專利名稱：一種重組菌株發酵生產還原性輔酶q10的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法。
背景技術：
還原性輔酶QlO是ー種有效的抗氧化劑，其用途十分廣泛，發達國家除藥品外已廣泛用于食品添加、日化產品、保健品、化妝品等領域。它的藥效眾多，臨床已證實具有消除疲勞、增強體力、抗衰老、免疫調節作用、抗腫瘤作用、緩節帕金森氏癥、治療和緩解神經性 頭痛以及降低阿霉素或他汀類藥物副作用等之功效。還原性輔酶QlO和氧化性輔酶QlO是人體細胞中的線粒體電子傳導系統的構成因子，在氧化磷酸化反應中起到搬運電子的功能，參與ATP的生成。以往大多數人都把氧化性輔酶QlO和還原性輔酶QlO混為ー談，其實還原性輔酶QlO才是真正具有生物活性的抗氧化體。氧化性必需轉換成還原性的CoQlO后才具有抗氧化能力。還原性輔酶QlO可以直接被人體利用，與氧化性輔酶QlO相比在人的新陳代謝中具有更高的生物利用率。近年來對還原性輔酶QlO的研究逐漸增多，目前其制作方法大致如下通過在DMEM-I培養液中進行細胞培養，獲得含有還原性輔酶QlO的細胞液[1]，此方法生產的輔酶QlO成本較高，含量也相對較低。采用化學合成法，但其合成過程煩雜、危險，生產成本高，而且可靠性不高-必須最大限度地降低產生或混入異構體[2]。使用天然生物酶轉化法生產。有專利報道，利用生物還原酶將氧化性輔酶QlO還原成還原性輔酶Q10，但這種方法要求使用純度大于99%的氧化性輔酶Q10[3]。另有報道，將輔酶QlO先磷酸化，再通過生物還原酶還原磷酸化的氧化性輔酶Q10，從而得到還原性輔SIqiom0在抗氧化條件下生產。采用氯化鈣-鎂-水(醇)還原體系，將氧化性輔酶QlO快速制備成還原性輔酶Q10[5]。在還原過程中使用至少ー種選自烴、脂肪酸酷、醚和腈的溶劑保護還原性輔酶QlO免受氧化作用[6]。這些方法效率低，含有較多的氧化性輔酶Q10，用已知的方法分離，回收還原輔酶QlO的成本很高。另外還有利用微生物發酵法生產還原性輔酶QlO的有關報道，篩選產還原性輔酶QlO微生物，得到含有70%以上摩爾含量的還原性菌株，然后利用化學誘變方法提高其產量。但是化學誘變法提高產量有限，且多次誘變才能達到一定效果，耗費大量時間和精力利用基因工程理論改變細胞內代謝調節機制也是獲得高產菌種的ー個重要方法。通過基因重組提高氧化性輔酶QlO產量的成功例子不在少數。Cheong等M將聚十異戊ニ烯焦磷酸(DPS)基因和I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入載體pGPRXll中，通過質粒轉化入Agrobacterium tumefaciensBNQ-pGPRXlI- (KCCM-10554)中表達，得到氧化性輔酶QlO的高產菌，通過發酵エ藝優化后產率達到6. 69mg/g，エ業化生產前景較好。
如上所述，目前尚無通過基因重組得到還原性輔酶QlO高產菌株的例子，更無利用重組還原性菌株進行エ業規模發酵還原性輔酶QlO的報道。如果篩選到還原性輔酶QlO菌株，采用基因重組技術提高其生產能力，無疑對生產還原性輔酶Qio是非常有利的。本發明利用分子生物學技術找到還原性輔酶QlO生產菌株的關鍵酶基因，通過重組DNA技術篩選帶有目標基因的細胞，將目的基因引入生產菌株(如酵母菌等)，增強合成目的產物的能力，構建還原性輔酶QlO發酵重組菌株。利用重組菌株發酵生產還原性輔酶Q10，在從發酵物中回收還原性輔酶Q10，從而安全、高效地獲得エ業規模生產還原性性輔酶QlO的方法。本發明利用高比例還原性菌株(還原性輔酶QlO占70% (摩爾含量)以上)，如Rhodotorula glutinis IF01125、Saitoella complicate IF010748 擴增生產還原性輔酶QlO的關鍵基因如2，3_ ニ甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因、聚十異戊ニ烯 焦磷酸(DPS)基因、I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，通過將帶有目的基因的質粒轉化至突變株中，隨著細胞中合成酶基因拷貝數的増加，可積累較大量的產物。即找出輔酶QlO合成過程中的關鍵酶基因，通過其強化表達就有可能提高產物的產量。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法，提高發酵生產還原性輔酶QlO的產量。本發明的目的還在于提供ー種生產還原性輔酶QlO的重組菌株。ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法，將生產還原性輔酶QlO的基因轉入還原性輔酶QlO比率達到70%以上的菌株，然后采用誘變技木，篩選還原性輔酶QlO比率達到90%以上的菌株，以還原性輔酶QlO比率達到90%以上的菌株為菌種，發酵生產還原性輔酶QlO ;所述還原性輔酶QlO比率是指還原性輔酶QlO占氧化性輔酶QlO和還原性輔酶QlO總和的摩爾百分比。