專利名稱：蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，尤其涉及一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
蠟樣芽胞桿菌是一種桿狀、產生芽孢的革蘭氏陽性細菌，由于蠟樣芽胞桿菌自然界分布甚廣，常存在于土壤、飛塵、腐草和空氣中，極易在食品加工、運輸、存儲、銷售過程中，通過蒼蠅、蟑螂等昆蟲和不衛生的用具和手污染。在臨床上可導致膿腫、腦膜炎、骨髓炎、心內膜炎等報道，但最常見的是導致不同類型的食物中毒腹瀉型和嘔吐型。阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)是腸桿菌科的一種，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌。
阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和茵血癥，死亡率高達50%以上。金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表。金黃色葡萄球菌致病力強弱主要取決于其產生的侵襲性酶和毒素，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染，中毒癥狀嚴重，主要表現為嘔吐、發熱、腹瀉。國際上通用的金黃色葡萄球菌采用培養檢測如下(I)樣品處理無菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質，制 成10-1稀釋液。(2)增菌培養將10-1稀釋液接入7. 5% NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37°C培養24小時。(3)分離培養將上述稀釋液或培養液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37 0C培養24 48小時。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2 3mm，顏色灰或黑色，周圍
有一渾濁帶。(4)染色觀察從平板上挑取可疑性菌落進行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無芽胞、莢膜，直徑0. 5 I y m。(5)血漿凝固酶試驗吸取0. 5mL兔血漿與0. 5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時培養物充分混勻，置36土1°C培養，每隔半小時觀察一次，連續觀察6小時，出現凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。(6)耐熱核酸酶試驗將24小時肉湯培養物沸水浴處理15min，用接種環劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，36± I°C培養24小時，在刺種線周圍出現淡粉色者為陽性。本試驗金黃色葡萄球菌為陽性。阪崎腸桿菌采用培養法檢測如下
(I)前增菌和增菌取檢樣IOOg(mL)加入已預熱至44°C裝有900mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手緩緩地搖動至充分溶解，36°C ±1°C培養18h±2h。移取ImL轉種于IOmL ST-Vm肉湯，440C ±0. 5°C培養 24h±2h。⑵分離輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養物，各取增菌培養物I環，分別劃線接種于兩個阪崎腸桿菌顯色培養基平板，36 °C ±1°〇培養2處±211。挑取I個 5個可疑菌落，劃線接種于TSA平板。25°C ±1°C培養 48h±4h。
⑶鑒定自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進行生化鑒定。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統。(4)結果與報告綜合菌落形態和生化特征，報告每IOOg(HiL)樣品中檢出或未檢出阪崎腸桿菌。根據上述通用方法，同時檢測樣品中蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌這三種細菌的周期長(至少48小時)、操作煩瑣、靈敏度低、易污染、程序復雜和所需試劑(生化試驗試劑和血清)繁多等缺點已遠遠不能滿足快速檢測蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的要求。

發明內容
有鑒于此，本發明提供一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，解決現有技術中同時檢測蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌靈敏的低，周期長等技術問題，以及蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的檢測方法。本發明是這樣實現的，一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液,所述PCR反應液包括第一反應液、第二反應液及石臘,所述第一反應液中包括蠟樣芽孢桿菌正向引物、蠟樣芽孢桿菌反向引物、蠟樣芽孢桿菌探針、阪崎腸桿菌第一引物、阪崎腸桿菌第二引物、阪崎腸桿菌探針、金黃色葡萄球菌第一引物、金黃色葡萄球菌第二引物、金黃色葡萄球菌探針，所述蠟樣芽孢桿菌正向引物序列如SEQ ID NO :1所示，蠟樣芽孢桿菌反向引物序列如SEQ ID NO :2所示，蠟樣芽孢桿菌探針序列如SEQ ID NO :3所示，阪崎腸桿菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，阪崎腸桿菌第二引物序列如SEQ ID NO 5所示，阪崎腸桿菌探針序列如SEQ ID NO :6所示，金黃色葡萄球菌第一引物序列如SEQ IDNO 7所示，金黃色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO 8所示，金黃色葡萄球菌探針序列如 SEQ ID NO :9。