專利名稱：一種具有低溫活性的外切菊粉酶z2-5及其基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說是一種具有低溫活性的外切菊粉酶Z2-5 及其基因。
背景技術：
菊粉，又稱菊糖，是一類天然果聚糖的混合物，它由果糖分子通過β _2，1糖苷鍵連接，聚合度從2-60，其終端為葡萄糖單位(ETTALI BIM et al. Appl Microbiol Biotechnol, 1987，26: 13-20.)。它廣泛存在于菊芋、Helianthus tuber osus)、牛蒡(Arctium)、菊苣(JOhicory intybus)等多種尚未開發利用的植物中(GoudaM K. Biological Sciences, 2002, 5 (5) 589-593·)。菊粉酶(InulinaSe，EC3. 2. 1.7)，學名β _2，1_D_果聚糖酶，又叫β-果聚糖酶，是一種能降解菊粉成果糖和低聚果糖的多糖水解酶。菊粉酶具有兩種作用方式，一種為外切型，從非還原端逐個水解β _2，1糖苷鍵，生成一分子果糖和少一個果糖單位的果聚糖，最終生成果糖和葡萄糖；另一種為內切型，水解菊粉多糖鏈內部的β_2，1糖苷鍵，產生降低了聚合度的低聚果糖。據不完全統計，產菊粉酶的絲狀真菌有17屬40余種，酵母菌有10 屬20余種，細菌有12屬10余種(楊慧敏，貴州農業科學，2004,32(3) 83-84)。外切菊粉酶可以菊芋作為原料發酵生產酒精，水解菊粉制備高果糖漿。高果糖漿 (HFCS，High Fructose Corn Syrup)，具有冷甜性，風味的不掩蓋性，溶解度高，保健性好等特點，廣泛應用于飲料，雪糕、冰淇淋，烘焙食品，罐頭等食品中(張樂興，廣州食品工業科技，2003，19(1): 44-45)。以菊粉為原料，利用酸法和酶法皆可制備高果糖漿，酸法雖然產量高，成本低，但副產物多，色素重，分離精制困難。若利用菊粉酶制備果糖，其工藝簡單，轉化率高，產物純，果糖含量可達90%以上。具有低溫活性的外切菊粉酶制劑可應用于低溫生境和低溫加工過程，但是，目前所報導的外切菊粉酶多為中溫或高溫酶，具有低溫(0 - 20°C)活性的外切菊粉酶非常少。

發明內容
本發明的目的是提供一種具有低溫活性的外切菊粉酶Z2-5。本發明的再一目的是提供編碼上述外切菊粉酶的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發明所述外切菊粉酶Z2-5可得自鞘氨醇桿菌QSphingobacterium sp. )。Z2_5 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。外切菊粉酶Z2-5總共含501個氨基酸，其中N端22個氨基酸為其預測信號肽序列“MIKLKKYGVLMLLLGVFGTSLA”，成熟的外切菊粉酶Z2-5含479個氨基酸。本發明通過PCR的方法分離克隆了外切菊粉酶Z2-5的編碼基因其全長1506bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TAA。該基因序列如SEQ ID N0. 2所示。經BLAST比對，該外切菊粉酶基因編碼的氨基酸序列與GenBank中Sphingobacterium spiritivorum ATCC 33300來源的潛在外切菊粉酶(ZP_03966816. 1)具有最高的一致性，為 55% ；與確證活性的feciB^s仰力ii/is來源外切菊粉酶(CAA^137. 1)的一致性為47%。本發明還提供了包含上述外切菊粉酶基因的重組載體，優選為 PEASY-El-^0作為本發明的一個最優選的實施方案，將本發明的外切菊粉酶基因插入到質粒pEASY-El上，得到重組大腸桿菌表達質粒pEASY-El-Z -5。本發明還提供了包含上述外切菊粉酶基因的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株見27( ;/ Z2-5。本發明制備外切菊粉酶Z2-5的方法按以下步驟進行
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養重組菌株，誘導重組外切菊粉酶表達；
3)回收并純化所表達的外切菊粉酶Z2-5。其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株見力(DE3) / Z2-5。本發明的外切菊粉酶Z2-5的最適pH7. 0 ；經0. IM pH9. 0緩沖液在室溫處理lh，仍能保持30%以上的活性；最適溫度為40°C，在10°C和50°C下具有大約40%的酶活，在0°C下仍有大約10%的酶活；50°C處理Ih仍能保持30%以上的酶活；能水解蔗糖，果聚糖等底物， 屬于果糖苷鍵水解的反應專一性。以上性質表明外切菊粉酶Z2-5在食品行業有較好的應用潛力。


圖1 在大腸桿菌中表達的重組外切菊粉酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白質Marker ；1 純化的重組外切菊粉酶。圖2 重組外切菊粉酶的最適pH。圖3 重組外切菊粉酶的pH穩定性。圖4 重組外切菊粉酶的最適溫度。圖5 重組外切菊粉酶的熱穩定性。圖6 不同金屬離子及化學試劑對Z2-5酶活的影響測定，表2 重組外切菊粉酶 Z2-5的底物專一性。
具體實施例方式試驗材料和試劑
