專利名稱：一種表達(dá)il-17的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)IL-17的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，具體涉及表達(dá)IL-17的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株pEGFP-Nl-IL-17-U87MG。本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體來說，涉及基因重組細(xì)胞領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
IL-17是新近發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞亞群Thl7的標(biāo)記分子，其最初通過活化的淋巴細(xì)胞庫消減雜交鑒定，且被命名為CTLA-8 (細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原8)。IL-17被證實(shí)與多種病理過程相關(guān)，如自身免疫、感染、過敏、排斥反應(yīng)的。研究表明，IL-17可以激活NF- K B、MAKP-ERK等多條信號途徑，通過促進(jìn)炎癥因子、趨化因子、抗菌肽、組織重構(gòu)分子、基質(zhì)金屬蛋白酶分子的表達(dá)，介導(dǎo)多方面的生物學(xué)活性。同時(shí)，IL-17也被證明與多種腫瘤相關(guān)，目前IL-17被證實(shí)至少可以通過以下途徑促進(jìn)腫瘤I)上調(diào)VEGF、⑶31等因子表達(dá)，從而促進(jìn)血管增生，加速腫瘤生長；2)上調(diào)IL_6，STAT3信號途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展；3)下調(diào)Thl表面IL-12RP2分子表達(dá)，從而下調(diào)Thl細(xì)胞功能，抵抗有效腫瘤免疫；4)使⑶8+細(xì)胞共表達(dá)IL-17，從而失去細(xì)胞毒效應(yīng)，抗凋亡。盡管已證實(shí)IL-17與多種促進(jìn)腫瘤的途徑相關(guān)，但它在腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的具體作用途徑、靶點(diǎn)仍需將進(jìn)一步研究闡明，以期能夠?qū)⑵渥鳛榕R床治療腫瘤疾病的干預(yù)靶點(diǎn)。目前相關(guān)研究人員常以IL-17作為外源物質(zhì)加入腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中或者是將IL-17短期表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中作為研究IL-17在腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的具體作用途徑、靶點(diǎn)的一個(gè)手段；然而這些方法不但不能很直觀地觀察到攜帶有IL-17的作用位點(diǎn)，同時(shí)也影響對IL-17在腫瘤微環(huán)境中作用的深入研究。因此，發(fā)明人希望能夠建立一種表達(dá)IL-17的腫瘤細(xì)胞株，為研究IL-17的促進(jìn)腫瘤形成的作用機(jī)制提供適宜的研究模型材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株為含有編碼IL-17基因的U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，所述的IL-17為免疫細(xì)胞亞群Thl7的標(biāo)記分子。本發(fā)明另一方面提供了一種制備上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的方法，該方法包括以下步驟首先將所述IL-17基因的CDNA與PMD 19_T載體連接構(gòu)建PMD 19-T-IL-17載體；再構(gòu)建pEGFP-Nl-IL-17真核載體；將構(gòu)建的pEGFP-Nl-IL-17真核載體轉(zhuǎn)染U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；篩選成功轉(zhuǎn)染了 pEGFP-Nl-IL-17真核載體的U87MG細(xì)胞株并鑒定。本發(fā)明的表達(dá)IL-17的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，可用于膠質(zhì)瘤研究動(dòng)物模型中，用于觀察穩(wěn)定表達(dá)IL-17狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤情況，同時(shí)可通過熒光標(biāo)簽實(shí)時(shí)觀察到膠質(zhì)瘤細(xì)胞在動(dòng)物模型體內(nèi)位置，為研究IL-17在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了基礎(chǔ)。


