專利名稱：：一種Sublancin抗菌肽的生產方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
,具體地,涉及ー種Sublancin抗菌肽的生產方法。
背景技術：
：Sublancin抗菌肽是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)產生ー種具有抗菌活性的內源性多肽。由核糖體合成，通過前導序列進行轉錄后修飾和轉運。其物理性質為無色結晶或白色結晶性粉末，易溶于水。Sublancin含有_■硫鍵，因此穩定性好。Sublancin抗菌肽對革蘭氏陽性菌具有較強抑制和殺滅作用，可應用于食品保鮮、抗感染以及抑制環境消毒。目前，國內外尚未有可實現エ業化生產的Sublancin抗菌肽生產方法。關于Sublancin抗菌肽制備方法的報道也比較少。Paik等1998年(SunH.Paik,AnuChaKicherla,andJ.NormanHansen.1998.IdentificationandCharacterizationoftheStructuralandTransporterGenesfor,andtheChemicalandBiologicalPropertiesof,Sublancin168,aNovelLantibioticProducedbyBacillussubtilis168.THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY.273:23134-23142.)報道了一種在實驗室制備Sublancin抗菌肽的方法。菌株為B.subtilis168，發酵規模為1し每IL培養基含蔗糖20g，檸檬酸11.lg,Na2SO44g，(NH4)2HPO44.2g，酵母提取物5g，KCl0.762g，MgCl2*6H200.418g,MnCl24H200.0543g,FeCl36H200.049g,ZnCl20.0208g，用NH4OH調pH6.86.9。發酵條件為37°C通風培養16h后，200rpm搖床37°C培養28h。純化方法為用磷酸調發酵培養液PH2.5;離心除去細胞；過25ml體積疏水層析柱；凍干；用0.I%的三氟こ酸溶解后離心去掉沉淀；經過2次HPLC反相C-18分析柱的分離純化后，經凍干，于_20°C保存。該方法發酵規模小，產量低而且不穩定。純化過程采用了高精密儀器高效液相色譜(HPLC)，對化學試劑以及操作人員的要求都比較高，這就導致采用此方法精制Sublancin抗菌肽成本高，產量低的特點。因此，上述方法不適用于大規模生產，不能滿足エ業化生產的需要。
發明內容本發明的目的在于提供一種高純度Sublancin抗菌肽的發酵生產和純化的方法，以克服現有技術中沒有エ業化生產高純度Sublancin抗菌肽的不足。本發明通過大量研究，對ー系列エ藝數據進行探索，通過技術革新，優化了發酵配方和エ藝，擴大發酵規模，提高了Sublancin抗菌肽的產量，降低了生產成本，摸索出ー套可以大規模生產Sublancin抗菌肽的發酵方法；并進行了純化過程的設計、組合，解決了純化對高精密儀器的依賴和產量低的問題，使Sublancin抗菌肽的純化滿足規?；a的要求，通過一系列層析技術實現Sublancin抗菌肽的大量純化,最終實現高純度Sublancin抗菌肽的エ業化制備。Sublancin抗菌肽純物質的純化制備流程見圖I。本發明提供了ー種Sublancin抗菌肽的制備方法，所述生產方法包括(I)枯草芽孢桿菌接種培養基進行發酵，過濾發酵液；(2)將步驟(I)得到的發酵液離心，通過陽離子交換層析、疏水層析、尺寸排阻層析、陰離子交換層析，最后超濾濃縮、干燥，即得Ssublancin抗菌肽。其中，步驟(I)中所使用的菌株為B.subtilisCVCC20076，發酵液通過陶瓷膜過濾，所述陶瓷膜孔徑為20nm。步驟⑴中所述的培養基組成為每IL發酵培養基含玉米粉10_50g，豆柏10-50g,蛋白胨5_20g，葡萄糖(或蔗糖)2-20g,酵母粉0-10g，硫酸銨0-10g，硝酸銨0_10g，硫酸鎂0-1.5g，硫酸錳0-1.5g，磷酸鹽0-10g。加氫氧化鈉調節PH7.0-8.0，發酵規模為10-20m3。此外，步驟(I)中枯草芽孢桿菌的接種量為lX106_107CFU/mL，發酵溫度為30-37°C，發酵時間為24-32h，通氣量600-1000m3/h，轉速120_200r/min，pH6-7。