專利名稱：腸出血性大腸桿菌o104︰h4檢測試劑盒及其使用方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測試劑盒，具體涉及一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒和及其使用方法。
背景技術：
2011年5月德國暴發了大規模腸出血性大腸桿菌0104 :H4疫情，波及部分歐洲國家以及美國、加拿大等國家，短時間內感染人數超過4000，少數病例繼發溶血性尿毒綜合征 (HUS)，導致多器官受損，甚至有30多人死亡。腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhage E. Coli, EHEC)是大腸桿菌的一個亞型， 其可引起嚴重的食源性疾病。常見的腸出血性大腸桿菌(EHEC)血清型有3個0157、026、 0111，不常見的血清型有40多種，而0104: H4是EHEC家族中的一種罕見的血清型，其含有志賀毒素2(vtx2a)的基因和腸積聚性黏附大腸桿菌毒力質粒上的3個基因aatA，aggR和 aap0鑒于腸出血性大腸桿菌0104:H4危害的嚴重性以及其影響的廣泛性，快速準確地對其進行檢測將具有十分重要的意義。培養法是國際上通用的鑒定細菌的方法，參照腸出血性大腸桿菌0157:H4檢測方法《SN/T 0973-2010進出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測方法》，腸出血性大腸桿菌0104:H4采用培養法檢測步驟如下(I)增菌無菌操作將待檢樣品放入增菌肉湯中，培養18小時-24小時。(2)分離對⑴增菌肉湯進行10倍遞增梯度稀釋，從ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6稀釋液中各取O. ImL增菌肉湯滴加于SMAC平板或(和)科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上，以滅菌L棒進行涂布并置于36°C ±1°C培養18小時-24小時。在SMAC平板上可疑腸出血性大腸桿菌菌落呈淡褐色中心，扁平透明，邊緣光滑，直徑約2mm。在科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上可疑腸出血性大腸桿菌菌落呈紫紅色。(3)生化試驗和血清學鑒定從SMAC平板或科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上挑選不少于5個-8個可疑菌落， 進行生化鑒定和血清凝集試驗。(4)結果報告根據選擇性分離平板、生化試驗和血清學鑒定結果，報告樣品中檢出或未檢出腸出血性大腸桿菌0104: H4。傳統的針對腸出血性大腸桿菌0104:H4的培養檢測法存在操作周期長、工序繁瑣、易污染及所需試劑繁多等缺點，傳統培養法已無法滿足快速檢測腸出血性大腸桿菌 0104 :H4的需要。因此需要開發一種能快速準確地檢測腸出血性大腸桿菌0104:H4的檢測試劑盒來滿足當前需要。

發明內容
針對現有技術中的檢測周期長、工序繁瑣、靈敏度低等缺點，本發明提供一種能快速準確地檢測腸出血性大腸桿菌0104:H4的檢測試劑盒。本發明的目的通過以下技術手段得以實現一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，包含PCR反應液，所述PCR反應液包含第一反應液、第二反應液及石蠟，所述第一反應液包含以wzy(0104)、fliC(H4)和aggR基因為靶基因，并用于熒光定量PCR的wzy (0104)基因的引物探針、fliC(H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。本發明還提供一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒的使用方法，所述方法包括以下步驟提供待檢測樣品；進行熒光定量PCR檢測，所述熒光定量PCR檢測使用本發明的腸出血性大腸桿菌 0104:H4檢測試劑盒進行，所述熒光定量PCR檢測包含陰性對照檢測和陽性對照檢測。本發明提供的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒及其使用方法，利用熒光定量PCR技術針對腸出血性大腸桿菌0104:H4的特異基因wzy (0104)、fliC(H4)和aggR基因進行檢測，避免了傳統培養檢測法中的操作周期長、所需試劑繁多、對操作者主觀性依賴等缺點，本發明將檢測時間由傳統培養檢測法的36小時以上縮短為5小時左右，且只需短時間接觸病菌而增加了操作者安全性，并具有操作簡便且不會出現假陽性等優點。


圖I為本發明使用的Ct值的示意性說明，其中所述的閾值線對應于特定探針；圖2為使用本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒進行檢測的流程圖；圖3為使用本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒進行檢測的陽性對照的結果，其中三條閾值線分別對應于三種探針，由上至下依次對應FAM、HEX、ROX ；圖4為使用本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒進行檢測的陰性對照的結果，其中三條閾值線分別對應于三種探針，由上至下依次對應FAM、HEX、ROX ；圖5為使用本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒進行檢測得到的熒光定量PCR結果，其中三條閾值線分別對應于三種探針，由上至下依次對應FAM、HEX、R0X。
