專利名稱：一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測O1群和O139群霍亂弧菌的非診斷性方法
技術領域：
本發明涉及一種雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測01群和0139群霍亂弧菌的非診斷性方法。
背景技術：
霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的ー種古老且流行廣泛的烈性腸道傳染病，曾在世界上引起多次大流行，患者的臨床癥狀多表現為劇烈的嘔吐，大量米湯狀排泄，會造成迅速脫水；如治療不及時，可導致低血容量休克、酸中毒等，甚至死亡。霍亂弧菌由意大利解剖學家Filippo Pacini在1854年首次分離，屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio),需氧或兼性厭氧菌,革蘭氏陰性,菌體短小,稍彎曲，呈弧形或逗點狀，菌體尾端有鞭毛，運動活潑。霍亂弧菌有多個血清型，其中能夠引起霍亂流行的主要有兩種01群和0139群。自1817年以來，7次全球范圍的霍亂大流行均是由01群霍亂弧菌所引發；1992年印度和孟加拉國首次爆發了非01群霍亂弧菌引起的霍亂流行，目前已陸續波及亞、美、歐三大洲，構成超越國界、洲界的大流行態勢。鑒于霍亂嚴重威脅公眾的生命安全，因此快速、準確和靈敏地檢測霍亂弧菌至關重要。霍亂在我國基本得到有效控制，但發生或流行的潛在威脅依然存在。傳統的霍亂弧菌檢測方法需要先在堿性蛋白胨培養液中進行菌株培養后取上層培養物做弧菌分離鑒定，該檢測方法所需周期長、工作量大，且易受環境、培養條件及主觀因素影響，不利于霍亂弧菌的快速診斷。因此建立ー種快速、敏感、特異的檢測方法對霍亂防治工作具有十分重要的意義。以溶血素基因(hlyA)為探針建立的熒光定量PCR檢測01群和0139群霍亂弧菌的方法，其特異度不高，且能同時檢測出非01群和非0139群霍亂弧菌。 基于SYBR Green的雙重熒光PCR方法特異性檢測01群和0139群霍亂弧菌的方法，需借助熔解曲線來區分特異性擴增與非特異性擴增，這使得在待檢菌株的目的擴增片段因出現堿基突變而影響產物熔解溫度(Tm值)時將很難通過熔解曲線進行判斷，在01群和0139群霍亂弧菌的鑒定應用上有一定的局限性。

發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高的檢測01群和0139群霍亂弧菌的雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測的非診斷性方法。為實現上述目的，本發明ー種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測01群和0139群霍亂弧菌的非診斷性方法，該非診斷性方法包括針對01群和0139群霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設計引物和探針
權利要求
1.一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測Ol群和0139群霍亂弧菌的非診斷性方法，其特征在干，該非診斷性方法包括 針對01群和0139群弧霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設計引物和探針
2.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述探針Ol-P和0139-P的5’端所標記熒光素分別為FAM和HEX，探針3’端均連接淬滅基團；所述該淬滅基團為BHQl非熒光淬滅基團。
3.如權利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該非診斷性方法包括步驟 1)提取細菌染色體DNA； 2)實時熒光RT-PCR反應，配制一定組分濃度的20μ L PCR反應體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中； 3)將待測樣品加入到反應體系中，進行擴增； 4)在退火階段收集熒光信號，檢測Ct值。
4.如權利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述實時熒光RT-PCR反應的體系組分及其體積如下
5.如權利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述01群和0139群弧霍亂弧菌標準品制備的具體步驟包括 1)根據所設計的01群和0139群弧霍亂弧菌引物，分別擴增01群和0139群弧霍亂弧菌全測序菌株N16961和M045的純培養液DNA模板； 2)按照膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段； 3)制備01群和0139群弧霍亂弧菌rfb基因克隆子； 4)提取01群和0139群弧霍亂弧菌質粒后進行插入片段的限制性酶切分析，取呈陽性的酶切反應結果進行克隆質粒測序實驗； 5)01群和0139群弧霍亂弧菌質粒DNA的濃度換算為拷貝數后，將質粒稀釋成若干個濃度梯度備用。
6.如權利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述01群和0139群弧霍亂弧菌全測序菌株N16961和M045的純培養液DNA模板的擴增條件為
7.如權利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述用膠回收純化的DNA片段制備Ol群和0139群弧霍亂弧菌rfb基因克隆子，配制的連接反應體系為
8.如權利要求7所述的非診斷性方法，其特征在干，所述01群和0139群弧霍亂弧菌rfb克隆子制備時，用01F/01R和0139F/0139R對涂有AmplOO的營養瓊脂平板上生長的菌落進行擴增鑒定。
9.如權利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述酶切反應體系如下
10.如權利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述雙酶切鑒定呈陽性的克隆質粒上機測序，序列結果與已知目的序列進行比對；所述實時熒光RT-PCR反應的體系中對01群和 0139群弧霍亂弧菌質粒的檢測下限均為I. OXlO2拷貝/ μ I。
全文摘要
本發明公開了一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測O1群和O139群霍亂弧菌的非診斷性方法，針對O1群和O139群弧霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設計引物和探針，對待檢樣本進行實時定量檢測，該方法對O1群和O139群霍亂弧菌的rfb基因片段非常靈敏，雙重實時PCR的檢測下限比普通PCR高了100倍，能夠達到1.0×102拷貝/μl。雙重實時PCR能夠在一個反應體系中同時檢測兩個基因或者兩種不同的細菌，大大減少了實驗步驟、實驗時間和對試劑的消耗，在實際中，尤其是疫情爆發時有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/04GK102676653SQ201210067180
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者周蕾, 徐寶梁, 李海山, 楊宇, 韓輝 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院