專利名稱：一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法
技術領域：
本發明屬于干細胞誘導分化研究領域，涉及一種誘導干細胞分化的方法，尤其是一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法。
背景技術：
糖尿病是一組以血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂性疾病。糖尿病死亡率僅次于心腦血管和腫瘤，嚴重威脅人類生命和健康。隨著其發病率的逐年上升，糖尿病對人類健康的危害還將進一步加重。世界衛生組織估計，全世界有I. 8億人患有糖尿病，這一數字很可能到2030年將翻番一倍以上。在糖尿病治療方面，傳統的治療無外乎促進β細胞胰島素的分泌、增加外周組織對胰島素的敏感性及使用外源胰島素幾個方面，然而這些治療策略顯然未能使糖尿病患者得到根治；胰腺移植和胰島移植又難以克服供體不足和免疫排斥這兩大問題，使其臨床應用和效果也受到極大影響。因此迫切需求治愈糖尿病的新方法。干細胞以其極強自我更新和多向分化潛能，已成為人們尋找替代患者自身免疫系統破壞的胰島細胞的最佳種子細胞來源，以干細胞移植為主的再生治療為糖尿病的根治帶來了新的希望。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs),是目前最有應用優勢的種子細胞。間充質干細胞具有非常強的自我增殖能力和分化的多潛能性，國內外的研究表明能根據特定的環境分化為胰島素分泌細胞，并且間充質干細胞具有其它干細胞所不可比擬的優點，如取材方便、增殖和分化能力強、移植無免疫原性，同時也避免了胚胎干細胞移植所面臨的倫理問題。目前對于間充質干細胞向胰島細胞分化的誘導方案可以歸為以下兩類多數為集中神經生長因子及活化素的聯合應用，如bFGF、EGF等；另一種方法是轉染胰島細胞發育、胰島素分泌過程中的關鍵基因，如roX-l、Ngn3等轉錄因子。但是現有研究誘導分化方案有很大局限性，分化效率不高，應用時效果不理想。血清反應因子(SRF)是一種高度保守且廣泛存在于多種生物體內的轉錄調控因子，它可以與多個基因啟動子上CArG box位點特異性結合，進而特異性上調靶基因的轉錄表達水平。目前發現其主要功能是參與調節細胞內骨架肌動蛋白和其他一些支架蛋白的基因轉錄過程，進而參與多種哺乳動物生理過程，例如肌原纖維發育及其分化為骨骼肌、平滑肌等過程。最新的研究發現胰島素基因啟動子上含有SRF的結合位點CArG box,并且SRF和PDX-I可以協同促進胰島素基因的轉錄，但是利用SRF與生長因子組合共同誘導間充質干細胞向平滑肌細胞分化尚未見報道
發明內容
本發明的目的在于提供一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，本方法利用SRF基因修飾與多種生長因子協同誘導間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，包括以下步驟
(I)構建含有SRF基因的重組真核表達質粒；(2)誘導人間充質干細胞向Nestin+細胞分化當步驟(I)中細胞至70_80%融合時，去除原有培養基，加入誘導培養基I培養5 6小時；所述步驟⑵中所述誘導培養基I為含有5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖；(3)誘導Nestin+細胞向胰腺始祖細胞分化在步驟(2)獲得細胞中，去除步驟(2)中誘導培養基I，加入誘導培養基II培養7 8天；步驟(3)中所述的誘導培養基II為含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27、0. 1% β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖；(4)誘導胰腺始祖細胞向胰島素分泌細胞分化在步驟(3)獲得細胞中，去除步驟
(2)中誘導培養基II，加入誘導培養基III，同時轉染步驟(I)中的SRF基因的重組真核表達質粒，培養7 8天；步驟⑷中所述的誘導培養基III為含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖。而且，步驟(I)中構建含有SRF基因的重組真核表達質粒，真核表達載體為pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。而且，步驟(2)中所述的人間充質干細胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來源的間充質干細胞。而且，步驟(4)中所述的SRF真核表達質粒為去內毒素的質粒，質粒超螺旋帶型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。而且，所述步驟(3)中所述的誘導培養基II為含有10nmol/L bFGFUOnmoI/L EGF、2% B27.0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖。