專利名稱：一種生物分子的定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子的定量檢測方法，具體是ー種基于核酸雜交鏈式反應(yīng)的生物分子的定量檢測方法。
背景技術(shù)：
對核酸、蛋白質(zhì)等重要生命物質(zhì)進行高靈敏度和高選擇性檢測對于深入掲示其生物功能以及疾病診斷等研究領(lǐng)域都具有十分重要的意義。以核酸分析為例，一些重要的核酸片段往往在人體內(nèi)含量極低，若實現(xiàn)高靈敏度和特異性檢測，通常要用到擴增技術(shù)。核酸擴增技術(shù)主要可分為兩大類溫度循環(huán)擴增和恒溫擴增。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是目前應(yīng)用最為廣泛的溫度循環(huán)核酸擴增技術(shù)，反應(yīng)指數(shù)進行，痕量的核酸分子能夠被擴增到可以檢測的水平。另ー種常用的熱循環(huán)擴增技術(shù)是連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)，在溫度循環(huán)過程中連 接反應(yīng)的產(chǎn)物成為下ー個循環(huán)的反應(yīng)物，因此反應(yīng)的產(chǎn)物在溫度循環(huán)過程中呈指數(shù)増加。然而，基于熱循環(huán)的核酸擴增技術(shù)一般都需要較長的時間，反應(yīng)過程受限于熱穩(wěn)定性的酶，需要精準的控溫，有時特異性也較差。近年來，以滾環(huán)擴增(RCA)技術(shù)為代表的恒溫擴增方法由于可擺脫精準控溫和熱循環(huán)的限制而得到了長足發(fā)展。但與熱循環(huán)擴增類似，RCA等恒溫擴增過程也必須在一種或多種酶的共同作用下才能完成，使得這些擴增技術(shù)都強烈地依賴于所用酶的活性和穩(wěn)定性。雜交鏈式反應(yīng)(Hybridization Chain Reaction, HCR)給核酸擴增技術(shù)帶來了新的突破，該技術(shù)無需任何酶的催化作用，是依靠雜交反應(yīng)的熱力學和動力學原理設(shè)計的恒溫擴增方法。HCR反應(yīng)體系需要兩種亞穩(wěn)態(tài)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)核酸探針(簡稱為Hl和H2)，所謂亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)是指當沒有靶標引發(fā)分子吋，Hl和H2単體能夠各自穩(wěn)定地共存于溶液中，并不發(fā)生反應(yīng)。但當加入起始物靶標引發(fā)分子之后，Hl和H2単體分子會在靶分子作用下依次循環(huán)的打開從而聚合成帶微缺ロ的長鏈雙螺旋核酸結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)對靶標分子的恒溫擴增。由于HCR可實現(xiàn)無酶催化恒溫擴增，反應(yīng)條件簡單，擺脫了常規(guī)擴增技術(shù)對酶穩(wěn)定性和精確控溫等條件的依賴，在核酸研究領(lǐng)域展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。但是，如何通過對HCR產(chǎn)物進行分析并進而給出起始靶標分子的定量信息，目前仍缺乏靈敏、有效的手段。目前已有報道的檢測HCR產(chǎn)物的方法主要有凝膠電泳和熒光標記方法，凝膠電泳檢測方法靈敏度低，無法滿足痕量生物分子的分析要求；Tan等人(Angew. Chem. Int. Ed. ,2011,50,401-404)在Hl及H2探針的兩個末端分別標記上Pyrene熒光分子，HCR反應(yīng)后會形成Pyrene ニ聚體，其熒光發(fā)射波長和強度與Hl或H2単體相比有明顯變化，因此可通過ニ聚體的熒光信息實現(xiàn)對起始引發(fā)分子的定量分析。但該技術(shù)需要在每條核酸探針的兩個末端都進行熒光分子標記，步驟繁瑣，成本較高。但是，若不采用熒光二聚體技術(shù)，而在每個Hl或H2単體上進行常規(guī)單熒光分子標記，則HCR反應(yīng)前后體系的熒光信號不存在差異，無法實現(xiàn)對HCR產(chǎn)物的區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低、靈敏度高，且操作簡單的生物分子的定量檢測方法本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)本發(fā)明所提供的生物分子的定量檢測方法，包括以下步驟(a)依據(jù)靶標生物分子序列，設(shè)計熒光標記的Hl*和H2*探針；(b)將設(shè)定濃度的、標記有熒光基團的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)核酸探針Hl*和H2*溶液分別置于PCR儀上95°C條件下加熱2分鐘，然后在室溫下避光放置I 2小吋，使莖環(huán)結(jié)構(gòu)充分閉合；(c)將靶標生物分子用滅菌水或緩沖液配制成設(shè)定規(guī)格濃度的生物分子溶液；取數(shù)個離心管，分別在各個管中加入不同規(guī)格濃度的生物分子溶液，同時分別加入b步所制備的HI*、H2*溶液，混合均勻后在室溫下進行HCR反應(yīng)；(d)待HCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)步驟(b)中Hl*和H2*的溶液濃度，每個離心管中加入適量的碳材料，使碳材料的用量剛好能夠完全猝滅初始濃度Hl*和H2*単體的熒光信號，室溫反應(yīng)30分鐘后，檢測并記錄體系的熒光信號；(e)通過熒光信號對靶標生物分子進行定量分析。