專利名稱：一種1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體及其基因與用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化工中的基因工程菌生產1，3_丙二醇化工原料的技術領域，尤其涉及一種催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體及其用途。
背景技術：
1，3_丙二醇是重要的溶劑和化工原料，以其作為單體可用來合成性能優良的聚酯、聚氨酯等縮聚物。近來，由于以1，3_丙二醇和對苯二甲酸為單體合成的聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)具有非常獨特的性質，所以受到國外許多研究機構的重視。目前，化學法合成 I，3-丙二醇專利由荷蘭殼牌(Shell)化學公司和德國Degussa擁有。而生物轉化合成I, 3-丙二醇專利則由美國杜邦(DuPont)公司和德國國家生物技術中心獲得。如1999年杜邦公司與世界第二大工業酶生產商Genencor公司聯合申請了以葡萄糖為底物用基因工程菌直接生產1，3_丙二醇的專利。生物轉化法具有耗能低，可利用可再生資源、清潔生產、成本低等優點，但由于在微生物代謝途徑中與合成1，3-丙二醇相關的酶的催化效率低下，迄今為止，生物合成1，3_丙二醇的產量仍無法與化學合成法的產量相比。在生物轉化甘油合成 1，3_丙二醇的代謝途徑中，需要甘油脫水酶和1，3_丙二醇氧化還原酶，其中甘油脫水酶負責將甘油轉化成中間產物3-羥基丙醛，而I，3-丙二醇氧化還原酶則負責將3-羥基丙醛轉化為1，3-丙二醇。由于1，3-丙二醇氧化還原酶在催化過程中催化活性很差，嚴重限制了生物轉化合成1，3-丙二醇的大規模生產。最近發現在大腸桿菌K12體內存在一個1，3-丙二醇氧化還原酶的同工酶(其對應基因為yqhD)，是甘油代謝途徑中可代替1，3_丙二醇氧化還原酶催化中間產物3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇另一關鍵酶，由其代替1，3-丙二醇氧化還原酶的催化效率明顯高于1，3-丙二醇氧化還原酶的催化效率。本專利發明人在先的專利申請CN20071017175812和CN200710171759. 6中也曾公開了在1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶基因yqhD的基礎上利用突變定向進化技術獲得催化3-羥基丙醛活性更高的變體酶，但提高程度有限，生物轉化合成1，3-丙二醇的大規模產業化還有一定困難。

發明內容
本發明公開了一種能催化3-羥基丙醛生成化工原料1，3_丙二醇的1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶突變體及其基因與用途。本發明的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體是發生了 Q202H突變的1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶。本發明在1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶基因的基礎上，通過在202 氨基酸位點進行飽和突變定向進化技術介導的隨機突變，篩選獲得催化活性獲得進一步提高的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體。其編碼堿基的序列如序列表中SEQ ID NO. I 所示，原1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶基因中編碼第202位的天冬氨酸的密碼子突變為組氨酸的密碼子。所得到的變體基因通過酶動力學曲線的測定，與1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶基因相比較，催化效率顯著提高，為1，3_丙二醇的生物生產提供了廣闊的應用前景。本發明一方面公開了一種1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶突變體，具有催化3-羥基丙醛生成I，3-丙二醇的活性，為含有Q202H突變的I，3-丙二醇氧化還原酶同工酶。進一步的，所述1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶突變體的氨基酸序列由SEQ IDNO I所示序列所編碼。本發明第二方面公開所述1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體的基因，其序列如 SEQ ID NO 1 所示。本發明第三方面公開了所述1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶突變體用于生產1， 3-丙二醇的用途。進一步的，所述1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體用于將3-羥基丙醛催化生成1，3-丙二醇。本發明的優點是創造了一種對3-羥基丙醛具有更高催化活力的I，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因，其突變位點為Gln202Hi s (Q202H)，與I，3-丙二醇還原酶同工酶基因相比較，活性顯著提高，上升了近2. 5倍。該變體基因的獲得為化工原料1，3_丙二醇的生物生產提供了廣闊的應用前景。
具體實施例方式本發明采用飽和突變定向進化技術進化1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶基因，通過在202氨基酸位點設計一對引物，這對引物在設計過程中在202氨基酸位點能夠引入隨機的突變，對模板質粒PET28 a (+) yqhD退火后，通過高保真度的Pfu聚合酶進行PCR擴增， 然后轉化到E. Coli Novablue中，涂布到含有40 μ g/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37°C過夜培養得到相應的突變體庫。從突變體庫中挑取克隆接種到300 μ L含有40 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基的96微孔板中，37°C過夜培養，取40 μ L該過夜培養液加入到一個新的800 μ L含有30 μ g/ mL卡那霉素的LB液體培養基的I. 2mL容積的96微孔板中，在37°C培養至0D_為O. 5
