專利名稱：一種纖維素和木聚糖雙功能酶及其編碼基因和應用的制作方法
一種纖維素和木聚糖雙功能酶及其編碼基因和應用本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種纖維素和木聚糖雙功能酶及其編碼基因和應用。纖維素、半纖維素和木質素等是植物細胞壁的主要組成成分，纖維素大約占細胞干重的40-45%。纖維素類物質是地球上分布最廣、含量最豐富的碳源物質，占植物界碳含量的50%以上。纖維素酶(cellulase)是能將纖維素水解成葡萄糖的一組酶的總稱，分為內切-β -1，4-葡聚糖酶(endo-β -1,4-glucanase, EC3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase,又稱纖維二糖水解酶 cellobiohydrolase, EC3. 2. I. 91)和 β-葡 萄糖苷酶(β -glucosidase, EC3. 2. I. 21) (Τ0ΜΜΕ P, WARRENRAJ, GIL KESN R. Cellulosehydrolysis bybacteria and fungi. Adv Microbiol Physiol, 1995, 37 :1-811)。木質素約占細胞干重的15-25%，是一種復雜酚類聚合物。半纖維素概念由Schulze (1891)首先提出，指可用堿溶液從植物材料中萃取得到的多糖類物質，約占細胞干重的30-35%。半纖維素由雜聚多糖組成，其中木聚糖是最具代表性的半纖維素，木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶的總稱。β -1,4-內切木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)作用于木聚糖主鏈，隨機切開木聚糖內部的木糖苷鍵，將其分解為低聚糖。這兩種酶在飼料、造紙、食品、洗漆及生物能源中應用廣泛(Sipos B, BenkoZ,Dienes D, Reczey K, Viikari L, Siika-aho M(2010). Characterisation of specificactivities and hydrolytic properties of cel I-walI-degrading enzymesproduced by Trichoderma reesei Rut C30 on different carbon sources.AppI.Biochem. Biotechnol. 161(1-8) 161 :347-64. ；Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, HoondalGS.Microbial xylanases and their industrial applications a review.ApplMicrobiol Biotechnol. 2001,56 :326-338.)，這使得對纖維素酶及木聚糖酶的研究越來越受到人們的關注。纖維素酶是一種很好的飼料添加劑，將其加入到飼料中，可以促進飼料的降解，提高動物的消化利用率，進而提高畜牧業生產效益。木聚糖的抗營養性限制了許多谷物類飼料在畜牧業中的應用，作為飼料添加劑，木聚糖酶能夠幫助動物降低腸道中的食糜粘度，消除木聚糖造成的抗營養作用，增加飼料的吸收利用率。反芻動物能高效利用纖維性食物，與其瘤胃中的微生物能分泌產生高效降解纖維素的纖維素酶是分不開的。山羊瘤胃是纖維素被劇烈降解的環境，研究表明，山羊瘤胃中的微生物數量大、種類多，形成一個十分復雜的微生物生態系統，其中以85%上是未培養微生物(Krause DO, Denman SE, Mackie RI, Morrison M, Rae AL, Attwood GT, McSweeneyCS.Opportunities to improve fiber degradation in the rumen microbiology,ecology, ecology and genomics. FEMS Microbiology Review,2003,27(5) :663-693)。在這些未培養微生物中，含有著豐富的基因資源，這對于新型酶基因的發現提供有力的保障。目前，有許多學者已經從牛瘤胃中篩選出纖維素酶，如Bao Lei等(Lei Bao,Qiang Huang, Lei Chang, Jungang Zhou, Hong Lu. Screening and characterizationof a cellulase with endocellulase andexoceIlulase activity from yak rumenmetagenome. Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic. 73 (2011) 104-110)報道了從牦牛瘤胃微生物宏基因組文庫中篩選出一個兼行外切、內切的纖維素酶基因Rucel5B ;郭鴻等(郭鴻，封毅，莫新春，段承杰，唐紀良，馮家勛。水牛瘤胃宏基因組的一個新的β -葡萄糖苷酶基因umCel3G的克隆、表達及其表達產物的酶學特性)從水牛未培養微生物宏基因組文庫篩選出8個克隆表達的β -葡萄糖苷酶。但是，雙功能酶在瘤胃中的研究還是很少(除了 Chang Lei 等(Lei Chang,Mozhu Ding,Lei Bao, Yingzhi Chen, Jungang Zhou,HongLu. Characterization of a bifunctional xylanase/endoglucanase from yak rumenmicroorganisms. Appl Microbiol Biotechnol (2011)90 :1933-1942))。由于瘤胃中含有大量微生物，是纖維素等物質被降解的場所，但是這些分解纖維素類的微生物只有很少部分被培養。因此，構建山羊瘤胃微生物的宏基因組文庫，能極大可能篩選到更好的新型酶。
本發明人基于對上述問題的研究提出并完成本發明。本發明的第一個目的是提供一種纖維素酶及木聚糖酶雙功能基因cel28a。本發明的第二個目的是提供一種纖維素及木聚糖雙功能酶CEL28A。本發明的第三個目的是提供一種重組質粒。本發明的第四個目的是提供一種轉化體。本發明的第五個目的是提供上述纖維素及木聚糖雙功能酶的制備方法。本發明的第六個目的是提供上述纖維素和木聚糖雙功能酶在飼料工業上的應用。對于纖維素酶及木聚糖酶雙功能基因，本發明采用的技術方案是，所述的纖維素木聚糖雙功能酶基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，其長度為1596bp。對于纖維素木聚糖雙功能酶，本發明采用的技術方案是，所述的纖維素木聚糖雙功能酶具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，本發明的纖維素木聚糖雙功能酶基因編碼一個含有531個氨基酸的纖維素木聚糖酶，其中1-22個氨基酸間含有信號肽。對于一種重組質粒，其包括纖維素及木聚糖雙功能酶基因cel28a。對于一種轉化體，是經上述重組質粒轉化寄主細胞而獲得，宿主細胞為大腸桿菌。對于纖維素木聚糖雙功能酶的制備方法，包括將上述的轉化體，通過誘導蛋白表達、過Ni柱純化從而獲得重組纖維素、木聚糖雙功能酶的步驟。對于纖維素和木聚糖雙功能酶的應用，可將其作為一種飼料添加劑在飼料工業中得到應用。本發明纖維素木聚糖雙功能酶基因來源于瘤胃未培養微生物；本發明纖維素木聚糖雙功能酶在瘤胃環境中具有較好的穩定性。本發明提供了一個新的纖維素和木聚糖雙功能酶，因其具有雙功能性，耐熱性，可作為一種飼料添加劑應用于飼料工業中。該酶作用于含β_1，4-葡萄糖鍵型的纖維素類物質(如羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素)及含β_1，4-木糖鍵型的非淀粉多糖(如燕麥木聚糖)可以生成還原性的糖，這樣可以顯著提高單胃動物對纖維素或者非淀粉多糖的消化吸收；還降低了食糜粘度，增加了有益菌的繁殖，促進了營養物質的釋放，提高飼料利用率。因此該酶在飼料、食品等領域有著廣闊的應用前景。本發明所發現的新型酶，通過進一步了解該酶降解纖維素和木質素的過程與機理，為以后對瘤胃微生物進行調控，對飼料進行改良以提高飼料利用率，從而開發出經濟適用、安全高效的新型飼料提供理論依據，同時為其它動物飼料的開發提供有力借鑒。下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖I為山羊瘤胃微生物基因組文庫陽性克隆的限制性內切酶Not I酶切分析圖。 圖2為陽性克隆的部分酶切圖。圖3為目的片段全DNA序列的PCR擴增結果。圖4為重組質粒經Nde I和Xho I雙酶切后電泳鑒定圖。圖5為重組質粒PCR鑒定圖。圖6為纖維素木聚糖雙功能酶誘導與純化圖。圖7為纖維素木聚糖雙功能酶最適pH。圖8為纖維素木聚糖雙功能酶pH穩定性。圖9為纖維素木聚糖雙功能酶最適溫度。