本發明進一步提供一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法，包括如下步驟提供蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品；進行熒光定量PCR檢測，該熒光定量PCR檢測步驟中使用前述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒。
本發明蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒及檢測方法能同時檢測蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，不用對待測樣品進行長時間的增菌培養，同時加入有檢測引物和探針，與傳統的培養法相比具有快速、靈敏、安全等優點，可應用于蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的檢測。


圖I是本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中陽性對照PCR擴增圖；圖2是本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒陰性對照PCR擴增圖；圖3是本發明實施例一蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試方法中陽性樣本PCR擴增圖； 圖4是本發明實施例一蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試方法中陰性樣本PCR擴增 圖5是蠟楊芽孢桿菌培養法檢測流程圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。實時熒光定量PCR在基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域都有廣泛應用。其基本原理為在PCR反應體系中引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光信號強度，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可進行定量分析。本發明實施例提供一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液，所述PCR反應液包括第一反應液、第二反應液及石蠟，所述第一反應液中包括蠟樣芽孢桿菌正向引物、蠟樣芽孢桿菌反向引物、蠟樣芽孢桿菌探針、阪崎腸桿菌第一引物、阪崎腸桿菌第二引物、阪崎腸桿菌探針、金黃色葡萄球菌第一引物、金黃色葡萄球菌第二引物、金黃色葡萄球菌探針，所述蠟樣芽孢桿菌正向引物序列如SEQ IDNO :1所示，蠟樣芽孢桿菌反向引物序列如SEQ ID NO :2所示，蠟樣芽孢桿菌探針序列如SEQID NO :3所示，阪崎腸桿菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，阪崎腸桿菌第二引物序列如SEQ ID NO :5所示，阪崎腸桿菌探針序列如SEQ ID NO :6所示，金黃色葡萄球菌第一引物序列如SEQ ID NO :7所示，金黃色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO :8所示，金黃色葡萄球菌探針序列如SEQ ID NO 9o具體地，本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，其中包括DNA提取液、PCR反應液，可以同時進行蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的檢測；該試劑盒中還包括蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌陰性對照、陽性對照。試劑盒的規格陰性對照的規格為I管，40 I/管，陽性對照的規格為I管，40 I/管，DNA提取液為5ml/管(共I管)，PCR反應液為8管/條X6條,20 ii I/管。該陰性對照為不含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌基因的Tris-EDTA 緩沖液(0. OlM pH8. 0)。該陽性對照為使用蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌和DNA提取制備的陽性模板對照品，使用Tris-EDTA緩沖液(0. 01MpH8. 0)稀釋后冷凍保存。該陰性和陽性對照用于檢測時的自我檢驗，防止檢出誤差的出現。請參閱圖I和圖2，圖I顯示試劑盒中陽性對照的PCR擴增圖譜，圖2顯示試劑盒中陰性對照的PCR擴增圖譜。具體地，該DNA提取液(用于提取DNA)具體成分為Tris_EDTA緩沖液(0. OlMpH8. 0)，含 0. 01% NP-40。具體地,該PCR反應液包括第一反應、第二反應液及石蠟,該第一反應液和第二反 應液通過石蠟實現分隔，在PCR反應過程中，由于溫度在95°C，石蠟融化，第一反應液和第二反應液混合，PCR反應得以進行，該石蠟的具體內容見專利(200910190112. 7)。該PCR反應試劑存放于普通離心管中，該第一反應液位于下端，石蠟位于中間，該第二反應液位于石蠟上面。