而且，所述步驟(4)中所述的誘導液培養基III為含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖。本發明的優點和積極效果如下I、本發明首次將SRF用作誘導間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化過程中的修飾基因，并首次將轉染SRF和多種生長因子組合共同誘導間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化。2、本發明利用生長因子組合誘導間充質干細胞分化為胰腺始祖細胞(此時細胞高表達rox-i)，同時對細胞進行基因修飾，上調細胞中的SRF表達，并輔以生長因子和活性物質將可能獲得分泌胰島素的細胞，此方法的建立對于研發基于干細胞移植治療為主的“再生醫學”具有重要意義和實用價值。3、本發明所述的Effectene Transfection Reagent轉染系統轉染效率高，并且安全性好。4、本發明可為間充質干細胞的向胰島素分泌細胞定向誘導分化和其臨床應用提供新的理論和實驗依據，并為與之相關的藥物開發和篩選提供了新的模型。


圖I為本發明利用SRF的上、下游引物對SRF基因進行PCR擴增，將擴增得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，M為分子量marker，I代表擴增PCR產物片段；圖2為本發明所構建的SRF質粒進行雙酶切驗證，M為分子量marker，I為所構建質粒進行雙酶切后的電泳圖。圖3為本發明利用誘導培養基組合三步誘導法誘導人間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化的細胞形態圖，其中，圖3-1代表未誘導組的間充質干細胞的形態；圖3-2代表利用誘導培養基I誘導間充質干細胞分化為nestin+細胞的形態變化情況；圖3_3代表利用誘導培養基II誘導nestin+細胞分化為胰腺始祖細胞的形態變化情況；圖3_4代表利用誘導培養基III誘導胰腺始祖細胞分化為胰島素分泌細胞的形態變化情況。圖4為本發明利用誘導培養基組合三步誘導法誘導人間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化后，利用雙硫腙染色檢測胰島素分泌細胞團，其中，圖4-1代表未誘導組的間充質干細胞進行雙硫腙染色；圖4-2代表利用生長因子誘導后雙硫腙染色，說明利用誘導培養基組合誘導后出現表達胰島素的細胞團。圖5為本發明利用誘導培養基組合三步誘導法與轉錄因子SRF共同誘導人間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化后，利用RT-PCR檢測分化后細胞表達胰島素基因mRNA水平，其中A代表誘導培養基組合三步誘導法誘導間充質干細胞分化后，胰島素基因mRNA水平；B代表誘導培養基組合三步誘導法與轉錄因子SRF共同誘導人間充質干細胞分化后，胰島素基因mRNA水平。說明在誘導培養基組合與轉錄因子SRF共誘導之后胰島素的mRNA水平較聞。圖6為本發明利用誘導培養基組合三步誘導法與轉錄因子SRF共同誘導人間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化后，利用ELISA方法檢測培養基中胰島素的分泌情況，其中A代表誘導培養基組合三步誘導法誘導間充質干細胞分化后，培養基中胰島素的分泌情況；B代表誘導培養基組合三步誘導法與轉錄因子SRF共同誘導人間充質干細胞分化后，培養基中胰島素的分泌情況。說明在誘導培養基組合與轉錄因子SRF共誘導之后胰島素分泌顯著升高。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。本發明中沒有具體指明單位的百分比均為重量百分比。本發明未詳細說明的方法均為本領域公知技術或公知實驗方法，不具有特殊性。本發明提供一種由多種誘導物組合而成的分3步誘導的新方法，其中SRF基因修飾是間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化中首次采用的方法，該方法能將人間充質干細胞誘導分化為胰島素分泌細胞，并具有較高的胰島素分泌量，具體包括以下步驟(I)間充質干細胞的分離、培養間充質干細胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血、脂肪等組織來源的間充質干細胞。
(2)構建含有SRF基因的重組真核表達質粒，含有SRF基因的真核表達質粒的制備方法是本領域常用的構建真核表達載體的方法。具體的是選擇合適的載體，載體可以是pcDNA3. I、pCMV等真核表達載體。根據SRF基因全長序列與所選載體設計酶切位點，利用PCR或人工合成的方法獲得SRF基因全長，利用相應的限制性內切酶進行酶切反應，然后用連接酶將酶切后的SRF基因片段和載體連接，進一步通過瓊脂糖凝膠電泳、限制性內切酶酶切鑒定、PCR鑒定及測序的方法對獲得的質粒進行鑒定，獲得SRF真核表達質粒。
