專利名稱：一種k562細胞擴增激活nk細胞的方法
技術領域：
本發明屬于免疫學領域，具體是指使用跨膜IL-21，⑶14，⑶19，⑶86和⑶137轉染的K562細胞和低濃度白介素2共同作用定向擴增激活自然殺傷細胞(NK)的方法。
背景技術：
NK細胞治療對腎細胞癌、黑素瘤、肺癌、結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和急性白血病等腫瘤治療有明顯療效。目前NK細胞治療在美國主要用來和手術、化療和放療聯合使用。NK細胞數量和殺傷功能與療效直接相關，治療中存在的問題在于獲得大量NK細胞非常困難。傳統使用的高劑量白介素2激活生長倍數有限，端粒酶活性降低，擴增后的NK細胞殺傷功能低下。本公司之前的發明采用K562細胞轉染跨膜IL-21和CD137復合物解決了這一問題。用該方法擴增的NK細胞純度和活性顯著增強，數量上可以達到臨床治療的需要。然而在腫瘤微環境(tumor microenvironment)中存在有大量的TAMs (腫瘤相關巨噬細胞)和CD19+B細胞，這些細胞為腫瘤細胞的生長提供營養因子。用僅轉染跨膜IL-21 和CD137復合物的K562細胞激活擴增的NK細胞雖然對腫瘤細胞有很強的殺傷能力，對腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞和B細胞的殺傷能力卻很弱。本發明在轉染跨膜IL-21和 ⑶137K562細胞的基礎上，轉染了⑶14、⑶19和⑶86。K562細胞上轉染的⑶14有助于激活NK細胞識別并殺傷腫瘤相關巨噬細胞；轉染CD19有助于激活NK細胞識別并殺傷B細胞；轉染CD86有助于提升NK細胞對腫瘤細胞、微環境中的腫瘤相關巨噬細胞和微環境中的 B細胞的殺傷作用。本發明提供體外擴增和激活NK的方法比用僅轉染跨膜IL-21和⑶137的K562細胞激活擴增NK細胞的方法，擴增的效率高2. 4倍，擴增后的NK細胞對腫瘤相關巨噬細胞的殺傷能力提高了 2. 7倍。動物實驗結果表明與用僅轉染跨膜IL-21和CD137的K562細胞激活擴增的NK細胞相比，采用本發明擴增的NK細胞顯著提高了對小鼠體內腫瘤的殺傷能力。

發明內容
本發明針對現有技術中的不足，提出一種更具有發展潛力的方法，實現NK細胞的擴增。本發明是通過下述技術方案得以實現的一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法，其特征在于包括下述步驟(I)以K562細胞系轉錄穩定表達CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的表達載體，⑶8 α為在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素 21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因；(2)當外源表達載體進入宿主細胞后，激活啟動子，培養Κ562細胞一段時間，即可以得到在細胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；
(3)經培養后的K562細胞膜上具有表達跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137 的細胞，通過強酸，強堿、和/或輻照、及通過高速離心收集K562細胞；或對K562細胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進行純化收集；(4)將上述離心收集的K562細胞與NK細胞、或NK細胞和外周血單核細胞的組合、 或是NK細胞與淋巴細胞的組合、或是外周血單核細胞和其它淋巴細胞的組合、或是白介素 2和/或白介素21和/或⑶14和/或⑶19和/或⑶86和/或⑶137與白細胞的組合進行共同培養、或在純化分離K562細胞后與PBMC共同培養，激活擴增NK細胞，直至NK細胞代表總數的50%以上。作為優選，上述方法的步驟(4)中的培養液為Eagle' s培養液加入10%人血清或10%小牛血清，或RPMI 1640加入10%人血清或10%小牛血清，或F-IO (Ham' s) Nutrient mixtures加入10%人血清或10%小牛血清。作為優選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的劑量在50pM InM;為了更好實現本發明，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的劑量在 500pM 800pM。作為優選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137是經過純化處理的蛋白質，純化的淋巴細胞至少代表總數的50%。作為優選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137組成的淋巴細胞在K562細胞中的表達劑量比例是，K562細胞淋巴細胞=I 10 I。作為更佳選擇，上述方法的淋巴細胞中加入跨膜白介素21-⑶137復合物，且K562細胞淋巴細胞=I I、 2 : 1、3 : I、或 4 I。作為優選，上述方法的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137擴增的NK細胞