具體實施例方式以下縮略語適用于本發明PCR Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應Tris :三異丙基乙磺酰EDTA ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate,脫氧核糖核苷三憐酸FAM :CarboxyfIuorescein,竣基突光素HEX :hexachloro_fIuorescein,六氣突光素ROX :Carboxy-X-rhodamine,羧基-X-羅丹明
DABCYL :4,4-Dimethylamino-azobenzene_4 ' carboxyl ic acid,4_ 二甲胺偶氮苯-4’ -羧酸Ct cycle threshold,每個PCR反應管內的突光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數，參見圖I。本說明書中使用的術語“濃度”，如非特別說明，均指初始濃度，即與其它液體混合之前的濃度。熒光定量PCR技術在基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域都有廣泛應用。其基本原理為在PCR反應體系中引入一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行， PCR反應產物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光信號強度，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖，見圖1， 在曲線指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可進行定量分析。基于以上技術，本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒針對EHEC 0104:H4三個基因wzy(0104)、fliC(H4)和aggR設計特異性引物和探針，在反應體系中含有wzy (0104)、f IiC (H4)和aggR基因DNA模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。本發明實施例提供一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，包含PCR反應液，所述PCR反應液包含第一反應液、第二反應液及穩定劑，所述第一反應液包含以 wzy (0104), fliC(H4)和aggR基因為靶基因，并用于熒光定量PCR的wzy (0104)基因的引物探針、f I iC (H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。優選地，本發明實施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒中，
上述wzy(0104)基因的引物探針為
wzy (0104)基因的引物
49F:5’ -TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’ (SEQ ID NO :1)，
49R:5’ -TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’ (SEQ ID NO :2)，
wzy (0104)基因的探針
49A : 5 ’ -(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT (DABCYL)-3’ (SEQIDNO 3)
上述fliC(H4)基因的引物探針為
fliC(H4)基因的引物
50F:5’ -GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’ (SEQ ID NO :4)，
50R:5’ -GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’ (SEQ ID NO :5)，
fliC(H4)基因的探針
50H : 5 ’ -(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG (DABCYL)-3’ (SEQIDNO 6)
上述aggR基因的引物探針為
aggR基因的引物
51F:5’ -GCAATACATATCTTAGAAATG-3’ (SEQ ID NO :7)，
51R:5’ -CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’ (SEQ ID NO :8)，
aggR基因的探針
51X:5’ -(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’ (SEQ ID NO :9)。優選地，本發明實施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒中，上述第一反應液還包括不含鎂離子的10Xbuffer、MgCl2、dNTPs、滅菌超純水，各組分體積份數為
wzy(0104)基因的引物