(3)誘導人間充質干細胞向Nestin+細胞分化將步驟(I)中細胞種入6孔板中，待生長至70-80%融合時，去除原有DiffiM和10%胎牛血清培養基，加入誘導培養基I 2mL培養5 6小時，誘導培養基I為含有5mmol/Lβ -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養基。培養基加入量與使用培養板大小有關，如用6孔板，則加2ml，如用24孔板，則加lmL。(4)誘導Nestin+細胞向胰腺始祖細胞分化在步驟(3)獲得細胞中，去除步驟(3)中誘導培養基I，加入誘導培養基II 2mL培養 7 8 天，誘導培養基 II 為含有 5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27.0. 1%β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養基。(5)誘導胰腺始祖細胞向胰島素分泌細胞分化在步驟⑷獲得細胞中，去除步驟⑷中誘導培養基II，加入誘導培養基III 2mL，同時轉染步驟(2)中的SRF基因的重組真核表達質粒，培養7 8天，誘導培養基III為含有5 20nmol/LExendin-4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養基。(6)分化后細胞的鑒定利用細胞形態觀察、RT-PCR、雙硫腙染色等方法對分化后的細胞進行鑒定。實施例I一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，本實施例采用的是人骨髓間充質干細胞，步驟如下I.人骨髓間充質干細胞的分離、培養從健康志愿者髖骨分離獲取人骨髓間充質干細胞，然后收集細胞培養當細胞達到70-80%融合時，用PBS清洗后，用胰酶消化，然后加入含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養基(5. 6mM葡萄糖)終止消化，吹打成單細胞懸液，離心后棄上清，再用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養基(5. 6mM葡萄糖)重新懸浮細胞；然后傳代培養；2.含有SRF基因的重組真核表達質粒構建(I)小鼠基因組的提取提取小鼠的心臟組織，將組織置于冰塊上，同時注意無菌操作。使用PH值為7. 4的PBS，將心臟組織濕潤。用眼科剪將心臟組織剪為O. 5cm X O. 5cm的小塊，將剪碎的心臟組織放入勻漿器中，在10-20mg心臟組織加入I毫升Trizol，至于冰上研磨5分鐘，離心取上清，利用傳統方法(氯仿/異丙醇)提取RNA。(2)根據NCBI中Genebank數據庫中SRF的全長序列信息和所用pcDNA3. I載體信息設計引物，引物序列如下上游引物I :5’ -CATGGATCCCCATGTTACCGACCCAAGCT-3’
下游引物1 :5’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3’PCR反應體系
基因組模板Ιμ
正向引物Ιμ
反向引物Ιμ dNTP4μL
IOxbuffer5 μι
EasyTaq 聚合酶Ιμ
總體積5(^L利用EasyTaq 聚合酶在 94°C 5min, (94°C lmin,53°C 30s，72°C 3min) 35 個循環，72°C IOmin的反應條件下進行PCR擴增，將擴增獲得的PCR產物于I %的TBE瓊脂糖凝膠中電泳(如圖I)，利用瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒純化回收獲得SRF基因片段。(3)將SRF基因和pcDNA3. I質粒用BamHI和XhoI雙酶切后，經T4DNA連接酶(Promega)連接，取連接產物10 μ I加入到感受態細胞(常規CaCl2法制備Ε. coliDH5 α感受態細胞)中，輕敲管壁使內容物混勻，冰浴30min，42°C水浴熱擊90s，迅速轉置冰浴2min，加入500 μ ILB培養基振蕩培養，將300 μ I轉化產物涂布于含有氨芐青霉素的LB培養基平板上，置于37°C培養箱培養過夜。培養12h后挑取單克隆，分別接種于3ml含氨芐青霉素的液體培養基，37°C振蕩培養過夜。利用質粒小提試劑盒(Solarbio)提取質粒，用BamHI和XhoI雙酶切驗證(如圖2)，瓊脂糖凝膠電泳檢測有I. 6kb左右的SRF目的片段，進一步將含有pcDNA3. I-SRF質粒的DH5a菌液送至上海生工生物技術有限公司進行測序鑒定，測序結果在Genebank數據庫中進行比對，證明閱讀框完全正確，pcDNA3. I-SRF質粒中含有SRF全長基因。(4)質粒DNA的大量提取，將pcDNA3. I-SRF質粒轉化大腸桿菌DH5 α，取菌液30 μ 1，接種到3ml含氨芐青霉素的LB培養基中，在37°C水浴搖床上震蕩培養過夜，利用去內毒素質粒大提試劑盒(Solarbio)操作步驟純化提取pcDNA3. I-SRF質粒備用。提取后的質粒進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，質粒超螺旋帶型清晰。