所述生產還原性輔酶QlO的基因為2，3- ニ甲氧基-5-甲基_6_癸異戊烯基苯醌合成酶基因、聚十異戊ニ烯焦磷酸基因、I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因中的ー種或一種以上。所述還原性輔酶QlO比率達到70 %以上的菌株為Saitoellacomplicata (IF010748)> Rhodotorula glutinis(IF0 1125)、Agrobacteriumtumefacience (IFO 13263) > Agrobacterium radiobacter (ATCC47 I 8)、Aspergillus clavatus(JCM1718)、Acetobacter xylinum(IF015237)、Aminobacteraganouensis(JCM7854)、Agromonas oligotrophica(JCM1494)、Acidiphiliummultivorum(JCM8867)>Bulleromyces albus(IF01192)或Bullera armeniaca(IF010112)。所述誘變技術為化學試劑誘變、紫外線照射或離子光束照射。所述化學試劑誘變中的化學試劑為亞硝基胍、甲基磺酸こ酷、硫酸ニこ酯或6-溴尿嘧啶。ー種生產還原性輔酶QlO的重組菌株，該菌株的保藏編號為CGMCC NO. 5668。本發明的重組菌株Rhodotorula glutinis已于2011年12月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO. 5668保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號。本發明的有益效果本發明是微生物發酵法，與其它制備方法相比，生產輔酶QlO具有不受原料限制，原料成本低，分離過程相對簡単，不存在手性問題，易控制及可實現大規模生產的優點，另外，隨著生活水平的提高，人們對純天然產品的崇尚日益増加，化學合成藥物已越來越不受歡迎。本發明的誘變技術可以提高輔酶QlO產量，但單次誘變提高的產量有限，且誘變不確定因素較多，使得篩選工作量巨大，多次誘變能達到一定效果，這樣更是耗費大量時間和精力，基因重組是高產菌株的定向突變途徑，通過基因工程組建的高產菌株，再結合誘變進ー步提高基因重組菌株的產能，能滿足エ業化生產的要求。


圖I為輔酶QlO的峰面積標準曲線。圖2為還原性輔酶QlO和氧化性輔酶QlO的HPLC檢測圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進ー步說明。實施例II、Rhodotorula glutinis (IF0 1125)的基因重組操作步驟如下(I)克隆 Rhodotorula glutinis (IF0 1125) l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (dxslI)gene 和 decaprenyl diphosphate synthase (dps44)gene。(2)設計兩對引物加入酶切位點 BamHI 和 XhoI DXS up :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，， DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3’，DPSup : 5 ’-TTTGGATCCTTGCCGCGCAAGGCGTCA-3， DPSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGTTGAGACGCTCGAT-3，。(3)抽提 Rhodotorula glutinis (IFO 1125)基因組 DNA，通過 PCR 的方法擴增出DXS和DPS基因。(4) DXS和DPS基因末端加A后與T載體進行連接，轉化DH5a，挑克隆搖菌抽提質粒獲得正確的重組質粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上兩個基因片段。(5)用同樣的限制性內切酶BamHI和XhoI酶切原核表達載體PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切產物后用T4連接酶將DXS和DPS兩個基因片段分別與載體連接。(6)將連接產物分兩次轉化Rhodotorula glutinis (IFO 1125),通過氨節青霉素和卡那霉素抗性篩選后獲得DXS和DPS表達的重組菌株。2、重組高產菌株的誘變改良采用亞硝基胍(NTG)化學誘變劑，菌種在28°C，有氧培養48h，離心得到菌體，添加PH7. O磷酸緩沖液，再加入NTG并使其濃度達到200ug/mL，25°C靜置lh。再次離心后，將菌體用O. 9%的生理鹽水沖洗5次，再用O. 9%的生理鹽水懸浮。稀釋懸浮液，涂布于抗性平板和對照平板上，培養3d-5d。誘變之后，為快速篩選高產突變株，采用抗阿霉素和維生素K3的突變株，篩選具有較高還原性輔酶QlO生產能力的菌株(還原性輔酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培養方法和測定方法來評價生產還原性輔酶QlO的能力