具體地，該第一反應液包括緩沖液，氯化鎂，dNTPs，蠟樣芽孢桿菌正向引物、蠟樣芽孢桿菌反向引物、蠟樣芽孢桿菌探針、阪崎腸桿菌第一引物、阪崎腸桿菌第二引物、阪崎腸桿菌探針、金黃色葡萄球菌第一引物、金黃色葡萄球菌第二引物、金黃色葡萄球菌探針，以及，滅菌超純水，第一反應液的總體積為18微升/管。該緩沖液為10 XBuffer，該緩沖液(寶生物工程(大連)有限公司)中不含有鎂離子。該緩沖液的體積為2 4微升/管；該該氯化鎂的濃度為25mM，該氯化鎂的體積為2 4微升/管；該dNTPs的濃度2. 5mM,體積為2 4微升/管；該蠟樣芽孢桿菌正向引物的濃度為50iiM，體積為0. I 0.2微升/管，例如0. 15微升/管，該蠟樣芽孢桿菌正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，具體為5’ -AAATCAA ACAAATTGTT GCGC-3’ -；該蠟樣芽孢桿菌反向引物的濃度為50 U M，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，該蠟樣芽孢桿菌反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示，具體為5， -CCATATTAGTGAAAGCCGCACT-3，；該蠟樣芽孢桿菌探針的濃度為50 u M，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，該蠟樣芽孢桿菌探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，具體為5’ -(FAM)TAGTTTGTTTAACAA CGCGCG(DABCYL)-3’ ；該阪崎腸桿菌第一引物的濃度為50 PM，體積為0. I 0.2微升/管，例如0. 15微升/管，該阪崎腸桿菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，具體為5’-AGCTTCCGCAGTGAAACG TCACG-3，；該阪崎腸桿菌第二引物的濃度為50iiM，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，該阪崎腸桿菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5所不，具體為5’ -GCACTGCAAAGTGACGCCTTCG-3’ ；該阪崎腸桿菌探針的濃度為50 U M，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，該阪崎腸桿菌探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示，具體為
5 ’ -(HEX)CTGGCTC GCGAAAACGC ACGC (DABCYL)-3’ ；該金黃色葡萄球菌第一引物的濃度為50 u M，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，該金黃色葡萄球菌第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示，具體為5’ -ATACACCT GAAACAAAGCATCC-3’ -；該金黃色葡萄球菌第二引物的濃度為50 U M，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15微升/管，該金黃色葡萄球菌第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示，具體為5’ -AAGTCCTGGTATAAAGAGATGTGG-3’ ；該金黃色葡萄球菌探針的濃度為50iiM，體積為0. I 0. 2微升/管，例如0. 15 微升/管，該金黃色葡萄球菌探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示，具體為5’ -(ROX)GGTGTAGAG AAATATGGTC CTGA (DABCYL)-3’ ；該滅菌超純水的量為4. 2 11. I微升/管，實現第一反應液的體積為18微升/管。具體地,該第二反應液包括Taq酶、顯色劑及滅菌超純水,該第二反應液的總體積為2微升/管。該Taq酶的體積為0. 15-0. 3微升/管，顯色劑的體積為0. 01-0. 02微升/管，該顯色劑例如，溴酚蘭。該滅菌超純水的量為I. 68 I. 84微升/管，使第二反應液的體積滿足2微升/管。具體地，該石蠟的體積為20微升/管。本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒能同時檢測蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，與傳統的培養法相比具有快速、靈敏、安全等優點，可應用于蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的檢測。本發明實施例進一步提供一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法，包括如下步驟步驟SOl，增菌培養和標本處理提供蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品；步驟S02，實時熒光PCR 進行實時熒光定量PCR檢測，該熒光定量PCR檢測步驟中使用上述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒。具體地，步驟SOl在無菌條件下操作。具體地，步驟SOl中，采集樣本，該樣本中可能含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，也可能不含有，需要本發明實施例的檢測方法進行檢測確定。