過程是通過溶于生理鹽水溶液的方法進行。本發明中跨膜IL-21、CD14、CD19、CD86和CD137轉染的K562細胞對外周血單核細胞(PBMC)和NK細胞擴增和激活有重要的作用。擴增和激活后產生的NK細胞有重要的醫療作用。本發明利用的方法可以得到的足夠數量和功能的NK細胞，是理想的識別和摧毀腫瘤微環境中的腫瘤細胞、CD14+單核細胞和CD19+B細胞，增強病人免疫反應的方法。腫瘤的類型參考前專利(專利申請號CN201110075736)。NK細胞還可以識別和殺傷病原體感染的細胞，其中包括但不限于乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒。本發明中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137、⑶8 α和白介素2是該蛋白質的全部多肽，其中也包括這些蛋白質中具備功能的多肽成分。本發明中的外周血單核細胞來自于外周血，臍帶血和骨髓，是脫離人體的組織。本發明中用于擴增的細胞可以是NK細胞；也可以是NK細胞和外周血單核細胞的不同組合；也可以是NK細胞或外周血單核細胞和別的淋巴細胞的不同組合；也可以是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19 和/或CD86和/或CD137混合物注射進人體血管后所作用的血液中所有白細胞的總和。本發明中的白介素2、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137來源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對象是其它物種，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物種的白介素2、白介素 21、CD14、CD19、CD86 和 CD137。除非另有說明，本發明中所有的技術和科學詞匯的含義是本行業內的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術語的定義在所有分子生物學書中可以找到，例如， Benjamin Lewin, Genes VIII, Oxford University Press,2004(ISBN 0-13-145140-5)。為了確保長期，高收益的生產重組白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137，本發明采用了蛋白穩定表達系統。構建蛋白穩定表達系統是本行業內的具有普通技能的人士所通常采用的技術，具體方法可詳見(Imai等Leukemia，2004，18，676-684)。例如，K562細胞系轉錄了穩定表達⑶8α-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的表達載體，這個載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因，如抗生素抗性基因。CDSa是一種在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白<D14、 ⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白。外源表達載體進入宿主細胞后，用恰當的方法激活啟動子， 培養細胞一段時間后即可以得到在細胞膜上高水平表達的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 ⑶137多肽。這些方法是本行業內的具有普通技能的人士通常理解的方法。在K562細胞膜上高水平表達跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細胞可以通過高速離心的方法收集，K562細胞可以通過這些技術包括但不限于下面所列的方法處理強酸，強堿和輻照。處理后的細胞可以直接與外周血淋巴細胞(PBMC)或NK細胞共同培養，激活擴增NK細胞，也可以純化分離后與PBMC共同培養，激活擴增NK細胞。在細胞膜上高水平表達的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137可以通過本行業內的具有普通技能的人士所熟悉的技術來純化和分離。這些技術包括但不限于下面所列的方法硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質復性的方案可用來幫助純化表達的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進一步純化蛋白質。本發明中在宿主細胞內表達的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137會有一部分分泌到細胞培養上清液中。本行業內的具有普通技能的人士都可以根據普通的生物化學技術來驗證。分泌到細胞培養上清液中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137也可以通過上述方法純化和分離。細胞膜為跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137提供了固相支撐，這固相支撐包括但不僅僅限于金屬、玻璃、塑料、聚合物、顆粒、微小顆粒、磷脂、磷脂雙分子層、細胞膜和類似物。重要的是固相的表面能夠粘附上述蛋白質。跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137也可以通過標準的操縱核苷酸編碼序列的方法來生產。例如，用特定的，非特定的定點突變或其他分子生物學技術來生產功能等同的，但一級結構不相同的多肽。簡單的一個或多個氨基酸修改如果不影響蛋白質的生化特性，這些通過氨基酸保守替換產生的蛋白質也在本發明保護的范圍之內。本發明中轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞擴增的NK細胞，可以用來進行自體移植，也可以進行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴增的細胞可以通過靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應用中，細胞系(例如，NK細胞系，NKT細胞系)也可以通過轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞進行激活和擴增。擴增的細胞系用于制備治療疾病的藥物也是本發明的保護范圍。淋巴細胞或淋巴細胞前體細胞可從來源于包含有大量淋巴細胞和前體細胞的任何組織。例如，外周血(包括臍帶血)，骨髓，脾臟和淋巴結。淋巴細胞或淋巴細胞前體細胞通常取自于外周血或骨髓。在其他應用中(例如，實驗研究)，脾臟和/或淋巴結也是合適的來源。例如，淋巴細胞可以通過抽外周血和/或骨髓來獲得。淋巴細胞可以進一步經過純化得到NK細胞和NKT細胞。純化NK細胞，NKT細胞的步驟和工藝是本行業內的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細胞可以通過密度梯度離心的方式來分離血液或骨髓中的血紅細胞，淋巴細胞和其他細胞。NK細胞和NKT細胞可以利用抗體介導的親和制備方法進一步純化，例如抗體結合磁珠法。純化淋巴細胞并不要求純化的淋巴細胞絕對純,而是指純化的細胞比其在來源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細胞至少代表總數的 50%，或者60%，或者更高。純化的NK細胞和NKT細胞懸浮在一個合適的生理緩沖溶液中， 然后懸浮生長于但不局限于下列培養液中，Eagle' s培養液加入10%人血清，RPMI 1640 加入10%人血清，F-IO (Ham' s)Nutrient mixtures加入10%人血清。人血清也可以用 10%胎牛血清取代，但人血清對NK細胞的擴增效果更好。淋巴細胞和/或純化的淋巴細胞和/或淋巴細胞前體細胞懸浮生長于細胞培養液中，加入輻照后轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞和低劑量白介素 2培養，每周加入新的轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞。通常情況下為了降低成本和避免感染，本發明采用最小的劑量來擴增NK淋巴細胞。白介素2的劑量在50單位/毫升到1000單位/毫升之間。在某些情況下，白介素2復合物的劑量至少在500單位/毫升以上。在某些情況下，有必要進行高劑量的處理，激活濃度約為500單位 /毫升或1000單位/毫升。另外，跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137直接注射入人體，用來在體內擴增NK細胞時，所用劑量在O. 5皮摩到O. 5鈉摩之間。轉染跨膜白介素21、 ⑶14、⑶19、CD86和CD 137的K562細胞的采用劑量按照跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、 ⑶137在K562中的表達劑量來確定。在某些情況下，按照K562 :外周血單核細胞=I 1， 2 1,3 1,4 1或以上加入轉染跨膜白介素21、0)14、0)19、0)86和0)137的1(562細胞。在某些情況下，有必要進行高劑量的處理，按照K562 :外周血單核細胞=10 I或以上加入轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞。在體外擴增的NK細胞可以移植給單核細胞的捐助人本身或者受捐助人，以加強天生或抗原特異性免疫反應。通常情況下，擴增的NK細胞通過溶于生理鹽水溶液的方法靜脈滴注。有益效果本發明通過轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞和低劑量白介素2培養擴增激活的NK提高病人的免疫力來幫助病人抵抗腫瘤，抵抗病毒和細菌。


圖INK細胞體外擴增線性圖，顯示NK淋巴細胞在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、 CD86和CD137的K562細胞和低劑量白介素2共同作用下線性增長，轉染跨膜白介素21和 ⑶137的K562細胞擴增NK細胞作為對照；圖2PBMC細胞體外擴增線性圖，顯示淋巴細胞在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、 CD86和CD137的K562細胞和低劑量白介素2共同作用下線性增長，轉染跨膜白介素21和 ⑶137的K562細胞擴增淋巴細胞作為對照；