圖I為IL_17cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；圖2為鑒定PMD 19-T-IL-17載體的電泳圖譜；圖3為鑒定PMD 19-T-IL-17載體的測序圖譜；圖4為鑒定pEGFP-Nl-IL-17真核載體的電泳圖譜；圖5為鑒定pEGFP-Nl-IL-17真核載體的測序圖譜；圖6為熒光顯微鏡觀察結(jié)果； 圖 7 為定量 PCR 方法檢測 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP-Nl-U87MG、U87MG 培養(yǎng)細(xì)胞IL-17mRNA濃度的對比結(jié)果；圖 8 為 ELISA 方法檢測 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP-Nl_U87MG、U87MG 培養(yǎng)細(xì)胞的IL-17表達(dá)水平的對比結(jié)果。圖9 為 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP_Nl_U87MG、U87MG 三細(xì)胞株注射裸鼠后在39天時(shí)成瘤圖；圖10 為定量 PCR 方法檢測 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP_Nl_U87MG、U87MG 成瘤細(xì)胞中IL-17mRNA濃度的對比結(jié)果。
具體實(shí)施例方式制備表達(dá)IL-17的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株pEGFP-Nl-IL-17-U87MG步驟一IL_17cDNA 合成無菌抽取人外周血2mL，采用Ficoll分離法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再向其中加入 2mL RPMI1640 培養(yǎng)液、50ng/mL 佛波酯(PMA) (CAS NUMBER : 16561-29-8，SIGMA)、lyM 離子霉素(Ionomycin,購自 Catalog Number :19657, SIGMA) > 10 μ g/mL brefeldinA(CASNUMBER :20350-15-6, SIGMA) ;37 °C，5 % CO2 環(huán)境下培養(yǎng) 4h 后，抽提mRNA (按上海生工EZ-10廣譜總RNA抽提試劑盒提取mRNA)對抽提的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，獲得其cDNA (按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑操作說明)，再以該cDNA為模板PCR擴(kuò)增IL-17cDNA。參照NCBI給出的IL-17cDNA參考序列(NM_002190. 2)中的CDS(編碼序列從46-513，ATG-TAA)來設(shè)計(jì)引物。引物序列為上游引5’ -CAGTCGACGATGACTCCTGGGAAGACCTCATTG-3’ (SEQ ID No I);下游引物 5’-GGTGGATCCCGGGCCACATGGTGGACAATCGG-3’ (SEQ ID No :2)。上游引物包含了 Sal I酶切位點(diǎn)，下游引物包含了 BamH I酶切位點(diǎn)。PCR 條件為
Tag0.2 μ
Buffer2
dNTP1.6 μ .
Primers (20μτηο1) 各 0.2 μLcDNA 0.5 μ _PD water_補(bǔ)充至 20 μ ,_
94°C 4min ；94°C 10sec,60°C 20sec, 72°C 20sec ；40 個(gè)循環(huán)，72°C 7min。經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得兩端帶有酶切位點(diǎn)(Sal I、BamH I酶切位點(diǎn))的IL_17cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜參見圖1，目標(biāo)片段(預(yù)期目標(biāo)片段大小為468bp)清晰可見，與預(yù)期相符。紫外燈下，從電泳凝膠中切下目標(biāo)片段，并采用膠純化試劑盒(EZ-lOSpinColumnPAGE Gel DNA Extraction Kit)純化 PCR 產(chǎn)物(IL_17cDNA)。步驟二PMD 19-T-IL-17 載體構(gòu)建將步驟一獲得的IL_17cDNA與PMD 19_T載體連接。具體地說將PMD 19-TSimple Vector (購自 Takara) I μ L、Solution 1(購自 Takara) 5 μ L、步驟一獲得的 IL-17cDNA PCR 產(chǎn)物 4 μ L 混勻，16。。