本發(fā)明方法所涉的莖-環(huán)探針単體均采用常規(guī)單熒光分子標記(Hl*，H2*)，在靶標物質(zhì)存在時發(fā)生HCR形成富集眾多熒光基團的長鏈帶微缺ロ的雙螺旋核酸結(jié)構(gòu)；在反應(yīng)體系中加入碳材料用來區(qū)分HCR前后的熒光信號差異。所用碳材料能高效猝滅Hl*和H2*単體的熒光信號，但對HCR產(chǎn)物雙螺旋核酸結(jié)構(gòu)上面的熒光基團猝滅作用顯著降低。因此，體系中靶標生物分子含量越高，形成的HCR產(chǎn)物雙鏈越多，加入碳材料后體系的熒光信號就越強，從而可實現(xiàn)靶標生物分子的定量檢測。本發(fā)明中所述的熒光基團可采用有機熒光染料、半導體熒光量子點或稀土熒光材料中的ー種。緩沖液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、HEPSE緩沖液中的任意ー種，其中緩沖液中NaCl的含量> 0. lmol/L。生物分子為DNA或RNA等各類核酸分子。所述的碳材料可選用氧化石墨烯、石墨烯、碳納米管、碳納米粒子中的任意ー種。本發(fā)明的檢測原理如圖I所示，Hl*和H2*均由ー個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)和一段粘性末端序列組成，粘性末端標記有熒光物質(zhì)；無靶標分子吋，Hl*和H2*分別穩(wěn)定獨立共存于溶液中，并均可吸附在碳材料表面導致熒光信號猝滅；當加入靶標核酸分子(序列為1*_2*)后，靶標與Hl*的粘性末端及莖部序列(序列1-2)完全互補，雜交使Hl*打開，開環(huán)后釋放出的單鏈序列(3-2*)與H2*的粘性末端和莖部序列(3*-2)完全互補，通過雜交反應(yīng)又使H2*莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開釋放出與靶標分子引發(fā)序列完全相同的核酸單鏈(1*_2*)，繼續(xù)使Hl*開環(huán)，如此循環(huán)反復，即能引發(fā)HCR生成帶有缺ロ的長雙鏈，由于雙螺旋本身固有的剛性立體結(jié)構(gòu)，碳材料對雙鏈熒光信號猝滅作用顯著降低，因此產(chǎn)生了熒光信號的差別，從而達到檢測的目的。本發(fā)明的有益效果I、本發(fā)明基于無酶催化核酸恒溫擴增技木，故反應(yīng)條件溫和，可擺脫PCR等常規(guī)核酸擴增技術(shù)對酶及精確控溫的依賴，降低了檢測成本。2、本發(fā)明將HCR對熒光信號的富集放大作用與碳材料對HCR反應(yīng)前、后體系熒光信號的選擇性猝滅作用相結(jié)合，使核酸等生物分子的檢測靈敏度大大提高。其與已有報道的利用GO等碳材料作為熒光猝滅劑的核酸檢測方法相比(Adv. Funct. Mater.，2010，20，453-459)靈敏度提高了兩個數(shù)量級。


圖I為本發(fā)明的檢測原理圖。圖2(a):為本發(fā)明用于不同濃度let_7a microRNA檢測的熒光譜圖。圖2(b):為本發(fā)明用于不同濃度let_7a microRNA定量檢測時，以520nm波長處熒光強度為縱坐標，let-7a濃度為橫坐標繪制的標準曲線圖。圖3 :為本發(fā)明在檢測let_7a microRNA時的特異性熒光譜圖。 圖4(a):為本發(fā)明所述方法用于不同濃度特定序列DNA片段檢測的熒光譜圖。圖4(b):為本發(fā)明所述方法用于不同濃度特定序列DNA片段檢測時，以520nm波長處熒光強度為縱坐標，DNA濃度為橫坐標繪制的標準曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一歩的闡述。這些實施例僅用來闡述本發(fā)明的具體實施方式
，而不是限制本發(fā)明的范圍。閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書中所限定的范圍。本發(fā)明實施例中所用生物材料，其microRNA體系核酸序列信息如表I所示。表I :
名稱序列信息(5’ _3’ )堿基數(shù)質(zhì)譜檢測分子量信息
let-7
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU227101. 2
a
AGTAGGTTGTATAGTTCAAAGTAACTATACAAHI*4414051.0
CCTACTACCTCA-FAM