圖3PBMC細胞體外擴增前后流示儀數據圖，PBMC細胞在轉染跨膜白介素21、CD14、 ⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞和低劑量白介素2共同作用下培養14天后NK細胞(⑶56+， CD16+和CD56+/CD16+)的比例顯著增長，轉染跨膜白介素21和⑶137的K562細胞擴增 PBMC細胞作為對照；圖4NK細胞殺傷腫瘤細胞圖，人PBMC細胞在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86 和⑶137的K562細胞和低劑量白介素2共同作用下，培養14天后NK細胞對K562腫瘤細胞的殺傷作用，轉染跨膜白介素21和CD137的K562細胞擴增PBMC中的NK細胞作為對照；圖5NK細胞殺傷TAM細胞，人PBMC細胞在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 CD 137的K562細胞和低劑量白介素2共同作用下，培養14天后NK細胞對TAM細胞的殺傷作用，轉染跨膜白介素21和CD137的K562細胞擴增PBMC中的NK細胞作為對照；圖6擴增激活后人NK細胞對小鼠體內PC3腫瘤細胞系的殺傷作用圖，轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的K562細胞和低劑量白介素2共同作用下，培養14天后NK細胞對小鼠體內的PC3細胞有較強的殺傷作用，轉染跨膜白介素21和CD137的K562 細胞擴增PBMC中的NK細胞作為對照圖；圖7轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞和低劑量白介素 2共同作用下擴增PBMC中的NK細胞圖，培養14天后NK細胞顯著提高腫瘤小鼠的存活率和延長小鼠平均壽命，轉染跨膜白介素21和CD137的K562細胞擴增PBMC中的NK細胞作為對照圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施作具體說明以K562細胞系轉錄穩定表達CD8 α -白介素21、⑶14、⑶19、CD86和CD 137的表達載體，⑶8 α為在細胞膜上表達的膜蛋白，CD8a基因連接白介素21基因后使得白介素 21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因；當外源表達載體進入宿主細胞后，激活啟動子，培養K562細胞一段時間，即可以得到在細胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；經培養后的K562細胞膜上具有表達跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細胞，通過強酸，強堿、和/或輻照、及通過高速離心收集K562細胞；或對K562細胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進行純化收集；將上述離心收集的K562細胞與NK細胞、或NK細胞和外周血單核細胞的組合、或是NK細胞與淋巴細胞的組合、或是外周血單核細胞和其它淋巴細胞的組合、或是白介素2和/或白介素21和/或CD14和/或CD19和/或CD86和/或CD137與白細胞的組合進行共同培養、或在純化分離K562細胞后與PBMC共同培養，激活擴增NK細胞，直至NK細胞代表總數的50%以上。實施例I擴增NK細胞。取NK細胞(2xl07)培養在RPMI1640中，輔以10%的人血清。在培養液中加入轉染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD 137的K562滋養細胞(輻照，IOOGy)和白介素2(50 單位/毫升)后培養7天。7天后離心，用等量的培養液重懸，加入經過輻照的轉染跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的K562滋養細胞，再培養7天，如圖I所示。高劑量白介素2(200單位/毫升)作為對照組。如圖I所示，NK細胞在轉染跨膜白介素21、CD14、 ⑶19、⑶86和⑶137的K562細胞和低劑量白介素2的共同作用下，數量顯著增加。細胞數量的增加可以通過插入胸苷的方法來測定。胸苷插入之后細胞繼續培養12小時，然后再開始測量細胞數量的變化。在K562 NK淋巴細胞=I I濃度的作用下NK細胞數量在7 天時進入對數生長期，14天的時約增長了 2200倍。在加入滋養細胞后，NK細胞在50單位 /毫升的白介素2作用下即可開始增長。轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的 K562滋養細胞對于促進NK細胞生長的作用明顯強于轉染跨膜白介素2和CD137的K562滋養細胞(14天時約強2. 4倍)。實施例2跨膜白介素21-⑶137復合物擴增未經純化的外周血淋巴細胞轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞不僅可以擴增純化的NK細胞，還可以擴增未經過純化的淋巴細胞。健康捐獻人的PBMC培養在RPMI1640 中，輔以10%的人血清。在培養液中加入轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的 K562滋養細胞(輻照，IOOGy)和低劑量白介素2后共同培養7天。7天后離心，用等量的培養液重懸，加入經過IOOGy輻照的滋養細胞，再培養7天，如圖2所示。