，4 小時(shí)。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將上述獲得的連接產(chǎn)物10 μ L加入到100 μ L的大腸桿菌DH5 α溶液(購自Takara)中，依次在冰上放置30分鐘、42°C水浴90秒、冰上1_2分鐘，再向其中加入500 μ L SOC培養(yǎng)基，37°C水浴慢搖45分鐘，取200 μ L鋪平板(IPTGX-gal，含氨芐青霉素抗性，)37°C過夜。挑選白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。取擴(kuò)大培養(yǎng)后菌液5ml, (5ml菌液12000rpm離心lmin,棄上清，加入250 μ L已加Rnase溶液Pl混勻，加入250 μ L溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次使菌體充分裂解，加入350 μ L溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，12000rpm離心10分鐘，上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中12000rpm離心30-60秒，向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW 12000rpm離心30-60秒，重復(fù)一次，棄廢液后12000rpm( 13，400Xg)離心2分鐘，晾干，向吸附膜的中間部位滴加50-100 μ L洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2分鐘，12000rpm離心I分鐘，質(zhì)粒溶液收集到離心管中)質(zhì)粒抽提試劑購自上海生工(SK8188)，抽提得到的質(zhì)粒經(jīng)Sail，BamHI雙酶切后，電泳。電泳圖譜參見圖2 :圖2中的A條帶參照Marker2(lkb marker),其分子量約為2692,六條帶為卩；\10@19-1 Simple Vector ;圖 2 中的 B 條帶參照 Markerl (DL2000marker),其分子量約為468bp，B條帶為兩端帶有Sal I，BamH I識別序列的IL-17序列。B條帶切下，純化后送上海生工測序。測序結(jié)果參見圖3。從圖3結(jié)果可以看出，從PMD 19-T Simple Vector載體中切下的序列與NCBI給出的IL_17cDNA參考序列(NM_002190. 2)比對，序列完全一致。步驟三pEGFP-Nl-IL-17真核載體構(gòu)建用BamH I及Sal I酶切上述PMD 19-T-IL-17載體及pEGFP-Nl載體。質(zhì)粒(PMD 19-T-IL-17 或pEGFP-Nl)25y L+Sal I 11 μ L+buffer 4 μ L，37°C 4hours，膠回收，25 μ L 水復(fù)溶，再次酶切，質(zhì)粒(PMD 19-T-IL-17、pEGFP-Nl)25y L+BamHI 11 μ L+buffer4μ L，37°C過夜，膠回收，連接上述二個(gè)質(zhì)粒酶切產(chǎn)物buffer2. 5μ L+IL-17 7 μ L+pEGFP-Nl3 μ L+T4 DNA ligase 2 μ L+水10. 5 μ L，16°C，過夜，轉(zhuǎn)化，涂布于卡那霉素抗性平板，挑選菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，酶切及測序鑒定。電泳圖譜參見圖4:圖4中的C條帶參照M2(marker DL 2000)，其分子量約為468bp，C條帶為IL-17 ;圖4中的D條帶參照Ml (marker lkb)，其分子量約為5000bp, D條帶為 pEGFP-Nl。D條帶切下，純化后送上海生工測序。測序結(jié)果參見圖5。從圖5結(jié)果可以看出，pEGPF-Nl-IL-17載體中的IL-17序列與NCBI給出的IL_17cDNA參考序列(NM_02190. 2)比
對，序列完全一致。步驟四pEGFP-Nl-IL-17轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞及鑒定膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG購自中科院上海細(xì)胞庫(ATCC Number HTB-14 )。U87MG細(xì)胞6孔板中培養(yǎng)至1父106(01^] 、21111谷胱甘肽，10%胎牛血清，10(^/1^ penicillin and100 u g/ml streptomycin),更換培養(yǎng)液,次日轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(pEGFP-Nl-IL-17和pEGFP-Nl，其中pEGFP-Nl作為空白對照)與轉(zhuǎn)染試劑(Xfect，購自Takara)按以下體系配置兩個(gè)反應(yīng)體系