O.7時，加入IPTG (終濃度O. 5mmol/L)誘導并在30°C繼續培養28h，4000r/min離心半個小時收獲細胞，用300 μ L的ρΗ7. 5磷酸鹽裂解緩沖液重懸細胞，在37°C培育30min后，立即置于_80°C冷凍30min,室溫解凍,4000r/min離心30min,吸取300 μ L上清液到一個新的96 微孔分析板中，加入2 μ L200mmol/L 3-羥基丙醛底物(3-羥基丙醛溶解在DMSO中)，在室溫下培育1011^11，然后加201^ 2mg/mL的NADPH啟動反應，在340nm處在線監控吸收值的變化5min，篩選出酶活力高于原酶的菌株并提取質粒進行全自動DNA測序，發現突變位點為 Gln202Hiso以下列舉具體實施例，應理解，實例并非用于限制本發明的保護范圍實施例I飽和突變引物的設計和PCR擴增產物的獲得上游引物5’ -ACACCGTGGAANNNTATGTTACCAAACC-3’ (SEQ ID NO 2)下游引物5’ -GGTTTGGTAACATANNNTTCCACGGTGT-3’ (SEQ ID NO 3)向500 μ L的eppendorf管中加入IOOpmol的dNTPs,各15pmol的上游引物和下游引物，大約2ng ρΕΤ28α (+) yqhD (為將yqhD克隆入ρΕΤ28 α (+)載體獲得，已有多篇文獻報道)作為模板DNA，2. 5U PfuDNA聚合酶，5 μ L的含有25mmol/L的MgCl2的所Pfu PCR緩沖液，然后用無菌蒸餾水加至總體積50 μ L0反應參數是通過95°C變性Imin后，在95°C 30s, 52°C，lmin，72°C lmin，經過20個循環，然后72°C延伸2min，得到PCR擴增產物。突變文庫的構建將上述PCR擴增后的PCR產物用DpnI消化2小時后轉化到E. Coli Novablue中， 涂布到含有40 μ g/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37°C過夜培養得到相應的突變體庫。對3-羥基丙醛具有高催化活性的變體基因的篩選從突變體庫中挑取克隆接種到300 μ L含有40 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基的96微孔板中，37°C過夜培養，取40 μ L該過夜培養液加入到一個新的800 μ L含有30 μ g/ mL卡那霉素的LB液體培養基的I. 2mL容積的96微孔板中，在37°C培養至0D600為O. 5
O.7時，加入IPTG (終濃度O. 5mmol/L)誘導并在30°C繼續培養28h，4000r/min離心半個小時收獲細胞，用300 μ L的ρΗ7. 5磷酸鹽裂解緩沖液重懸細胞，在37°C培育30min后，立即置于_80°C冷凍30min,室溫解凍,4000r/min離心30min,吸取300 μ L上清液到一個新的96 微孔分析板中，加入2 μ L200mmol/L 3-羥基丙醛底物(3-羥基丙醛溶解在DMSO中)，在室溫下培育lOmin，然后加20μ L 2mg/mL的NADPH啟動反應，在340nm處在線監控吸收值的變化5min。通過酶動力學曲線的測定，與1，3_丙二醇還原酶同工酶基因相比較，在測定的一例中活性顯著提高，上升了 2. 5倍。對該菌株提取質粒進行全自動DNA測序，發現突變位點為Q202H，其編碼1，3_丙二醇還原酶同工酶突變體的序列為SEQ ID NO :1。實施例2重組大腸桿菌發酵生產I，3-丙二醇a)挑取實施例I獲得的含有該1，3-丙二醇還原酶同工酶變體基因Gln202His的陽性克隆接入到含有40 μ g/ml卡那霉素的種子培養基中，180r/min，37°C搖床過夜培養 12h。將種子液按2% (v/v)的接種量接入到含有40 μ g/mL卡那霉素的發酵培養基中，180r/ min，37°C搖床培養至菌體0D_約為O. 7-0. 9，加IPTG至終濃度O. 4mmol/L，并添加25g/L濃度底物3-羥基丙醛，于25°C，120r/min發酵培養培養10小時。b)收集發酵液，在3000-5000r/min離心15-30分鐘，收集上清液.加入等體積的有機溶劑氯仿，提取I，3-丙二醇，然后用旋轉增發濃縮提取液用于氣相色譜分析。c) 1，3-丙二醇產量采用氣相色譜法測定。氣相色譜條件為FID檢測器，2mX Φ3πι 不銹鋼填充柱，填料為國產高分子微球⑶X2401 (110目)，載氣為N2，進樣口溫度250°C，柱溫220°C，檢測器溫度250°C。使用外標法定量發酵液中產物，進樣量為2 μ I。實驗結果顯示，當添加底物3-羥基丙醛的初始濃度為25g/L時，用含有1，3-丙二醇還原酶同工酶變體基因Gln202His重組大腸桿菌進行發酵生產1，3_丙二醇，1,3-丙二醇產量可達到20. 6g/ L。因此可以肯定，用含有該1，3_丙二醇還原酶同工酶變體基因Gln202His重組大腸桿菌的確能高效表達1，3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶，并用來發酵生產1，3-丙二醇。
權利要求
1.一種1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體，具有催化3-羥基丙醛生成I，3-丙二醇的活性，為含有Q202H突變的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶。
2.如權利要求I所述1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體，其特征在于,所述I, 3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體的氨基酸序列由SEQ ID NO :1所示序列所編碼。
3.一種1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶突變體的基因，其序列如SEQ ID NO 1所示。
4.如權利要求I或2所述I，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體用于生產I，3-丙二醇的用途。
5.如權利要求4所述1，3_丙二醇氧化還原酶同工酶突變體的用途，其特征在于，所述 1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體用于將3-羥基丙醛催化生成1，3-丙二醇。
全文摘要
本發明公開了一種1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體及其基因與用途，本發明的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶突變體，具有催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇的活性，為含有Q202H突變的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶。所得到的變體基因通過酶動力學曲線的測定，與1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶基因相比較，催化效率顯著提高，為1，3-丙二醇的生物生產提供了廣闊的應用前景。
文檔編號C12N9/04GK102604903SQ20121005565
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者李紅梅, 王偉潔, 鄧龍華 申請人:上海理工大學