其中步驟⑵所述的離心條件為10000-15000g離心20-40min。本發明通過嘗試不同的離子濃度和pH值，摸索出適合層析的洗滌、洗脫液。本發明提供的Sublancin抗菌肽的制備方法，其中陽離子交換層析步驟是用緩沖液A平衡離子交換層析柱，將發酵液上離子交換層析柱，上樣量與陽離子交換層析柱填料的體積比為201，上樣流速為50mL/min，之后用緩沖液A沖洗層析柱至紫外吸收達到基線水平，再用緩沖液A和緩沖液B按3I的體積比進行等度洗脫，收集洗脫液；所述緩沖液A為20mMNaAc溶液，pH4.0;所述緩沖液B為含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.O。該步驟利用Sublancin抗菌肽與其它雜蛋白與層析柱填充物所帶電荷相互作用的原理，將Sublancin抗菌肽與其它雜蛋白分離。由于Sublancin抗菌肽的等電點與其它雜蛋白的等電點不同，在適當的鹽濃度和PH條件下與層析柱填充物(陽離子交換劑)結合的強度不同，從而將目的肽與雜蛋白分離。該步驟可除去發酵液中大多數原料蛋白以及菌體蛋白等雜蛋白，得到的Sublancin抗菌肽純度可達70%以上。本發明的方法中，步驟2)所述的疏水層析步驟是用緩沖液A’平衡疏水層析柱，將離子交換層析收集到的洗脫液與2MNaCl進行等體積混合上樣疏水層析柱，上樣量與疏水層析柱填料的體積比為2.5I上樣流速為30mL/min，用緩沖液A’洗滌色譜柱，直至紫外吸收至基線水平，再用緩沖液B’進行線性梯度洗脫，收集洗脫液；所述緩沖液A’為含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.0，所述緩沖液B，為20mMNaAc,pH4.O。其中，步驟2)所述的尺寸排阻層析將疏水層析步驟收集的洗脫液上樣，毎次進樣體積為柱體積的5%，流速為2mL/min，收集抗菌肽洗脫峰。其中，步驟2)的尺寸排阻層析步驟是用SEC緩沖液清洗并充滿尺寸排阻層析柱，待基線水平后，再上樣。所述SEC緩沖液是20mMNa2HPO4和150mMNaCl的混合溶液。該步驟可以按照樣品中各組分分子大小進行分離。在流經層析柱的過程中，大分子蛋白受填料的阻礙小，優先通過層析柱，小分子蛋白受填料的阻礙大通過層析柱的時間長。經過尺寸排阻層析可進ー步除去比Sublancin分子量大的雜質蛋白。此時的Sublancin抗菌肽純度可達高到99%以上。將尺寸排阻層析步驟收集的洗脫液上陰離子交換層析柱，流速2ml/min，收集流出的液體。陰離子交換層析主要作用是能除去從發酵液中帶來的殘余DNA和內毒等雜質物質，確保Sublancin抗菌肽終產物的安全性。本發明還提供了上述生產方法制備得到的Sublancin抗菌肽產品。最后將得到的Sublancin抗菌肽溶液超濾濃縮、干燥后即得Sublancin抗菌肽純物質。根據本發明提供的生產方法所得到的高純度Sublancin抗菌肽，其純度>99%，分子量為3876.48Da，具有優異的抗菌效果。本發明的有益效果(I)本發明以玉米和大豆加工品等糧食產品為主要原料，代替了實驗室中化學試劑級別的原料，降低了生產成本；(2)本發明將發酵規模提高到了エ業化生產級別，實現了Sublancin抗菌肽的エ業化生產。(3)本發明提高了Sublancin抗菌肽的生產效率,發酵液中Sublancin抗菌肽的含量可達80-100ug/mL。(4)本發明采用エ業化中式層析柱，為實現Sublancin抗菌肽的大規模純化鋪平了道路，而且易于推廣應用。(5)本發明精制的Sublancin抗菌肽純度達到99%以上，可用于醫藥、食品添加劑以及環境消毒劑等產品的生產。本發明的方法能夠實現大規模發酵，產量高，成本低，產物純度高，而且實現了穩定化生產。純化過程對操作人員要求低，エ藝簡單易于推廣應用、可實現規?；a。圖I為本發明的Sublancin抗菌肽的純化制備方法流程圖。圖2為本發明制備的Sublancin抗菌肽純物質HPLC色譜圖。圖3為本發明制備的Sublancin抗菌肽純物質分子量質譜測定圖。圖4為Sublancin抗菌肽質譜片段HPLC色譜圖。圖5為Sublancin抗菌肽片段I、片段3質譜圖。圖6為Sublancin抗菌肽片段2質譜圖。圖7為Sublancin抗菌肽片段2的ニ級質譜圖。圖8為發酵液中Sublancin抗菌肽的含量檢測色譜圖。具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I發酵規模10m3。