因此，本步驟SOl中，蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品中可能含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA，也可能不含有。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反復抽吸3次充分混勻標本。具體地，步驟S02中，取步驟SOl中所得到的上清液，進行熒光定量PCR分析，本步驟中所使用的熒光定量PCR設備沒有限制，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJ Opticon2) >Stratagene MX系列、Roche LightCycler、Cepheid SmartCycIer>Corbett Rotor-Gene>杭州博日系列。步驟S02中PCR反應的條件為50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循環)。本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法中，每次檢測都設置試劑盒中的陽性對照和陰性對照，以防止檢測過程中污染的出現。以下結合具體實施例對上述蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法進行詳細說明。
實施例一本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法包括如下步驟I、采集蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的樣本，該樣本數為20個，其中一些樣本中含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，一些樣本沒有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品；2、取上述PCR反應液，該PCR反應液中各個組分為第一反應液
緩沖劑2微升/管
氯化鎂2微升/管
dNTPs2微升/管
蠟樣芽孢桿菌正向引物0.1微升/管
蠟樣芽孢桿菌反向引物0.1微升/管
蠟樣芽孢桿菌探針0.1微升/管
阪崎腸桿菌第一引物0.1微升/管
阪崎腸桿菌第二引物0.1微升/管
阪崎腸桿菌探針0.1微升/管
金黃色葡萄球菌第一引物0.1微升/管
金黃色葡萄球菌第二引物0.1微升/管
金黃色葡萄球菌探針0.1微升/管
滅菌超純水11.1微升/管；
石蠟20微升/管第二反應液
Taq酶0.15微升/管
顯色劑0.01微升/管
滅菌超純水1.84微升/管；在如下條件下進行實施熒光定量PCR反應，并進行檢測50-550C 2-5min ；94-95 °C :2_3min ；94-95°C :5_10S，55-60。。:40_80S ； (40 循環)。實施例二本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法包括如下步驟I、采集蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的樣本，該樣本數為20個，其中一些樣本中含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，一些樣本沒有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品；2、取上述PCR反應液，該PCR反應液中各個組分為
第一反應液
緩沖劑3微升/管
氯化鎂3微升/管 dNTPs3微升/管
蠟樣芽孢桿菌正向引物0.15微升/管
蠟樣芽孢桿菌反向引物0.15微升/管
蠟樣芽孢桿菌探針0.15微升/管
阪崎腸桿菌第一引物0.15微升/管
阪崎腸桿菌第二引物0.15微升/管
阪崎腸桿菌探針0.15微升/管
金黃色葡萄球菌第一引物0.15微升/管
金黃色葡萄球菌第二引物0.15微升/管
金黃色葡萄球菌探針0.15微升/管
滅菌超純水7.65微升/管；
石蠟20微升/管第二反應液
Taq酶0.2微升/管
顯色劑0.015微升/管
滅菌超純水1.785微升/管；在如下條件下進行實施熒光定量PCR反應，并進行檢測50-550C 2-5min ；
94-95 °C :2_3min ；94-95°C 5-10S, 55-60。。40-80S ； (40 循環)。實施例三本發明實施例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法包括如下步驟I、采集蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的樣本，該樣本數為20個，其中一些樣本中含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，一些樣本沒有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌。將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養；然后在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 U L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品；2、取上述PCR反應液，該PCR反應液中各個組分為
第一反應液 緩沖劑4微升/管氯化鎂4微升/管
dNTPs4微升/管
蠟樣芽孢桿菌正向引物0.2微升/管
蠟樣芽孢桿菌反向引物0.2微升/管
蠟樣芽孢桿菌探針0.2微升/管
阪崎腸桿菌第一引物0.2微升/管
阪崎腸桿菌第二引物0.2微升/管
阪崎腸桿菌探針0.2微升/管 金黃色葡萄球菌第一引物0.2微升/管
金黃色葡萄球菌第二引物0.2微升/管
金黃色葡萄球菌探針0.2微升/管
滅菌超純水4.2微升/管；
石蠟20微升/管 第二反應液