FAM-ACTTTGAACTATACAACCTACTTGAGGTH2* 44 14112.3_[AGTAGGTTGTATAGTT ___實施例I :(a)以let_7a microRNA為靶標生物分子(從大連寶生物公司購得)，根據(jù)其序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)按照常規(guī)方法設(shè)計FAM熒光標記的Hl*和H2*探針，設(shè)計好的HI*、H2* 探針序列分別為H1* AGTAGGTTGTATAGTTCAAAGTAACTATACAACCTACTACCTCA-FAM ；H2* FAM-ACTTTGAACTATACAACCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT。(b)將濃度為2 ii M的Hl*和H2*單體溶液分別置于PCR儀上95°C加熱2分鐘，然后在室溫避光放置I小時，使莖環(huán)結(jié)構(gòu)充分閉合；
(c)取10個RNase-free的離心管，分別在各管中加入不同濃度的靶標let_7amicroRNA,使各管 let_7a 終濃度依次為 OpM，0. 5pM, IOpM, IOOpM, 500pM, InM, 2nM, 3nM, 4nM,5nM，然后每個離心管中分別加入終濃度為50nM的Hl*和H2*，一定體積的緩沖溶液和水，使各管中的最終反應(yīng)介質(zhì)為200 u L體積的SSP緩沖(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl，pH7. 4)，混合均勻后，避光在室溫下靜置或在搖床上搖晃4小時進行HCR反應(yīng)；(d)在步驟(C)中的每個反應(yīng)管中各加入適量氧化石墨烯(GO)水溶液，使GO在每個反應(yīng)管中的終濃度均為2 5 u g/mL (該用量剛好能夠完全猝滅初始濃度Hl*和H2*単體的突光信號)，混合均勻并室溫反應(yīng)30分鐘后,在突光分光光度計上檢測各管中溶液的突光信號，熒光強度隨let_7a濃度的増加而逐漸增強。檢測結(jié)果如圖2(a)所示。(e)以熒光光譜圖中520nm波長處的強度值為縱坐標，Let_7a濃度為橫坐標繪制標準曲線，如圖2(b)所示，二者成良好的線性關(guān)系。(f)在(e)步驟中繪制標準曲線的基礎(chǔ)上，另取I支RNase-free的離心管，加入200ng從HeLa細胞提取出的總RNA實際樣品，終濃度為50nM的Hl*和H2*，一定體積的緩沖溶液和水，使最終反應(yīng)介質(zhì)為200 u L體積的SSP緩沖(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl，pH7. 4)，混合均勻后，避光在室溫下靜置或在搖床上搖晃4小時進行HCR反應(yīng)；之后加入終濃度為25 ii g/mL的氧化石墨烯(GO)水溶液，混合均勻并室溫反應(yīng)30分鐘后，在熒光分光光度計上檢測溶液的熒光信號并記錄520nm處熒光信號強度，對照(e)中建立的標準曲線，計算出在200 u L終反應(yīng)體積中l(wèi)et-7a的濃度約為133pM，表明該方法可用于實際樣品中microRNA的定量分析。實施例2 (a)以I et_7a mi croRNA為目標檢測分子，根據(jù)其序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)設(shè)計FAM熒光標記的Hl*和H2*探針，序列分別為H1* AGTAGGTTGTATAGTTCAAAGTAACTATAC AACCTACTACCTCA-FAM ;H2* FAM-ACTTTGAACTATACAACCTACTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT ；(b)將濃度為2 ii M的HI*和H2*單體溶液分別置于PCR儀上95°C加熱2分鐘，然后在室溫避光放置I小時，使莖環(huán)結(jié)構(gòu)充分閉合；(c)取4個RNase-free的離心管，分別在各管中加入相同濃度(3nM)的let_7a，let-7b, let-7g, let_7i，另取ー離心管同時做空白對照；然后每個離心管中分別加入終濃度為50nM的Hl*和H2*，一定體積的緩沖溶液和水，使各管中的最終反應(yīng)介質(zhì)為200 y L體積的SSP緩沖(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl，pH7. 4)，混合均勻后，避光在室溫下靜置或在搖床上搖晃4小時進行HCR反應(yīng)；(d)在步驟(C)中的每個離心管中各加入適量氧化石墨烯(GO)水溶液，使GO在每個離心管中的終濃度均為25ii g/mL，混合均勻并室溫反應(yīng)30分鐘后，在熒光分光光度計上檢測各管中溶液的熒光信號。檢測結(jié)果如圖3所示；從圖3可以看出，只有l(wèi)et_7a目標分子能夠產(chǎn)生強烈的熒光信號，而與之同族的let-7b,let-7g, let-7i的響應(yīng)信號非常微弱，均不干擾let_7a的測定，表明該檢測方法具有良好的特異性。實施例4 (a)以一段隨機選定的序列 DNA片段(選自 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2004，15275-15278)為目標檢測分子，根據(jù)其序列(AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA)設(shè)計FAM標記的Hl*和H2*探針，序列分別為H1* FAM-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG ;H2* AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-FAM ；(b)將濃度為2 ii M的HI*和H2*單體溶液分別置于PCR儀上95°C加熱2分鐘，然后在室溫避光放置I小時，使莖環(huán)結(jié)構(gòu)充分閉合； (c)取10支離心管，分別在各管中加入不同濃度的靶標DNA分子，使其終濃度依次為0，0. 