菌體培養種子培養基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。發酵培養基(葡萄糖15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g、MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培養方法為將I環生長良好的斜面種子接入裝有50mL種子培養基的250mL錐形瓶中，28V，200r/min往復搖床培養24h (細菌)或48h (酵母)，然后取8mL種子液加入裝有IOOmL發酵培養基的250mL錐形瓶中，于28°C，200r/min往復搖床培養96h。提取檢測4500r/min離心30min,收集菌體,將得到的菌體用constant system的高壓細胞破碎儀(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎壓カ下破碎2次，調制菌體破碎液。加入異丙 醇和η-己烷，在40°C溫度下攪拌30分鐘，提取完后，靜置10分鐘，將上層分離，然后取上清液，旋蒸至干，5ml無水こ醇溶解，放置4°C過夜，過濾后待測。HPLC檢測含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移動相甲醇/こ醇=I I流速lml/min檢出UV275nm柱溫35°C進樣20μ I持續時間還原性輔酶QlO 17. 5分鐘氧化性輔酶QlO 27. 91分鐘上述方法中輔酶QlO的峰面積標準曲線如圖I所示，根據上述標準曲線測得一株高輔酶QlO產量和高還原性輔酶QlO比率的菌株，該菌株酶QlO產量為33. 71mg/g菌液，還原性輔酶QlO比率為93%，還原性輔酶QlO和氧化性輔酶QlO的HPLC檢測結果如圖2所
/Jn ο本實施例的重組菌株Rhodotorula glutinis已于2011年12月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO. 5668保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號。實施例2I、Agrobacterium radiobacter(ATCC4718)的基因重組操作步驟如下(I)克隆 Agrobacterium radiobacter (ATCC4718) l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(dxs)gene 和 l-Deoxy-D-xylulose-D-phospnate reductoisomerase(dxr)gene o(2)設計兩對引物加入酶切位點 BamHI 和 XhoI DXSup :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，, DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3，, DXRup 5，-TTTGGATCCATGACGAATGCCAGTGAA-3， DXRdown 5，-TTTCTCGAGTCACGCGGCCTTTTCTTT-3，。(3)抽提 Agrobacterium radiobacter (ATCC4718)基因組 DNA,通過 PCR 的方法擴增出DXS和DXR基因。(4) DXS和DXR基因末端加A后與T載體進行連接，轉化DH5a，挑克隆搖菌抽提質粒獲得正確的重組質粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上兩個基因片段。
(5)用同樣的限制性內切酶BamHI和XhoI酶切原核表達載體PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切產物后用T4連接酶將DXS和DXR兩個基因片段分別與載體連接。(6)將連接產物分兩次轉化Agrobacterium radiobacter (ATCC4718),通過氨節青霉素和卡那霉素抗性篩選后獲得DSX和DPS表達的重組菌株。2、重組高產菌株的誘變改良采用亞硝基胍(NTG)化學誘變劑，菌種在28°C，有氧培養48h，離心得到菌體，添加PH7. O磷酸緩沖液，再加入NTG并使其濃度達到200ug/mL，25°C靜置lh。再次離心后，將菌體用O. 9%的生理鹽水沖洗5次，再用O. 9%的生理鹽水懸浮。稀釋懸浮液，涂布于抗性平板和對照平板上，培養3d-5d。誘變之后，為快速篩選高產突變株，采用抗阿 霉素和維生素K3的突變株，篩選具有較高還原性輔酶QlO生產能力的菌株(還原性輔酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培養方法和測定方法來評價生產還原性輔酶QlO的能力菌體培養種子培養基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。