Taq酶0.3微升/管
顯色劑0.02微升/管
滅菌超純水1.68微升/管；在如下條件下進行實施熒光定量PCR反應，并進行檢測50-550C 2-5min ；94-95 °C 2-3min ；94-95°C 5-10S,55-60°C :40_80S ; (40 循環)。對比例本對比例蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法包括如下步驟I、采集含有蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的樣本，該對比例的樣
本和實施例一的樣本一致，將采集后的標本放置37°C恒溫室內進行3小時增菌培養；然后
在進行如下DNA裂解處理取Iml增菌液加入DNA提取液50 u L，反復抽吸3次充分混勻標本，得到蠟樣芽孢
桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品；2、按照前面背景技術所講的國際通用方法進行檢測。
請參閱下表，下表顯示應用實施例一和對比例的方法檢測20例樣本的結果
權利要求
1.一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，包括DNA提取液、PCR反應液，其特征在于，所述PCR反應液包括第一反應液、第二反應液及石蠟，所述第一反應液中包括蠟樣芽孢桿菌第一引物、蠟樣芽孢桿菌第二引物、蠟樣芽孢桿菌探針、阪崎腸桿菌正向引物、阪崎腸桿菌反向引物、阪崎腸桿菌探針、金黃色葡萄球菌第一引物、金黃色葡萄球菌第二引物、金黃色葡萄球菌探針，所述蠟樣芽孢桿菌第一引物序列如SEQ ID N0:1所示，蠟樣芽孢桿菌第二引物序列如SEQ ID NO :2所示，蠟樣芽孢桿菌探針序列如SEQ ID NO3所示，阪崎腸桿菌正向引物序列如SEQ ID NO :4所示，阪崎腸桿菌反向引物序列如SEQ IDNO :5所示，阪崎腸桿菌探針序列如SEQ ID NO :6所示，金黃色葡萄球菌第一引物序列如SEQID NO :7所示，金黃色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO :8所示，金黃色葡萄球菌探針序列如 SEQ ID NO :9。
2.如權利要求I所述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液和第二反應液通過所述石蠟分隔開。
3.如權利要求2所述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒,其特征在于，所述第一反應液還包括滅菌超純水、緩沖液、氯化鎂、dNTPs。、
4.如權利要求2所述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒,其特征在于，所述第二反應液包括Taq酶、滅菌超純水及顯色劑。
5.如權利要求3或4所述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液各組分體積為 緩沖劑2~4微升/管 氯化鎂2 ~ 4微升/管 dNTPs2~4微升/管蠟樣芽孢桿菌第一引物0.1 ~ 0.2微升/管蠟樣芽孢桿菌第二引物0.1 ~ 0.2微升/管蠟樣芽孢桿菌探針0.1 ~ 0.2微升/管阪崎腸桿菌正向引物0.1 ~ 0.2微升/管阪崎腸桿菌反向引物0.1 ~ 0.2微升/管阪崎腸桿菌探針0.1 ~ 0.2微升/管金黃色葡萄球菌第一引物0.1~0.2微升/管金黃色葡萄球菌第二引物0.1~0.2微升/管金黃色葡萄球菌探針0.1 ~ 0.2微升/管滅菌超純水4.2 ~ 11.1微升/管。
6.如權利要求3或4所述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，其特征在于，所述第二反應液各組分體積為 Taq酶0. 15 0. 3微升/管 顯色劑0.01 0.02微升/管 滅菌超純水 1.68 I. 84微升/管。
7.一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法，包括如下步驟 提供蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA樣品； 進行熒光定量PCR檢測，所述熒光定量PCR檢測步驟中使用如權利要求1-6任一項所 述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒。
8.如權利要求7所述的蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測方法，其特征在于，所述PCR反應條件為50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S ；55-60 °C 40-80S ； 40循環。
全文摘要
本發明適用于微生物技術領域，提供了一種蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒包括DNA提取液、PCR反應液。本發明蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌檢測試劑盒及檢測方法能同時檢測蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌，與傳統的培養法相比具有快速、靈敏、安全等優點，可應用于蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌及金黃色葡萄球菌的檢測。
文檔編號C12R1/445GK102747139SQ201210068100
公開日2012年10月24日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者盧柳燕, 吳成貢, 汪再興, 田仁鵬, 黃娟, 龔劍 申請人:深圳市生科源技術有限公司