板用量。RT-PCR反應程序的建立50°C反轉錄30min，94°C 5min終止反轉錄反應；95°C 15s變性反應，在58-60°C之間選擇退火擴增反應溫度并維持45s，重復40個循環，根據使用的儀器不同，應將反應參數作適當調整。最后確定最佳退火溫度為60°C。儀器檢測通道的選擇進行RT-PCR設置反應熒光信號時，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。程序設置好后，點擊運行， 進行PCR反應，反應結束后保存文件，打開分析軟件，分析實驗結果，給出△ Rn (第η個循環時的熒光增加值)與循環數圖像。實施例I(I)待測模板的制備方法一、采用商品化RNA提取試劑盒按照說明書方法進行。
方法二、用Trizol核酸抽提試劑的提取方法a.取小反會獸疫病毒的細胞培養液，滅活后，12000;rpm尚心去除大分子雜質。將 100 μ L上清液加入I. 5ml離心管中，再向其中加入300 μ L的Trizol組織抽提液，于振蕩器上充分振蕩。然后12000rpm離心15min，將上清移至I. 5ml的離心管中；b.向上清中加入400 μ L預冷的異丙醇，在振蕩器上充分振蕩后，12000rpm離心 IOmin,以便獲得RNA沉淀；c.小心倒掉上清，加入600 μ L 75%乙醇，用手上下顛倒數次洗滌。(注意不能劇烈振蕩，防止RNA的斷裂和RNA沉淀溶解后難以重新沉淀)；d. 12000rpm離心IOmin,緩慢吸棄上清，室溫干燥約25min,待乙醇完全揮發后加 25 μ L DEPC水溶解，_20°C保存備用。(2)小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR反應的擴增條件根據已經優化的反應體系來加樣，將加好樣的PCR管放在熒光PCR儀中，設置相應熒光收集條件后進行擴增，反應程序如下50°C 30min,94°C 5min ；95°C 15s,60°C 45s，重復 40個循環。(3)小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測結果在25μ L反應體系中，利用針對小反芻獸疫疫苗株病毒的特異性引物和探針進行實時熒光RT-PCR，檢測含有小反芻獸疫疫苗株病毒基因組RNA的陽性樣品，結果可以得到特異性的熒光曲線。以上試驗結果表明，本發明設計的引物和探針特異性良好，并建立了小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測方法。實施例2小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗在25 μ L反應體系中，同時加入口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、藍舌病病毒(BTV)和小反芻獸疫野毒株的核酸作為模板，運用本發明的特異性引物和探針進行實時熒光RT-PCR檢測，結果只有小反芻獸疫疫苗株有特異性擴增曲線，而FMDV、VSV、BTV和 PPRV野毒株的核酸均無擴增曲線，證實本發明針對PPRV疫苗株病毒的引物和探針具有良好的特異性(圖2)。實施例3小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR方法的靈敏度試驗在25 μ L反應體系中，將小反芻獸疫疫苗株病毒提取核酸測定濃度后，作8個10 倍系列稀釋，進行實時熒光RT-PCR檢測，得到稀釋梯度系列擴增曲線(圖3)，結果發現其可以檢測的最低稀釋度為10_5，相當于濃度為I. 38pg/ μ L的RNA。利用本發明進行檢測，操作簡便快速，一般可在3小時左右完成，而且可以在檢測過程中實時檢測結果，不需要進行擴增產物的電泳觀察，避免了擴增產物之間的污染以及電泳觀察時EB對環境的污染。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換， 都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。
權利要求
1.一種小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述弓I物序列包括由上游弓I物PPrV-YMl和下游弓I物PPrV-YM2組成的弓I物對，其序列分別為 AGGCAGCAAGCCGCAGA和TCCGGTGGTGTCGGATGTGT，或者所述引物序列包括由上游引物的互補序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互補序列AGGCCACCACAGCCTACACA組成的引物對。
2.根據權利要求I所述的小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物PPrV-YMl位置向3’端方向延伸10個堿基、向 5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
3.根據權利要求I或2所述的小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述引物序列包括由下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基區、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
4.一種小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針PPrV-YMp序列為CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG，或其互補序列 GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC。
5.根據權利要求4所述的小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針PPrV-YMp向3’端方向延伸10個堿基區和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
全文摘要
本發明提供了一種小反芻獸疫疫苗株病毒實時熒光RT-PCR檢測的引物和探針序列，所述引物序列包括由上游引物PPrV-YM1和下游引物PPrV-YM2組成的引物對，其序列分別為AGGCAGCAAGCCGCAGA和TCCGGTGGTG TCGGATGTGT，或者所述引物序列包括由上游引物的互補序列TCCGTCGTTCGGCGTCT和下游引物的互補序列AGGCCACCACAGCCTACACA組成的引物對。探針PPrV-YMp序列為CCTGTTTACCGCTGGCGTCTCCG，或其互補序列GGACAAATGGCGACCGCAGAGGC。本發明具有結果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本，提高檢查效率等優點，特別適合大規模樣品的快速檢測以及緊急疫情的快速診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102586483SQ20121005168
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者呂建強, 孫潔, 廖立珊, 張彩虹, 曹琛福, 曾少靈, 楊俊興, 花群義, 阮周曦, 陶虹 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心