同時利用核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad公司)對核酸進行定量分析，A260/A280 = I. 8 2. O為最佳。3.誘導人骨髓間充質干細胞向胰腺始祖細胞分化待分離獲得長期培養的間充質干細胞生長至70 80%，加入誘導培養基I (5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養基)，放入37V,5% CO2恒溫培養箱培養5 6小時，將間充質干細胞誘導為Nestin+細胞；吸去舊培養基，加入誘導培養基II (I Onmo I/L bFGF U Onmo I/L EGF,2% B27.0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養基)，放入37°C、5% CO2恒溫培養箱培養，48h首次半量換液，之后每3天全量換液一次，培養7天。4.在胰腺始祖細胞中轉染SRF真核表達質粒，誘導其向胰島素分泌細胞分化按照Effectene Transfection Reagent轉染系統將SRF基因轉染入胰腺始祖細胞，具體操作步驟如下在24孔板中預先加入O. 5mL含血清但不含抗生素的DMEM低糖培養基，置于37°C、5% CO2培養箱中孵育。細胞在轉染前匯合度達到60-70%，將培養基吸去，加入PBS漂洗一次后，加入O. 25%胰酶消化細胞，離心收獲細胞，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS漂洗細胞，離心去上清，加入重懸緩沖液R重懸細胞，使其終濃度為I. O X IO7個細胞/mL。將重懸的細胞轉移至I. 5mL無菌微量離心管中，按I μ g/每孔分別將不含SRF基因的pcDNA3. I質粒和含有SRF的pcDNA3. 1-SRF表達質粒加入到細胞懸液中，輕輕混勻。打開Neon 儀器開關，在Neon 管中加入3mL電解緩沖液，然后將它插入Neon 移液器吸頭架中，用Neon 移液器夾取一個Neon 吸頭，確保移液器與吸頭無縫隙。將Neon 吸頭浸入細胞-質粒混合物中，吸取IO uL混合物。然后將移液器垂直插入位于Neon 移液器吸頭架上的Neon 管中。在顯示屏上設置電轉參數為電壓990V，脈沖時間40ms，點擊次數I次，然后按下START鍵。當觸摸屏顯示Complete，說明電轉完成。將移液器取下，并吸頭中的樣品轉移至預先加入誘導培養基III (10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2%B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養基)孵育的孔板中。輕輕晃動培養板，確保細胞分布均勻。將培養板置于37°C、5% CO2培養箱中繼續培養48小時，進行半量換液，之后每3天全量換液一次，誘導其向胰島素分泌細胞分化。5.檢測分化后細胞的形態學變化在誘導分化過程中，順序利用誘導培養液I、誘導培養液II、誘導培養液III同時進行SRF基因修飾誘導細胞分化，經歷Nestin+細胞、胰腺始祖細胞、胰島素分泌細胞三個階段，利用倒置相差顯微鏡進行形態學觀察，結果如圖3所示，細胞在形態學上發生明顯變化，變圓并形成細胞簇。6.利用雙硫腙染色方法鑒定胰島素分泌細胞首先配置雙硫腙染色劑，50mg雙硫腙(DTZ)加入5mL DMSO溶解作為儲備液，用PBS稀釋終濃度為0. lmg/mL，抽濾除菌，配制為染色液。對于誘導分化的細胞和未誘導分化的細胞，用PBS漂洗2次，加入染色液，37°C溫育15min后鏡檢。結果如圖4所示，誘導分化后細胞著色較深，呈棕紅色。實施例2一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，本實施例使用的是pCMV-Tag2B作為載體，具體方法如下I.人骨髓間充質干細胞的分離、培養，同實施例I。2.構建pCMV-SRF真核表達質粒(I)以實施例I中構建好的pcDNA3. I-SRF質粒為模版，以pCMV_Tag2B作為載體，采用PCR的方法從pcDNA3. I-SRF質粒中擴增SRF基因片段，根據SRF的全長序列信息和所用pCMV載體信息設計引物，引物序列如下上游引物2 :5 ’ -ATCGGGATCCATGTTACCGACCCAAGCT-3 ’下游引物2 :5 ’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3 ’進行PCR擴增，將擴增得到的PCR產物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠純化方法純化回收獲得SRF基因片段。(2)將SRF基因和pCMV_Tag2B質粒用BamHI和XhoI雙酶切后，經T4DNA連接酶(Promega)連接，取連接產物轉化大腸桿菌DH5 α (轉化方法同實施例I)，將300 μ I轉化產物涂布于含有氨芐青霉素的LB培養基平板上，置于37°C培養箱培養過夜。