IL發酵培養液含玉米粉20g，豆柏20g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，硫酸銨5g，硫酸鎂0.8g。用氫氧化鈉調pH7.5。培養液經溫度121°C，罐壓0.08Mpa,維持時間30min滅菌?？莶菅挎邨U菌B.subtilisCVCC20076，購自中國エ業微生物菌種保藏管理中心。菌種接種量為lX106CFU/mL。發酵培養溫度34°C，通氣量600m3/h，攪拌速度120r/min,pH7.0。發酵培養時間32h。陶瓷膜過濾的膜孔徑20nm,得到Sublacin抗菌肽的發酵液。實施例2發酵規模20m3。IL發酵培養液含玉米粉50g，豆柏50g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，硫酸銨5g，酵母粉5g，磷酸氫ニ鉀5g。用氫氧化鈉調pH8.0。培養液經溫度121°C，罐壓0.15Mpa，維持時間30分鐘滅菌?？莶菅挎邨U菌B.subtilisCVCC20076菌種接種量為lX107CFU/mL。發酵培養溫度30°C，通氣量1000m3/h，攪拌速度160r/min，pH:6.5。發酵培養時間24h。陶瓷膜過濾的膜孔徑10nm，得到Sublacin抗菌肽的發酵液。實施例3發酵規模10m3。IL發酵培養液含玉米粉10g，豆柏10g，蛋白胨5g，蔗糖2g，硫酸銨5g。用氫氧化鈉調pH7.O。培養液經溫度121°C，罐壓0.lOMpa，維持時間30分鐘滅菌。枯草芽孢桿菌B.subtilisCVCC20076菌種接種量為lX106CFU/mL。發酵培養溫度37°C，通氣量720m3/h，攪拌速度200r/min，pH:6.O。發酵培養時間28h。陶瓷膜過濾的膜孔徑30nm,得到Sublacin抗菌肽的發酵液。實施例4Sublancin抗菌肽的純化方法經過發酵后發酵液中含有抗菌肽經過陶瓷膜過濾后，經過12000g離心30min收集上清液備用。經預處理后的發酵液經過一系列固相萃取技術最終得到Sublancin抗菌肽的純物質，エ藝如下I、離子交換層析在室溫條件下，離子交換柱填料體積為1し用7L的離子交換緩沖液A(20mM醋酸鈉NaAc，pH4.0)平衡離子交換層析柱，流速為50ml/min。取實施例3制得的發酵液進行層析柱上樣，上樣量約為20L，流速為50ml/min。上樣后，用離子交換緩沖液A沖洗層析柱，直到紫外吸收接近基線水平。用緩沖液A:緩沖液B(20mMNaAc+lMNaCl，pH4.0)=3:I的比例進行等度洗脫，洗脫峰即含有抗菌肽，收集含有sublancin抗菌肽的洗脫液。收集完畢后，用5L緩沖液B沖洗層析柱，并用3L0.IMNaOH清洗，最后用20%こ醇保存層析柱。該步驟得到抗菌肽的純度約為70%。2、疏水層析在室溫條件下,疏水層析填料為0.2し先將離子交換層析收集到的sublancin抗菌肽粗產品與2MNaCl進行等體積混合備用。用緩沖液A(20mMNaAc+IMNaCl,pH4.0)平衡疏水層析柱，流速為30ml/min。層析柱平衡好后，保持流速，將離子交換所收集的樣品全部上樣，上樣量與層析柱填料比在2.5I。上樣后，用緩沖液A洗滌色譜柱，直至紫外吸收至基線。使用緩沖液B(20mMNaAc，pH4.0)進行線性梯度洗脫，30min內緩沖液B從0到100%。內當緩沖液B所占比例至80%-90%時，Sublancin抗菌肽被洗脫下來,收集洗脫液。洗脫完畢后，使用0.6L0.IMNaOH清洗層析柱，并用20%的こ醇保存層析柱。該步驟得到抗菌肽的純度約為95%。3、尺寸排阻層析在室溫條件下，尺寸排阻層析填料為0.4し含Sublancin抗菌肽的發酵液經過離子交換、疏水層析后，還需要經過尺寸排阻層析才能獲得高純度的目的物質。先用SEC緩沖液(20mMNa2HPO4+150mMNaCl)清洗并充滿純化系統，接上尺寸排阻層析柱(SuperdexG50填料)平衡系統，流速為2ml/min。待基線水平后進樣，將疏水層析步驟得到的洗脫液上尺寸排阻層析柱，毎次進樣體積為15ml，抗菌肽在70min左右出峰，收集抗菌肽洗脫峰。最后，用20%的こ醇保存層析柱。該步驟得到抗菌肽的純度大于95%。4、陰離子交換層析該步驟的目的是去除殘余宿主DNA。在室溫條件下，陰離子交換填料為1ml。先用20mlPBS(20mMNa2HP04+150mMNaCl)平衡陰離子交換層析柱。將尺寸排阻層析收集到的樣品上樣，流速為2ml/min(即將所有樣品流穿，樣品中殘余宿主DNA吸附在層析柱上，而抗菌肽不吸附)。