①pEGFP-Nl-IL-17 或者 pEGFP-Nl 20 U g Xfect buffer80 U L 混勻②Xfect polymer I. 5 U LXfect buffer 98. 5 U L 混勻?qū)ⅱ俸廷诨靹颍鹗?0秒，室溫10分鐘，滴加到U87MG的細(xì)胞培養(yǎng)液(2ml，濃度I X IO6個(gè)/ml)中，輕搖，37°C 4小時(shí)，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液2ml，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)36hour后，熒光顯微鏡觀察。見到熒光表達(dá)后，按預(yù)實(shí)驗(yàn)界定濃度加入200 ii g/mL的G418 (100mg/mL,Takara) 2 U L,繼續(xù)培養(yǎng)10天，未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞死亡。有限稀釋法篩選陽性轉(zhuǎn)染單克隆(細(xì)胞消化后，稀釋至< I個(gè)/IOii L，加于96孔板中，每孔10 u L，顯微鏡下觀察，標(biāo)記有細(xì)胞孔，培養(yǎng)10天后，200倍的熒光顯微鏡下觀察，標(biāo)記熒光陽性孔)。熒光觀察結(jié)果參見圖6，圖6A為pEGFP-Nl-IL-17-U87MG，圖6B為PEGFP-N1-U87MG,圖 6C 為未轉(zhuǎn)染 U87MG ;可以看出 pEGFP-Nl-IL-17 及 pEGFP-Nl 均分別成功轉(zhuǎn)染至U87MG細(xì)胞。。 將上述熒光陽性孔的細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入6孔板，最后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng))。pEGFP-Nl-IL-17及pEGFP_Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞，經(jīng)單克隆篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)，采用熒光定量PCR、具體如下細(xì)胞I X 106，離心，沉淀加ImL Trizol試劑，混勻，靜置IOmin,加入0. 2mL氯仿，震蕩混勻30sec,靜置5min,4°C 12000rpm離心15min,吸取上清至另一I. 5mL Eppendorf管中，加入半量體積無水乙醇,混勻，液體全部轉(zhuǎn)移入RNA抽提柱中，靜置5min,4°C IOOOOrpm 3min,加入 0.5mL 75% 乙醇，靜置 2min, 4°C IOOOOrpm lmin,重復(fù)一次，RNA 抽提柱再 4°C IOOOOrpm 3min,靜置 5min，35 u L DEPC 水溶解，靜置 3min，4°C IOOOOrpm2min，收集RNA溶液。采用定量PCR(Real time PCR)方法檢測 pEGFP-Nl-IL-17_U87MG、PEGFP-N1-U87MG、U87MG 培養(yǎng)細(xì)胞中 IL_17mRNA 的濃度；上游引物5’ -CTGAACATCCATAACCGGAATACCA-3’ (SEQ ID No 3)；下游引物5’ -AGCGITGATGCAGCCCAAG-3’ (SEQ ID No 4)；定量PCR 條件95 0C 30sec ；95 V IOsec, 60 V 20sec, 40repeats ；95°C 60°C 95°C ;觀察熔解曲線。RNA量nomarlized to GAPDH,結(jié)果以2_A AGT計(jì)算(定量PCR計(jì)算的方法)，結(jié)果參見圖7，圖7縱坐標(biāo)表示IL-17mRNA/GAPDH RNA表達(dá)量，橫坐標(biāo)1、2、3分別為 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP_Nl_U87MG、U87MG 的 IL_17mRNA ;從圖 7 可以看出，PEGFP-N1-IL-17-U87MG細(xì)胞成功獲得了外源基因IL-17的表達(dá)。
經(jīng)2-δ Δετ計(jì)算轉(zhuǎn)染株pEGFP-Nl-IL-17-U87MG之IL_17mRNA表達(dá)量相對于轉(zhuǎn)染空載體 pEGFP-Nl-U87MG、未轉(zhuǎn)染株 U87MG 分別為 1012858 及 1264381 倍。采用ELISA 方法檢測 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP-Nl_U87MG、U87MG 培養(yǎng)細(xì)胞的IL-17表達(dá)水平。將細(xì)胞培養(yǎng)液2ml濃度調(diào)整至I X IO6個(gè)/ml后，再培養(yǎng)三天后檢測上清中IL-17濃度。