培養12h后挑取單克隆，分別接種于3ml含氨芐青霉素的液體培養基，37°C振蕩培養過夜。利用質粒小提試劑盒(Solarbio)提取質粒,用BamHI和XhoI雙酶切驗證,瓊脂糖凝膠電泳檢測有I. 6kb左右的SRF目的片段，進一步將含有pCMV-SRF質粒的DH5 α菌液送至上海生工生物技術有限公司進行測序鑒定，測序結果在Genebank數據庫中進行比對，證明閱讀框完全正確，pCMV-SRF質粒中含有SRF全長基因(3)pCMV-SRF質粒的大量提取方法，同實施例I。3.誘導人骨髓間充質干細胞向胰腺始祖細胞分化，同實施例I。4.在胰腺始祖細胞中轉染SRF真核表達質粒，誘導其向胰島素分泌細胞分化轉染質粒為pCMV-SRF質粒，其他同實施例I。5.利用雙硫腙染色方法鑒定胰島素分泌細胞，同實施例I。6.利用RT-PCR的方法檢測胰島素分泌細胞特異性基因insulin的mRNA表達情況。誘導分化后，利用Trizol法提取培養細胞的總RNA，提取的總RNA用核酸定量儀檢測并定量。以mRNA為模板，采用Oligo (dT)為引物，利用M-MLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA。設計insulin的引物，由Invitrogen生物技術公司合成。引物序列如下正向引物3 :5 ’ -CAGCCGCAGCCTTTGTGAA-3 ’反向引物3 :5 ’ -TCCACAATGCCACGCTTCTG-3 ’利用反轉錄得到的cDNA為模板在95 V 5min, 32個循環擴增(95 V 30s、55. I0C 45s, 72 °C 60s)，72。。延伸IOmin的條件下進行PCR擴增。結果如圖5所示(A)代
表誘導培養基組合三步誘導法誘導間充質干細胞分化后，胰島素基因mRNA水平；(B)代表誘導培養基組合三步誘導法與轉錄因子SRF共同誘導人間充質干細胞分化后，胰島素基因mRNA水平。結果說明在誘導培養基組合與轉錄因子SRF共誘導之后胰島素的mRNA水平較高。實施例3一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，本實施例采用的是人臍血間充質干細胞，具體步驟如下I.人臍血間充質干細胞的分離、培養，同實施例I。取抗凝臍血和等體積的PBS混勻，利用Ficoll分離液分離單個核細胞層，PBS清洗，細胞計數，以2X IO7細胞密度接種，置于37°C、體積分數為5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。于貼壁2小時后更換新鮮培養液，待細胞達80%融合時以O. 25%胰酶和O. 02%EDTAl I混合笑話，進行傳代培養。2.含有SRF基因的重組真核表達質粒構建，同實施例I。3.誘導人臍血間充質干細胞向胰腺始祖細胞分化，同實施例I。4.在胰腺始祖細胞中轉染SRF真核表達質粒，誘導其向胰島素分泌細胞分化轉染質粒為pcDNA-SRF質粒，同實施例I。5.利用RT-PCR的方法檢測胰島素分泌細胞特異性基因insulin的mRNA表達情況，同實施例I。6.利用胰島素(INS)酶聯免疫分析(ELISA)實驗檢測培養基中胰島素分泌量誘導分化完成之后，吸取誘導培養基，PBS輕洗3遍，換用無血清H-DMEM培養基培養12h。收集培養基上清，-80°C保存備測。
利用胰島素酶聯免疫分析試劑盒(R&D)檢測步驟如下 (I)標準品的稀釋和加樣在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 μ L，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μ L，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ L分別加到第三孔、第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50 μ L，混勻；然后在第三、第四孔中先各取50 μ L棄掉,再各取50 μ L分別加到第五、第六孔中，再分別加入50 μ L標準品稀釋液，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ L分別加入到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加入標準品稀釋液50yL，混勻；混勻后從第七第八空中各取50 μ L分別加到第九、第十空中，加標準品稀釋液50 μ L混勻；混勻后各取50yL棄掉。(稀釋后沒孔加樣量都為50μ 1，濃度分別為12mU/L，8mU/L，4mU/L，2，mU/L,ImU/L),其余步驟與下面相同,繪制標準曲線。(2)加樣分別設空白孔(空白孔不加樣品和酶標試劑，其余步驟相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μ L，然后再加待測樣品10 μ L。加樣將樣品加于酶標板孔底部，混勻。(3)溫育用封板膜封板后置于37°C,30min。