轉染跨膜白介素21 和⑶137的K562滋養細胞作為對照。NK細胞在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 ⑶137的K562滋養細胞和低劑量白介素2的共同作用下，數量顯著增加。NK細胞數量在7 天時進入對數生長期，14天的時約增長了 2100倍。轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86 和CD137的K562滋養細胞對于促進外周血淋巴細胞中NK細胞生長的作用明顯強于轉染跨膜白介素2和CD137的K562滋養細胞(14天時，2. I倍)。在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞和低劑量白介素2共同作用下，第14天時95%的淋巴細胞變成NK細胞(⑶56+，⑶16+，⑶56+/⑶16+)，如圖3所示。對照組細胞在轉染跨膜白介素21和⑶137的K562滋養細胞作用下，外周血淋巴細胞有 91%細胞變成 NK 細胞(CD56+，CD16+，CD56+/CD16+)。實施例3擴增后的NK細胞對腫瘤細胞和TAMs (腫瘤相關巨噬細胞)的裂解作用在轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞和低劑量白介素2共同作用下擴增的NK細胞對腫瘤細胞的裂解作用以前的研究表明給患腫瘤的小鼠注射白介素2能夠增強小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實施例采用轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞和低劑量白介素2共同作用下擴增的NK細胞與腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞共同培養的方法，來研究用擴增的NK細胞進行抗腫瘤的可行性。本實施例采用轉染跨膜白介素21、 ⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞和低劑量白介素2共同作用下擴增的NK細胞注射小鼠體內治療小鼠體內腫瘤的方法，來研究擴增的NK細胞抗腫瘤的效果。將健康捐獻者的淋巴細胞中分離出來后，加入轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、 ⑶86和⑶137的K562滋養細胞和低劑量白介素2共同作用下擴增的NK細胞生長14天。 K562和腫瘤相關巨噬細胞被用來作為裂解的靶細胞。K562是B細胞腫瘤細胞系，該細胞系是血液腫瘤細胞系。IL-4，IL-10和IL-13處理后的單核細胞轉化為腫瘤相關巨噬細胞被用來作為裂解的靶細胞。擴增的NK細胞和靶細胞按照適當的比例共同培養6小時后檢測存活的靶細胞。轉染跨膜白介素21和CD137的K562滋養細胞擴增的NK細胞作為對照組。轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞擴增的NK細胞與對照組NK細胞對K562靶細胞的殺傷作用相當，而對腫瘤相關巨噬細胞的殺傷作用則顯著增強，P < O. 05，如圖5所示。體外用Lentivirus系統構建Fluc報告基因穩定表達的PC3細胞系。Fluc Lentivirus系統購自System Biosciences (美國，加州),具體構建方法詳見產品介紹。 PC3-Fluc細胞靜脈注射進嚴重免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)，21天后熒光檢測器檢測腫瘤的生長情況，隨機分組。擴增后的NK細胞按照IxlO7細胞/每只小鼠自尾靜脈注射，一周兩次。連續治療四周后停止治療，觀察治療效果。圖6顯示治療14天后腫瘤報告基因的熒光信號。轉染跨膜白介素21和CD137的K562滋養細胞擴增的NK細胞對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用。轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞擴增的NK細胞比對照組NK細胞PC3腫瘤細胞的殺傷作用強。圖7顯示，對照組的NK細胞對延長小鼠的存活率有一定的作用。而與對照組相比，轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和 CD 137的K562滋養細胞擴增的NK細胞顯著提高了對腫瘤的治愈率，顯著延長了小鼠的存活率。這提示轉染跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的K562滋養細胞擴增的NK細胞可以用于臨床的腫瘤治療。在本發明的實施例中提供了一個可以用來制成藥物的方案，按照這個方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個方案包括白介素2、白介素21、⑶14、⑶19、⑶86 和CD137。利用本方案擴增的NK細胞適用于需要增強病人免疫力的各種情景。例如，擴增 NK細胞對治療腫瘤特別有效，如急性髓細胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺腫瘤，惡性黑色素瘤和腎細胞惡性腫瘤，但不僅僅限于上述腫瘤。例如，擴增NK細胞對治療細菌，真菌或寄生蟲內感染特別有效。擴增的NK細胞對治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴增的NK細胞可以顯著提高抗原的作用效果O本發明中轉染跨膜白介素21、⑶14、CD19、⑶86和⑶137的K562細胞可用來擴增 NK細胞，也可以移植病人。體外擴增的NK細胞可移植病人。例如，跨膜白介素21、CD14、 ⑶19、⑶86、⑶137和低劑量白介素2擴增激活NK細胞的方法比用僅轉染跨膜IL-21和 ⑶137的K562細胞激活擴增NK細胞的方法，擴增的效率高2. 4倍。兩個星期后，NK細胞的純度可以達到95%，細胞的數量可以達到I. OxIOici以上，滿足臨床治療的需求，如圖4所示。