收集流出的液體即得不含參與宿主DNA、純度大于99%的抗菌肽。用緩沖液(20mMTris+lMNaCl,pH8.0)清洗層析柱并用20%的こ醇保存。將陰離子交換層析步驟獲得的抗菌肽按常規方法超濾濃縮、干燥，凍干密封保存。實施例5Sublancin抗菌肽的HPLC分析檢測方法將實施例4得到的Sublancin抗菌肽用HPLC分析。所用儀器有Agilent1260Infinityニ元液相色譜系統(購自Agilent公司);AgilentZORBAX300StableBond(300SB)C8HPLC色譜柱(購自Agilent公司);流動相A:0.I%的三氟こ酸水溶液；流動相B:80%的こ腈水溶液；柱溫25°C，檢測波長280nm;最大壓力200bar，流速lml/min,分析梯度見表I:表IHPLC分析梯度流動相梯度權利要求1.一種制備Sublancin抗菌肽的方法,其特征在于包括如下步驟1)枯草芽孢桿菌接種培養基進行發酵，過濾發酵液；2)將步驟I)所得發酵液先后進行離心、陽離子交換層析、疏水層析、尺寸排阻層析、陰離子交換層析，最后超濾濃縮、干燥，即得Sublancin抗菌肽。2.如權利要求I所述的抗菌肽制備方法，其特征在于步驟I)中發酵液通過陶瓷膜過濾，所述陶瓷膜孔徑為20nm。3.如權利要求I或2所述的抗菌肽制備方法，其特征在于步驟I)中所述的培養基組成為每IL發酵培養基含玉米粉10-50g，豆柏10-50g，蛋白胨5-20g，葡萄糖(或蔗糖)2_20g，酵母粉O-lOg，硫酸銨O-lOg，硝酸銨O-lOg，硫酸鎂0-1.5g，硫酸錳0-1.5g，磷酸鹽0_10g，pH7.0_8·Oο4.如權利要求I或2所述的抗菌肽制備方法，其特征在于步驟I)中枯草芽孢桿菌的接種量為IX106_107CFU/mL，發酵溫度為30_37°C，發酵時間為24_32h，通氣量600-1000m3/h，轉速120-200r/min,pH6.0-7.O。5.如權利要求I或2所述的抗菌肽制備方法，其特征在于步驟2)所述的離心條件為10000-15000g離心20-40min。6.如權利要求I或2所述的抗菌肽制備方法，其特征在于，所述的陽離子交換層析是用緩沖液A平衡離子交換層析柱，將發酵液上樣，上樣量與陽離子交換層析柱填料的體積比為201，上樣流速為50ml/min，之后用緩沖液A沖洗層析柱至紫外吸收達到基線水平，再用緩沖液A和緩沖液B按3I的體積比進行等度洗脫，收集洗脫液，所述緩沖液A為20mMNaAc溶液，pH4.0，所述緩沖液B為含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.O。7.如權利要求I或2所述的抗菌肽制備方法，其特征在于，步驟2)所述的疏水層析步驟是用緩沖液A’平衡疏水層析柱，將離子交換層析收集到的洗脫液與2MNaCl進行等體積混合上樣層析柱，上樣量與疏水層析柱填料的體積比為2.51，上樣流速為30ml/min，用緩沖液A’洗滌色譜柱，直至紫外吸收至基線水平，再用緩沖液B’進行線性梯度洗脫，收集洗脫液；所述緩沖液A’為含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.0，所述緩沖液B’為20mMNaAc,pH4.O。8.如權利要求I或2所述的抗菌肽制備方法，其特征在于，步驟2)所述的尺寸排阻層析是將疏水層析步驟收集的洗脫液上樣，每次進樣體積為柱體積的5%，流速為2ml/min，收集抗菌肽洗脫峰。9.如權利要求I或2所述的高純度抗菌肽生產方法，其特征在于，將尺寸排阻層析步驟收集的洗脫液上陰離子交換層析柱，流速2ml/min，收集流出的液體。10.如權利要求I9任意一項所述的生產方法得到的抗菌肽產品。全文摘要本發明提供了一種Sublancin抗菌肽的制備方法，包括如下步驟(1)枯草芽孢桿菌接種培養基進行發酵，過濾發酵液；(2)將步驟(1)的發酵液先后進行離心、陽離子交換層析、疏水層析、尺寸排阻層析、陰離子交換層析，最后超濾濃縮、干燥，得Sublancin抗菌肽。本發明的方法成本低、生產效率提高、產物純度高，制得的Sublancin抗菌肽的純度可達99％以上，工藝簡單易于推廣應用、可實現規?；a。文檔編號C12R1/125GK102851339SQ20121007636公開日2013年1月2日申請日期2012年3月21日優先權日2012年3月21日發明者郭文江,祝發明申請人:中農穎泰林州生物科園有限公司