發酵培養基(葡萄糖1如、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g,MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培養方法為將I環生長良好的斜面種子接入裝有50mL種子培養基的250mL錐形瓶中，28V，200r/min往復搖床培養24h (細菌)或48h (酵母)，然后取8mL種子液加入裝有IOOmL發酵培養基的250mL錐形瓶中，于28°C，200r/min往復搖床培養96h。提取檢測4500r/min離心30min,收集菌體,將得到的菌體用constant system的高壓細胞破碎儀(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎壓カ下破碎2次，調制菌體破碎液。加入異丙醇和η-己烷，在40°C溫度下攪拌30分鐘，提取完后，靜置10分鐘，將上層分離，然后取上清液，旋蒸至干，5ml無水こ醇溶解，放置4°C過夜，過濾后待測。HPLC檢測含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移動相甲醇/こ醇=I I流速lml/min檢出UV275nm柱溫35°C進樣20μ I持續時間還原性輔酶QlO 17. 5分鐘氧化性輔酶QlO 27. 91分鐘上述方法中輔酶QlO的峰面積標準曲線如圖I所示，根據上述標準曲線測得一株高輔酶QlO產量和高還原性輔酶QlO比率的菌株，該菌株酶QlO產量為30. llmg/g菌液，還原性輔酶QlO比率為91%。實施例3I、Rhodotorula glutinis (IFO 1125)的基因重組操作步驟如下(I)克隆 Rhodotorula glutinis(IFO 1125)l-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase(dxs)gene、 decaprenyl diphosphate synthase(dps)gene 和l-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase(dxr)gene。(2)設計三對引物加入酶切位點 BamHI 和 XhoI DXS up :5’-TTTGGATCCTTGACCGGAATGCCACAG-3，， DXSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGCCGGCGAAACCGAC-3’，DPSup : 5 ’-TTTGGATCCTTGCCGCGCAAGGCGTCA-3， DPSdown 5，-TTTCTCGAGTCAGTTGAGACGCTCGAT-3，, DXRup 5，-TTTGGATCCATGACGAATGCCAGTGAA-3， DXRdown 5，-TTTCTCGAGTCACGCGGCCTTTTCTTT-3，
o(3)抽提 Rhodotorula glutinis (IFO 1125)基因組 DNA，通過 PCR 的方法擴增出DXS、DPS 和 DXR 基因。(4) DXS、DPS和DXR基因末端加A后與T載體進行連接，轉化DH5a，挑克隆搖菌抽提質粒獲得正確的重組質粒，再用BamHI和XhoI酶切回收以上兩個基因片段。(5)用同樣的限制性內切酶BamHI和XhoI酶切原核表達載體PET_24_a和PGEX-6P-1，回收酶切產物后用T4連接酶將DXS和DXR兩個基因片段連入載體PET_24_a，DPS基因片段與載體PGEX-6P-1連接。(6)將連接產物分三次轉化Rhodotorula glutinis (IFO 1125),通過氨節青霉素和卡那霉素抗性篩選后獲得DXS、DXR和DPS表達的重組菌株。2、重組高產菌株的誘變改良采用亞硝基胍(NTG)化學誘變劑，菌種在28°C，有氧培養48h，離心得到菌體，添加PH7. O磷酸緩沖液，再加入NTG并使其濃度達到200ug/mL，25°C靜置lh。再次離心后，將菌體用O. 9%的生理鹽水沖洗5次，再用O. 9%的生理鹽水懸浮。稀釋懸浮液，涂布于抗性平板和對照平板上，培養3d-5d。誘變之后，為快速篩選高產突變株，采用抗阿霉素和維生素K3的突變株，篩選具有較高還原性輔酶QlO生產能力的菌株(還原性輔酶QlO比率90%以上)。采用如下所述培養方法和測定方法來評價生產還原性輔酶QlO的能力菌體培養
種子培養基(葡萄糖20g、胨5g、酵母提取物3g、麥芽提取物3g/L，ρΗ6· O)。發酵培養基(葡萄糖1如、蛋白胨10g、酵母提取物5g、KH2P040. 5g、K2HP040. 5g,MgSO4. 7H20 0. 3g/L, pH6. 0)培養方法為將I環生長良好的斜面種子接入裝有50mL種子培養基的250mL錐形瓶中，28V，200r/min往復搖床培養24h (細菌)或48h (酵母)，然后取8mL種子液加入裝有IOOmL發酵培養基的250mL錐形瓶中，于28°C，200r/min往復搖床培養96h。提取檢測4500r/min離心30min,收集菌體,將得到的菌體用constant system的高壓細胞破碎儀(TSO. 75KW)，在80Mpa的破碎壓カ下破碎2次，調制菌體破碎液。加入異丙醇和η-己烷，在40°C溫度下攪拌30分鐘，提取完后，靜置10分鐘，將上層分離，然后取上清液，旋蒸至干，5ml無水こ醇溶解，放置4°C過夜，過濾后待測。HPLC檢測含量淘析柱YMC-Pack4.6 X 250mm移動相甲醇/こ醇=I I流速lml/min