5pM, IOpM, IOOpM, 500pM, InM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM,然后每個離心管中分別加入終濃度為50nM的Hl*和H2*，一定體積的緩沖溶液和水，使各管中的最終反應(yīng)介質(zhì)為200 u L體積的SSP緩沖(50mM Na2HPO4,0. 75M NaCl, pH7. 4)，混合均勻后，避光在室溫下靜置或在搖床上搖晃4小時進行HCR反應(yīng)；(d)在步驟⑶中的每個反應(yīng)管中各加入適量氧化石墨烯(GO)水溶液，使GO在每個反應(yīng)管中的終濃度均為25 ii g/ml,混合均勻并室溫反應(yīng)30分鐘后,在熒光分光光度計上檢測各管中溶液的熒光信號，熒光強度隨DNA濃度的増加而逐漸增強。檢測結(jié)果如圖4(a)所示。(e)以熒光光譜圖中520nm波長處的強度值為縱坐標，DNA濃度為橫坐標繪制曲線，如圖4(b)所示，二者成良好的線性關(guān)系。因此可利用標準曲線法對該DNA序列進行定量分析。
權(quán)利要求
1.ー種生物分子的定量檢測方法，其特征在于它包括以下步驟 Ca)依據(jù)靶標生物分子序列，設(shè)計熒光標記的Hl*和H2*探針； (b)將設(shè)定濃度的、標記有熒光基團的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)核酸探針Hl*和H2*溶液分別置于PCR儀上95 ° C條件下加熱2分鐘，然后在室溫下避光放置f 2小吋，使莖環(huán)結(jié)構(gòu)充分閉合； (c)將靶標生物分子用滅菌水或緩沖溶液配制成設(shè)定規(guī)格濃度的生物分子溶液；取數(shù)個離心管，分別在各個管中加入不同規(guī)格濃度的生物分子溶液，同時分別加入b步所制備的HI*、H2*溶液 ，混合均勻后在室溫下進行HCR反應(yīng)； Cd)待HCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)步驟(b)中Hl*和H2*的濃度，每個離心管中加入適量的碳材料，使碳材料的用量剛好能夠完全猝滅初始濃度Hl*和H2*単體的熒光信號，室溫反應(yīng)30分鐘后，檢測并記錄體系的熒光信號； Ce)通過熒光信號對靶標生物分子進行定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物分子的定量檢測方法，其特征在于步驟b中所述的熒光 基團為有機熒光染料、半導體熒光量子點或稀土熒光材料中的ー種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生物分子的定量檢測方法，其特征在于所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、HEPSE緩沖液中的任意ー種，其中緩沖液中NaCl的含量彡0. I mol/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生物分子的定量檢測方法，其特征在于所述的生物分子為 DNA 或 RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生物分子的定量檢測方法，其特征在于所述的碳材料為氧化石墨烯、石墨烯、碳納米管、碳納米粒子中的任意ー種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物分子的定量檢測方法，它包括以下步驟(a)依據(jù)靶標生物分子序列，設(shè)計熒光標記的H1*和H2*探針；(b)將設(shè)定濃度的、標記有熒光基團的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)核酸探針H1*和H2*溶液分別置于PCR儀上95oC條件下加熱2分鐘，然后在室溫下避光放置1~2小時，使莖環(huán)結(jié)構(gòu)充分閉合；(c)將靶標生物分子配制成設(shè)定規(guī)格濃度的溶液；取數(shù)個離心管，分別加入不同規(guī)格濃度的生物分子溶液，同時分別加入H1*、H2*溶液，混合均勻后在室溫下進行HCR反應(yīng)；(d)待HCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)步驟(b)中H1*和H2*的濃度，加入適量的碳材料，室溫反應(yīng)30分鐘后，檢測并記錄體系的熒光信號；(e)通過熒光信號對靶標生物分子進行定量分析。本發(fā)明方法成本低、靈敏度高，且操作簡單。
文檔編號C12Q1/68GK102653789SQ20121006711
公開日2012年9月5日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者劉成輝, 李正平, 楊朗 申請人:河北大學