(4)配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。(5)洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30s后棄去，重復5次。(6)加酶每孔加入酶標試劑50 μ L，空白孔除外。(7)溫育同 3。(8)洗滌同 5。(9)顯色每孔先加入顯色劑Α50 μ L，再加入顯色劑B 50 μ L，輕輕混勻，37°C避光顯色15min。(10)終止每孔加終止液50 μ L，終止反應(此時藍色立轉黃色)。(11)測定以空白孔調零，450nm波長依序測定各孔吸光度。(12)計算根據標準曲線計算出每孔樣品的胰島素含量。結果如圖6所示，利用本發明方法所誘導分化的細胞能夠產生胰島素，并且，與只利用三種誘導培養基誘導細胞分化組相比，同時對細胞進行SRF基因修飾后的分化細胞產生胰島素量顯著升高，從5. 64±1. 04mU/L上升至12. 98±1. 86mU/L。
權利要求
1.一種體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)構建含有SRF基因的重組真核表達質粒； (2)誘導人間充質干細胞向Nestin+細胞分化當步驟(I)中細胞至70-80%融合時，去除原有培養基，加入誘導培養基I培養5 6小時； 所述步驟⑵中所述誘導培養基I為含有5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖； (3)誘導Nestin+細胞向胰腺始祖細胞分化在步驟(2)獲得細胞中，去除步驟(2)中誘導培養基I，加入誘導培養基II培養7 8天； 步驟(3)中所述的誘導培養基II為含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖； (4)誘導胰腺始祖細胞向胰島素分泌細胞分化在步驟(3)獲得細胞中，去除步驟(2)中誘導培養基II，加入誘導培養基III，同時轉染步驟(I)中的SRF基因的重組真核表達質粒，培養7 8天； 步驟⑷中所述的誘導培養基III為含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖。
2.根據權利要求I所述的體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征在于所述步驟(I)中構建含有SRF基因的重組真核表達質粒，真核表達載體為pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。
3.根據權利要求I所述的體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征在于步驟(2)中所述的人間充質干細胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來源的間充質干細胞。
4.根據權利要求I所述的體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征在于步驟(4)中所述的SRF真核表達質粒為去內毒素的質粒，質粒超螺旋帶型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。
5.根據權利要求I所述的體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征在于所述步驟⑶中所述的誘導培養基II為含有10nmol/L bFGF、10nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖。
6.根據權利要求I所述的體外誘導人間充質干細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征在于所述步驟⑷中所述的誘導液培養基III為含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養基，含25mM葡萄糖。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種體外誘導間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化的方法，技術方案構建SRF基因的重組真核表達質粒，真核表達載體包括是pEGFP、pcDNA或pCMV；將人間充質干細胞首先預誘導為nestin+細胞，進一步誘導為胰腺始祖細胞，然后將含有SRF基因的真核表達載體轉染到上述細胞中，最后誘導為胰島素分泌細胞。本發明可為糖尿病的細胞治療提供新的種子細胞來源，為間充質干細胞的定向誘導分化為胰島素分泌細胞和其臨床應用提供新的理論和實驗依據，并為與之相關的藥物開發和篩選提供了新的模型。
文檔編號C12N5/10GK102618500SQ20121007625
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月21日 優先權日2012年3月21日
發明者俞如發, 張同存, 王楠 申請人:天津科技大學