25-50μΜ 的 49F0.1-0.2體積份數25-50μΜ 的 49R0.1-0.2體積份數wzy(0104)基因的探針:25-50μΜ 的 49Α0.05-0.15體積份數_//z+C(H4)基因的引物25-50μΜ 的 50F0.1-0.2體積份數25-50μΜ 的 50R0.1-0.2體積份數_//z+C(H4)基因的探針25-50μΜ 的 50Η0.05-0.15體積份數oggi 基因的引物25-50μΜ 的 5IF0.1-0.2體積份數25-50μΜ 的 5IR0.1-0.2體積份數oggi 基因的探針25-50μΜ 的 5IX0.05-0.15體積份數不含鎂離子的IOxbuffer2-4體積份數25mM 的 MgCl22-4體積份數dNTPs2-4體積份數滅菌超純水4.35-11.25 體積份。該第一反應液總體積份數優選但不僅僅為18體積份數。優選地，本發明實施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒中，上述第二反應液由DNA聚合酶、顯色液和滅菌超純水組成。其中，DNA聚合酶為Taq酶，所述顯色液為溴酚藍，且該第二反應液各組分體積份數優選為Taq 酶(濃度為 5-10U/ μ I) O. 15-0. 3 體積份數溴酚藍O. 01-0. 02體積份數滅菌超純水I. 68-1. 84體積份數。
該第二反應液總體積份數優選但不僅僅2體積份數。優選地，本發明實施例腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒中，上述穩定劑優選為石蠟，且第一反應液與第二反應液被該石蠟分隔開；其中，第一反應液位于石蠟下方， 第二反應液在石蠟上方。優選地，本發明實施例腸出血性大腸桿菌0104 :H4檢測試劑盒中，還包含DNA提取液，陰性對照液和陽性對照液。其中，DNA提取液優選為O. OIM-0. 02M的pH7. 98-8. 02 的Tris-EDTA緩沖液，Tris-EDTA緩沖液含0.01% -O. 02 % NP-40 (體積百分比)；陰性對照液優選為不含腸出血性大腸桿菌0104:H4的基因組DNA的O. 01-0. 02M pH7. 98-8. 02的 Tris-EDTA緩沖液；陽性對照液優選為含有腸出血性大腸桿菌0104:H4的基因組DNA的 O. 01-0. 02M ρΗ7· 98-8. 02 的 Tris-EDTA 緩沖液。上述實施例中腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測試劑盒用于檢測腸出血性大腸桿菌0104:Η4時能有效利用熒光定量PCR技術針對腸出血性大腸桿菌0104:Η4的特異基因 wzy (0104)、fliC(H4)和aggR基因進行快速檢測，將檢測時間由傳統培養檢測法的36小時以上縮短為5小時左右，且只需短時間接觸病菌而增加了操作者安全性，并具有操作簡便且不會出現假陽性等優點。從而有效避免了傳統培養檢測法中的操作周期長、所需試劑繁多、對操作者主觀性依賴等缺點。本發明還提供一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒的使用方法，所述使用方法包括以下步驟
提供待檢測樣品；
進行熒光定量PCR檢測，所述熒光定量PCR檢測使用上述實施例腸出血性大腸桿菌0104 :H4檢測試劑盒進行。
優選地，本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒的使用方法中，所述熒光定量PCR檢測反應條件為
50-550C 2-5min ；
94-95°C 2-3min ；
94-95°C 5-10S,55-60°C :40_80S，35-40 個循環。
以下結合具體實施例對上述致病性大腸桿菌檢測方法進行詳細說明。
實施例一
腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒的制備
(I)按以下序列合成引物探針
wzy (0104)基因的引物
49F:5’ -TTAGTTCATT AGATCGAGGT-3’ (SEQ ID NO :1)，
49R:5’ -TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’ (SEQ ID NO :2)，
wzy (0104)基因的探針
49A:5，- (FAM)CTTG TCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO :3)；
fliC(H4)基因的引物
50F:5’ -GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’ (SEQ ID NO :4)，
50R:5’ -GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’ (SEQ ID NO :5)，
fliC(H4)基因的探針
50H:5’ -(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO :6)；aggR基因的引物51F:5’ -GCAATACATATCTTAGAAATG-3’ (SEQ ID NO :7)，51R:5，-CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’ (SEQ ID NO :8)，aggR基因的探針51X:5’ -(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’ (SEQ ID NO :9)。(2)配制第一反應液在容器內加入含有2. 5體積份數不含鎂離子的10Xbuffer、3. 5體積份數 25mM的MgCl2、2. 5體積份數的dNTPs，然后再加入引物49F(50yM)0. 15體積份數、引物 49R(50yM)0. 15體積份數、探針49A (50 μ Μ) O. I體積份數、引物50F (50 μ Μ) O. 15體積份數、 引物50R(50 μ Μ) O. 15體積份數、探針50Η(50 μ Μ) O. I體積份數、引物5IF (50 μ Μ) O. 08體積份數、引物51R(50 μ Μ) O. 08體積份數、探針51Χ(50 μ Μ) O. I體積份數，再加入滅菌超純水使第一反應液總體積份數為18，混合均勻，置于容器內；(3)配制穩定液取石蠟，置于容器內；(4)配制第二反應液；取O. 2體積份數的Taq酶(5υ/μ I)、0· 02體積份數的溴酚藍并加入滅菌超純水使第二反應液總體積份數為2，混合均勻，置于容器內；(5)配制 DNA 提取液0. OlM Tris-EDTA 緩沖液，pH8. 