檢出UV275nm柱溫35°C進樣20μ I持續時間還原性輔酶QlO 17. 5分鐘氧化性輔酶QlO 27. 91分鐘上述方法中輔酶QlO的峰面積標準曲線如圖I所示，根據上述標準曲線測得一株高輔酶QlO產量和高還原性輔酶QlO比率的菌株，該菌株酶QlO產量為38. 51mg/g菌液，還原性輔酶QlO比率為95%，
參考文獻[I] 一種還原性輔酶 QlO 的生產方法.[P]· CN200910201918，2011/02/09[2]Biomedical and clinical aspects of coenzyme· 3卷· 19項-30項(頁)1981[O 川][3]還原性輔酶 QlO 的制備方法.[P], CN10143497L2009. 05. 20[4]還原性輔酶 QlO 的制備方法· [P], CN101307338. 2008. 11. 19[5] 一種還原性輔酶 QlO 的制備方法· [P], CN101514148. 2009. 08. 26[6]利用防氧化效果高的溶劑生產還原性輔酶QlO的方法.[P]CN02814136. 9[7]Processes for producing coenzyme Q10. [P]. US2005/0069996A1. 2005. 3. 31[8]Fermentation process for preparing coenzyme QlO by the recomomantAgrobacterium tumefaciens. [P]. US20050181490,2005. 8. 18.
權利要求
1.ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，將生產還原性輔酶QlO的基因轉入還原性輔酶QlO比率達到70%以上的菌株，然后采用誘變技木，篩選還原性輔酶QlO比率達到90%以上的菌株，以還原性輔酶QlO比率達到90%以上的菌株為菌種，發酵生產還原性輔酶QlO ;所述還原性輔酶QlO比率是指還原性輔酶QlO占氧化性輔酶QlO和還原性輔酶QlO總和的摩爾百分比。
2.根據權利要求I所述ー種重組菌株發酵 生產還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，所述生產還原性輔酶QlO的基因為2，3- ニ甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌合成酶基因、聚十異戊ニ烯焦磷酸基因、I-脫氧D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因中的ー種或ー種以上。
3.根據權利要求I所述ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法，其特征在干，所述還原性輔酶QlO比率達到70%以上的菌株為Saitoella complicata、Rhodotorulaglutinis、Agrobacterium tumefacience、Agrobacterium radiobacter、Aspergillusclavatus、Acetobacter xylinum、Aminobacter aganouensis、Agromonas oligotrophica、Acidiphilium multivorum、Bulleromyces albus 或 Bullera armeniaca。
4.根據權利要求I所述ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，所述誘變技術為化學試劑誘變、紫外線照射或離子光束照射。
5.根據權利要求4所述ー種重組菌株發酵生產還原性輔酶QlO的方法，其特征在于，所述化學試劑誘變中的化學試劑為亞硝基胍、甲基磺酸こ酷、硫酸ニこ酯或6-溴尿嘧啶。
6.ー種生產還原性輔酶QlO的重組菌株，其特征在于，該菌株的保藏編號為CGMCCNO. 5668。
全文摘要
本發明公開了屬于分子生物學技術領域的一種重組菌株發酵生產還原性輔酶Q10的方法。該方法是將生產還原性輔酶Q10的基因轉入還原性輔酶Q10比率達到70％以上的菌株，然后采用誘變技術，篩選還原性輔酶Q10比率達到90％以上的菌株，以還原性輔酶Q10比率達到90％以上的菌株為菌種，發酵生產還原性輔酶Q10。本發明通過基因工程組建的高產菌株，再結合誘變進一步提高基因重組菌株的產能，能滿足工業化生產的要求。
文檔編號C12R1/01GK102676595SQ20121006732
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者黨珍, 李明, 糜軍 申請人:蘇州海吉亞生物科技有限公司