1、菌株及載體鞘氨醇桿菌如cteri sp.)同文獻報道菌種性質，如中國普通微生物菌種保藏管理中心菌株CGMCC 1. 6855 ；菌株fecAericAia coli BL21(DE!3)購于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑DNA聚合酶及dNTP購自TaKafei公司；pEASY-El購自北京全式金生物技術有限公司；菊粉購自Sigma公司；其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養基LB 培養基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸餾水至 1000ml，pH 自然 (約為7)。固體培養基在此基礎上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例1 鞘氨醇桿菌外切菊粉酶的克隆
提取鞘氨醇單胞菌基因組DNA:將液體培養2d的菌液離心取菌體，加入ImL溶菌酶，37°C處理60min，再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇， 于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。根據外切菊粉酶的保守氨基酸序列(H-N-W-M-N-D-P-N-G和R-D-P-K-V- F-W-H-E-Q-S )設計合成了簡并引物Inu32F禾P Inu32R (表1)。以鞘氨醇單胞菌總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為94°C變性5min ； 然后94°C變性30sec，44°C退火30sec，72°C延伸30sec，30個循環后72°C保溫IOmin。得到一約430bp片段，將該片段回收后與pMD 18-T載體相連，然后送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司測序。根據測序得到的核甘酸序列，設計熱不對稱交錯PCR(簡稱 TAIL-PCR)上游特異性引物4條，并將它們分別命名為uspl、usp2、usp3、usp4 ；另設計下游特異性引物2條，并將它們分別命名為dspl、dsp2 (表1)。特異性引物設計方向為需要擴增的未知區
表1.外切菊粉酶的克隆與表達引物
引物名稱引物序列(5’ 一-3’ )引物長度(bp)Inu32FCCCACAACTGGATGAACganccnaaygg28Inu32RTCTGCTCGTGCCAGAACAcnttnggrtcnc30usplAACCTGCCGTGTTATCTTTATC22usp2GGTACMTGCGATCTTCTGCTC22usp3TGTCCTTCGCTATCCCGACAGAT23usp4TGTCCTTCGCTATCCCGACAGAT23dsplTCTCCGGTAGTGCTGTAATCG21dsp2TTTACCCATCACAATCATCAGG22Z2-5InuEFCAGACGGGACAGCATAAACAAG22Z2-5InuERTTATCTCTTAAATGCAGAAATA22
域方向，sp2的位置設計在spl的內側，sp4的位置設計在sp3的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度為21 -23nt，以uspl、卿2、dspl、dsp2為引物，退火溫度為53°C ；以uspl、usp2為引物，退火溫度分別為60°C和50°C。通過TAIL-PCR得到已知基因序列片段的側翼序列，擴增產物送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司測序。測序結果與已知基因序列片段相拼接，得到外切菊粉酶基因忍_5，該基因序列如SEQ ID NO. 2 所示。 實施例2 重組外切菊粉酶Z2-5的制備
以Z2-5InuEF和Z2-5InuER為引物對(表1 )，鞘氨醇桿菌基因組DNA為模板，進行PCR 擴增。PCR反應參數為94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸 2min, 40個循環后72°C保溫5min，25°C保溫3min。PCR結果得到外切菊粉酶基因ZSS^。將編碼外切菊粉酶的基因忍-5與表達載體pEASY-El相連接，獲得含有外切菊粉酶基因的重組質粒pEASY-El-Z -5并轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株見力(DE3)/ Z2-5。取含有重組質粒pEASY-El-Z -5的五coli BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY -El空質粒的五coli BL21 (DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB(含5(^g/mL Amp)
培養液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB(含50μβ/ mL Amp)培養液中，快速振蕩培養約2 - 3h (OD600達到0.6-1.0)后，加入終濃度0. 7mM的 IPTG誘導，于20°C繼續振蕩培養約20h或振蕩培養約他。12000rpm離心5min，收集菌體。用適量的PH7.0 Tris-Hcl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內濃縮的初酶液經12，OOOrpm離心IOmin后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結果(圖1)表明，重組外切菊粉酶在大腸桿菌中得到了表達，經Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶。實施例3 純化的重組外切菊粉酶Z2-5的性質測定 1、重組外切菊粉酶Z2-5的活性分析