(上清加入板中，37°C孵育90min，洗板5次，加入生物素化抗體工作液100 μ L，37°C 60min,洗板5次，加入酶結(jié)合工作液100，37°C 30min,洗板5次，加入顯色底物100 μ L，37°C 15min,加入終止液100 μ L/，酶標(biāo)儀讀板。)結(jié)果參見圖8，圖8縱坐標(biāo)表示IL-17濃度，橫坐標(biāo)表示pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP-Nl-U87MG、U87MG，從圖8中可以看出，轉(zhuǎn)染重組載體pEGFP-Nl-IL-17組、轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-Nl組、未轉(zhuǎn)染U87MG組分別為391. 2±65· 7pg/ml、17. 3±3. 62pg/ml、16. 2±6. 2pg/ml (η = 3 ;p < 0· 001)。從圖7、圖8的結(jié)果可以看出，熒光定量PCR、ELISA方法鑒定顯示pEGFP-Nl-IL-17及pEGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞成功。應(yīng)用實(shí)施例pEGFP-Nl-IL-17-U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)構(gòu)建成功的pEGFP-Nl-IL-17-U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)液O. ImL (濃度IX IO6個(gè)/ml)，皮下注射裸鼠右側(cè)背部，在39天處死裸鼠。pEGFP-Nl-U87MG、U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株作為對照，同樣按上述操作。參見圖9，為 pEGFP-Nl-IL-17-U87MG、pEGFP_Nl_U87MG、U87MG 三細(xì)胞株注射裸鼠后在39天時(shí)成瘤圖。在39天處死裸鼠之后，取瘤組織，提取RNA，采用定量PCR(Real time PCR)方法檢測IL-17mRNA的濃度。參見圖10，縱坐標(biāo)表示IL-17mRNA/GAPDH RNA表達(dá)量。pEGFP-Nl-IL-17-U87MG細(xì)胞成瘤的瘤組織中IL_17mRNA的表達(dá)較pEGFP-Nl-U87MG及U87MG成瘤的瘤組織中高，超過1500倍。從圖9、10可以看出，39天后膠質(zhì)瘤細(xì)胞pEGFP-N I -1L-17_U8 7MG在裸鼠體內(nèi)在IL-17高表達(dá)狀態(tài)下成瘤。
權(quán)利要求
1.一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，其特征在于該細(xì)胞株為含有編碼IL-17基因的U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，所述的IL-17為免疫細(xì)胞亞群Thl7的標(biāo)記分子。
2.一種制備權(quán)利要求I所述膠質(zhì)瘤細(xì)胞株的方法，其特征在于該方法包括以下步驟首先將所述IL-17基因的cDNA與PMD 19_T載體連接構(gòu)建PMD 19-T-IL-17載體；再構(gòu)建pEGFP-Nl-IL-17真核載體；將構(gòu)建的pEGFP_Nl-IL_17真核載體轉(zhuǎn)染U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；篩選成功轉(zhuǎn)染了 pEGFP-Nl-IL-17真核載體的U87MG細(xì)胞株并鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株為含有編碼IL-17基因的U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，所述的IL-17為免疫細(xì)胞亞群Th17的標(biāo)記分子。本發(fā)明的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株可用于膠質(zhì)瘤研究動(dòng)物模型中，用于觀察穩(wěn)定表達(dá)IL-17狀態(tài)下膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成瘤情況，同時(shí)可通過熒光標(biāo)簽實(shí)時(shí)觀察到膠質(zhì)瘤細(xì)胞在動(dòng)物模型體內(nèi)位置，為研究IL-17在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/10GK102634485SQ201210068330
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者姜寧, 王國增, 胡錦輝, 鄭景存 申請人:上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院