0，含 O. 01 % NP-40，置于容器內；(6)配制陰性對照液0. OlM Tris-EDTA 緩沖液，ρΗ8· O ；(7)配制陽性對照液由DNA序列合成供應商(寶生物工程(大連)有限公司) 合成出血性大腸桿菌0104:Η4基因wzy (0104)、fliC(H4)和aggR的部分序列DNA (SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO : 12)，溶于 O. OlM Tris-EDTA 緩沖液(陽性對照 DNA 濃度:5ng/y 1)，ρΗ8.0，置于容器內冷凍保存。該檢測試劑盒制備工藝簡述如下I.將上述步驟(2)制備的第一反應液分裝至用于熒光定量PCR的O. 2ml八聯管中，每管加18μ I ;2.將上述步驟(3)制備的石蠟加熱融化，加入至步驟I得到的八聯管中的第一反應液上，每管加20μ I ；3.待步驟2的石蠟冷卻凝固后，向該八聯管中加入步驟(4)配制的第二反應液，每管加2 μ 1，制備成含PCR反應液的八聯管；4.將步驟(5)配制的DNA提取液無菌分裝至5ml普通離心管,5ml/管,該離心管配有藍色蓋；5.將上述步驟(6)制備的陰性對照液無菌分裝至O. 6ml普通帶蓋離心管，40 μ I/ 管，該離心管為紫色透明；6.將上述步驟(7)制備的陽性對照液融化后無菌分裝至O. 6ml普通帶蓋離心管， 40 μ I/管,該離心管為橙紅色透明；7.組裝試劑盒，其中每個試劑盒規格為含PCR反應液的O. 2ml八聯管X6條；含 DNA提取液的5ml藍蓋離心管X I支；含陰性對照液的O. 6ml紫色透明離心管；含陽性對照液的O. 6ml橙紅色透明離心管。
實施例二腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒的應用本發明以培養法作為檢測腸出血性大腸桿菌0104:H4的參照，本發明的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒的檢測流程如圖2所示。培養法步驟如下將待測樣品置于LB培養基中，于37°C培養18小時，然后對增菌液進行10倍梯度稀釋，從其中的10_4、10_5、10_6稀釋液中各取O. ImL增菌液滴加于科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上，以滅菌L涂布棒進行涂布并置于37°C ±1°C培養18小時-24小時。在科瑪嘉大腸桿菌顯色瓊脂平板上培養后選取藍色菌落作為可疑腸出血性大腸桿菌。從該瓊脂平板上挑選該可疑菌落，進行生化鑒定和血清凝集試驗，根據所得結果做出判斷。本發明的檢測試劑盒檢測步驟如下
(I)增菌培養將待測樣品置于LB培養基中，于37°C培養3小時，取Iml增菌液，加入DNA提取液50 μ I，混合均勻；
(2)加樣取步驟⑴所得的混合液，加入至實施例一中制備的含PCR反應液的八聯管中，每管5μ I ；
(3)陰性對照組取實施例一中制備的陰性對照液，加入至實施例一中制備的含PCR反應液的八聯管中，每管5μ I ;
(4)陽性對照組取實施例一中制備的陽性對照液，加入至實施例一中制備的含PCR反應液的八聯管中，每管5μ I ;
(5)將步驟(2)-(5)所得的八聯管放入熒光定量PCR儀(型號=StratageneΜχ3005Ρ)中進行反應，突光定量PCR反應條件為
50 0C 2min ；
95°C 3min ；
95°C 5S,55°C 60S,40 個循環；
rh(6)根據擴增圖譜判定結果，參考陽性對照結果(圖3)，陰性對照結果(圖4)，其Ψ :
陽性結果擴增曲線圖Ct值< 35，并有明顯指數增長。
陰性結果擴增曲線圖Ct值> 35或無Ct值。
結果
使用本發明的檢測試劑盒進行檢測得到的熒光定量PCR結果見圖5。
培養法檢測結果及本發明的檢測試劑盒的結果的比較參見表I。
表I
權利要求
1.一種腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，包含PCR反應液，所述PCR反應液包含第一反應液、第二反應液及穩定劑，其特征在于，所述第一反應液包含以wzy (0104)、 fliC(H4)和aggR基因為靶基因，并用于熒光定量PCR的wzy(0104)基因的引物探針、 f I iC (H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。
2.根據權利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述wzy (0104)基因的引物探針為wzy (0104)基因的引物49F :5’-TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’ (SEQ ID NO 1),49R :5’ -TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’ (SEQ ID NO 2), wzy (0104)基因的探針49A :5’-(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO 3)；所述fliC(H4)基因的引物探針為 fliC(H4)基因的引物50F:5’ -GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’ (SEQ ID NO :4)，50R:5’ -GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’ (SEQ ID NO :5)， fliC(H4)基因的探針50H:5’ -(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’ (SEQ ID NO :6)；所述aggR基因的引物探針為 aggR基因的引物51F:5’ -GCAATACATATCTTAGAAATG-3’ (SEQ ID NO :7)，51R:5’ -CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’ (SEQ ID NO :8)， aggR基因的探針51X:5’ - (ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’ (SEQ ID NO :9)。