權利要求
1.一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法，其特征在于包括下述步驟(1)以K562細胞系轉錄穩定表達CD8α -白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和CD 137的表達載體，⑶8 α為在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8 α基因連接白介素21基因后使得白介素21 表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86和⑶137為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因；(2)當外源表達載體進入宿主細胞后，激活啟動子，培養Κ562細胞一段時間，即可以得到在細胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137多肽；(3)經培養后的Κ562細胞膜上具有表達跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137的細胞，通過強酸，強堿、和/或輻照、及通過高速離心收集Κ562細胞；或對Κ562細胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進行純化收集；(4)將上述離心收集的Κ562細胞與NK細胞、或NK細胞和外周血單核細胞的組合、或是 NK細胞與淋巴細胞的組合、或是外周血單核細胞和其它淋巴細胞的組合、或是白介素2和/ 或白介素21和/或⑶14和/或⑶19和/或⑶86和/或⑶137與白細胞的組合進行共同培養、或在純化分離Κ562細胞后與PBMC共同培養，激活擴增NK細胞，直至NK細胞代表總數的50%以上。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(4)中的培養液為Eagle's培養液加入10%人血清或10%小牛血清，或RPMI 1640加入10%人血清或10%小牛血清，或 F-IO (Ham; s)Nutrient mixtures 加入 10%人血清或 10%小牛血清。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86和⑶137 的劑量在50pM InM。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 CD137 的劑量在 500pM 800pM。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 ⑶137是經過純化處理的蛋白質，純化的淋巴細胞至少代表總數的50%。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86 和⑶137組成的淋巴細胞在K562細胞中的表達劑量比例是，K562細胞淋巴細胞=I 10 I。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的淋巴細胞中加入跨膜白介素 21-CD137復合物，且K562細胞淋巴細胞=I 1、2 1、3 I、或4 I。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的跨膜白介素21、CD14、CD19、CD86和 ⑶137擴增的NK細胞過程是通過溶于生理鹽水溶液的方法進行。
全文摘要
本發明屬于免疫學領域，具體是指使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137轉染的K562細胞和低濃度白介素2共同作用定向擴增激活自然殺傷細胞(NK)的方法。本發明是以K562細胞系轉錄穩定表達CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表達載體，CD8α為在細胞膜上表達的膜蛋白，CD8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；然后培養K562細胞一段時間，最后經物理、化學方式得到純化的K562細胞，再對NK細胞進行培養。本發明擴增激活的NK細胞可以提高病人的免疫力，抵抗病毒和細菌；而且效率高。本發明在醫學上具有廣泛用途。
文檔編號C12N5/0783GK102586185SQ201210063090
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者吳忠福, 徐以兵, 董生聚 申請人:浙江中贏方舟生物工程股份有限公司