實施例2純化的重組外切菊粉酶Z2-5的活性測定方法采用3，5 一二硝基水楊酸(DNS) 法將底物溶于0. IM緩沖液中，使其終濃度為0. 5% (w/v)；反應體系含100 μ L適量酶液， 900 μ L底物；底物在反應溫度下預熱5min后，加入酶液后再反應lOmin，然后加1. 5mL DNS 終止反應，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長下測定OD值。1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產生1 μ mol還原糖所需的酶量。2、重組外切菊粉酶Z2-5的最適pH和pH穩定性的測定
酶的最適PH測定將外切菊粉酶Z2-5在37°C下和0. IM pH4. 0-9. 0的緩沖液中進行酶促反應。酶的PH穩定性測定將純化的酶液置于0. IM pH4. 0-10. 0的緩沖液中，在室溫下處理Ih以上，然后在pH7. 0及37°C下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為0. IM ρΗ4· 0-5. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，0. IM ρΗ5· 0-8. 0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，0. IM pH8. 0-9. 0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。以菊粉為底物，反應lOmin，測定純化的 Z2-5的酶學性質。結果表明Z2-5的最適pH為7. 0 (圖2)；經pH5. 0-10. 0的緩沖液處理 Ih，酶活剩余約30% (圖3)。3、重組外切菊粉酶Z2-5的最適溫度及熱穩定性測定
酶的最適溫度測定在PH7. 0的緩沖液中，于0-60°C下進行酶促反應。酶的熱穩定性測定將同樣酶量的酶液置于設定的溫度中(30°C，35°C，40°C，45°C，50°C，55°C )處理Ih后， 在pH7. 0及40°C下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以菊粉為底物，反應lOmin， 測定純化的Z2-5的酶學性質。結果表明Z2-5的最適溫度為40°C，在0°C下有約10%的酶活，在10°C和20°C下分別具有大約40%和60%的酶活(圖4);45°C耐受Ih酶活剩余約80%， 50°C耐受Ih酶活剩余30%左右(圖5)。4、重組外切菊粉酶Z2-5的動力學參數測定
酶的動力學參數一級反應時間測定在PH7. 0及40°C下，以0. 3%菊粉為底物，依次在酶促反應的l-15min內終止反應并測定酶活性，計算出酶活性與反應時間的比值，若在一定時間內該比值保持穩定，則此時間為一級反應時間。用0. 07-1. 25mM菊粉為底物，在pH7、 40°C和一級反應時間下，根據Lineweaver-Burk方法測定之、Fmax。經測定，在pH7及40°C下，Z2-5對菊粉的之、Vmas分別為1. 4 mM、138. 9 U/mg。5、不同金屬離子及化學試劑對Z2-5酶活的影響測定
在酶促反應體系中加入IOmM的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。在 40°C、pH7. 0條件下測定酶活性。結果(圖6)表明，IOmM的Hg2+可完全抑制Z2-5 ；Fe3+，Pb2+， Cu2+對Z2-5的抑制較強；EDTA，K+，Na+對Z2-5的抑制較弱Je2+和Mn2+可使Z2-5的酶活分別提高大約1. 5倍和2倍。6、重組外切菊粉酶Z2-5的底物專一性
用0. IM pH7. 0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制0. 5% (w/v)菊粉、蔗糖、果聚糖及淀粉，在pH7. 0及40°C下測定酶活力，結果Z2-5對四種底物都有酶活，以菊粉為底物的酶活是以蔗糖為底物的0. 097倍，說明Z2-5屬于果糖苷鍵水解的反應專一性(表2)。表 權利要求
1.一種具有低溫活性的外切菊粉酶Z2-5，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.一種編碼權利要求1所述的具有低溫活性外切菊粉酶Z2-5的外切菊粉酶基因忍-5，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權利要求2所述的外切菊粉酶基因Z2-5的重組載體。
4.一種包含權利要求2所述的外切菊粉酶基因Z2-5的重組菌株。
全文摘要
本發明涉及一種具有低溫活性的外切菊粉酶Z2-5及其基因。來源于鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp.)的外切菊粉酶Z2-5的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發明提供了編碼上述外切菊粉酶的基因Z2-5，外切菊粉酶基因Z2-5的重組載體和外切菊粉酶基因Z2-5的重組菌株。本發明的外切菊粉酶具有以下性質最適pH7；經0.1MpH9.0緩沖液在室溫處理1h，仍能保持30%以上的活性；最適溫度為40℃，在10℃和50℃下具有大約40%的酶活，在0℃下仍有大約10%的酶活；50℃處理1h仍能保持30%以上的酶活；能水解蔗糖及果聚糖等底物，屬于果糖苷鍵水解的反應專一性。本發明的外切菊粉酶Z2-5可水解菊粉制備高果糖漿，用于食品行業中。
文檔編號C12N15/56GK102559637SQ20121006242
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者周峻沛, 唐湘華, 彭沫溱, 李俊俊, 許波, 黃遵錫 申請人:云南師范大學