3.根據權利要求2所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液還包括不含鎂離子的lOXbuffer、MgCl2, dNTPs、滅菌超純水，所述第一反應液各組分體積份數為wzy(0104)基因的引物 25-50μΜ 的 49F 25-50μΜ 的 49R wzy(0104)基因的探針: 25-50μΜ 的 49Α _//z+C(H4)基因的引物 25-50μΜ 的 50F 25-50μΜ 的 50R _//z+C(H4)基因的探針 25-50μΜ 的 50Η oggi 基因的引物 25-50μΜ 的 5IF 25-50μΜ 的 5IR oggi 基因的探針 25-50μΜ 的 5IX 不含鎂離子的IOxbuffer 25mM 的 MgCl2 dNTPs 滅菌超純水、0.1-0.2體積份數 0.1-0.2體積份數;、0.05-0.15體積份數;、0.1-0.2體積份數 0.1-0.2體積份數;、0.05-0.15體積份數；、、0.1-0.2體積份數 0.1-0.2體積份數;、0.05-0.15體積份數; 2-4體積份數 2-4體積份數 2-4體積份數 4.35-11.25體積份數。
4.根據權利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述第二反應液由DNA聚合酶、顯色液和滅菌超純水組成。
5.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述 DNA聚合酶為Taq酶，其濃度為5-10U/μ 1，所述顯色液為溴酚藍，且所述第二反應液各組分體積份數為所述Taq酶O. 15-0. 3體積份數溴酚藍O. 01-0. 02體積份數，滅菌超純水I. 68-1. 84體積份數。
6.根據權利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測試劑盒，其特征在于，所述穩定劑為石蠟，且所述第一反應液與所述第二反應液被所述石蠟分隔開，所述第一反應液位于所述石蠟下方，所述第二反應液在所述石蠟上方。
7.根據權利要求I所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒還包含DNA提取液、陰性對照液和陽性對照液。
8.根據權利要求7所述的腸出血性大腸桿菌0104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述 DNA提取液為O. OIM-0. 02M的pH7. 98-8. 02的Tris-EDTA緩沖液，所述Tris-EDTA緩沖液含體積百分比為O. 01%-O. 02%的NP-40 ;所述陰性對照液為不含腸出血性大腸桿菌0104:H4 的基因組DNA的O. 01-0. 02M pH7. 98-8. 02的Tris-EDTA緩沖液；所述陽性對照液為含有腸出血性大腸桿菌0104:H4的基因組DNA的O. 01-0. 02M ρΗ7· 98-8. 02的Tris-EDTA緩沖液。
9.一種腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟提供待檢測樣品；進行熒光定量PCR檢測，所述熒光定量PCR檢測使用如權利要求1-8中任一項所述的腸出血性大腸桿菌0104 :Η4檢測試劑盒進行。
10.根據權利要求9中所述的腸出血性大腸桿菌0104:Η4檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述熒光定量PCR檢測反應條件為50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10S,55-60°C :40_80S，35—40 個循環。
全文摘要
本發明提供一種腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，包含PCR反應液，所述PCR反應液包含第一反應液、第二反應液及穩定劑，所述第一反應液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因為靶基因，并用于熒光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探針、fliC(H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。本發明還提供一種腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒的使用方法，所述方法具有快速準確、特異性強、操作簡便且不會出現假陽性的優點。
文檔編號C12Q1/04GK102605069SQ201210068180
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者盧柳燕, 吳成貢, 汪再興, 田仁鵬, 董紹旺, 黃娟, 龔劍 申請人:深圳市生科源技術有限公司