圖10為纖維素木聚糖雙功能酶溫度的熱穩定性。圖11為不同化學試劑對纖維素木聚糖雙功能酶的影響。以下實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系EPI300和質粒 pIndigoBAC-5 (購自 Epicentre 公司);大腸桿菌(Escherichia coli)株系 DH5a和BL21 (DE3)(購自TransGen公司);克隆載體pUC19/Bam HI和限制性內切酶(購自Fermentas公司);表達載體pET28a(+)(購自Novengen公司);聚合酶(購自Takara公司)。一、纖維素酶編碼基因的獲得I)山羊瘤胃微生物宏基因組文庫的構建采集安徽白山羊瘤胃液，分離微生物細胞，通過低熔點瓊脂糖包埋裂解制備基因組DNA，獲得的DNA利用Hind III進行部分酶切，回收50kb以上的DNA片段，并與BAC載體連接，構建山羊瘤胃微生物宏基因組文庫(安娜，李呂木，許發芝，程建波.山羊瘤胃微生物宏基因組BAC文庫的構建與分析.激光生物學報，19 =659-662,694)。2)從山羊瘤胃微生物宏基因組文庫中篩選出表達纖維素酶活性的陽性克隆用96孔復制器將含有氯霉素的文庫中克隆(每個平板384個克隆)復制到含I %竣甲基纖維素納(carboxymethylcellulose sodium CMC)(購自 Sigma公司，目錄號01888)的LA平板和含氯霉素(12. 5ug/ml)的LA平板上，將平板倒置于37°C培養箱培養24小時后，將長滿菌落的含羧甲基纖維素鈉的LA平板用0. 5%剛果紅溶液染色15分鐘，用IM的NaCl溶液脫色15分鐘，然后檢測菌落周圍有無水解圈。出現水解圈的為陽性克隆，進一步提取該克隆的質粒DNA，再次轉化至E. coli EPI 300，重新涂布功能篩選平板，菌落周圍再次出現水解圈，確定為纖維素酶基因陽性克隆。其中一個克隆水解能力最強，用限制酶NotI鑒定插入片段大小，并用O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖I所示，泳道I為23kbpADNA/Hind III Marker (片段大小從大到小為 23130bp, 9416bp, 6557bp, 4361bp, 2322bp, 2027bp,564bp);泳道2為質粒經Not I酶切后有一條插入片段條帶和一條質粒BAC條帶；泳道3為陰性對照，不加質粒；泳道4為Ikb的marker (片段大小從大到小為IOOOObp,8000bp,7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)。圖中表明該陽性克隆插入到PBAC質粒上的片段大小為23Kbp左右。為了有效測定質粒上纖維素酶基因的DNA序列，采用亞克隆的方法對該基因進行縮小定位，使用限制性內切酶Sau3A I進行快速部分酶切，把酶切產物進行膠回收，然后與 PUC19/BamH I (購自 Fermentas 公司)質粒連接，使用 T4 DNA Iigase (購自 Fermentas公司)連接，連接產物轉化E. coli DH5 α，在含有I %羧甲基纖維素鈉的LA平板上篩選菌 落周圍有水解圈的轉化子，提取質粒并送至華大基因測序。圖2為Sau3A I快速酶切電泳圖，泳道 I Trans5k DNAMarker (片段大小從大到小為5000bp, 3000bp, 2000bp, 1500bp,1000bp，800bp，500bp，300bp);泳道2為提取的質粒；泳道3酶切質粒Imin ;泳道4為酶切質粒2min。根據圖中顯示,確定酶切2min質粒被切范圍小,適合做膠回收實驗。 得到的序列用軟件DNAStar (DNASTAR公司，版本7. 0)對序列進行拼接，并用ORF Finder 軟件尋找開放式閱讀框。利用 NCBI (National Center forBiotechnologyInformation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的 Blast 月艮務器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行相似序列搜索。得到纖維素酶的編碼基因，該基因具有序列表中序列I的DNA序列，命名為cel28a，該序列由1596個核苷酸組成。纖維素酶基因cel28a編碼一個含531個氨基酸的蛋白質。用DNAStar軟件預測蛋白質的理論分子量57，360. 20道爾頓，等電點pi為5. 13。用簡單結構研究工具(Simple Modular ArchitectureResearchTool SMART, http://smart, embl-heidelberg. de/)分析纖維素酶的結構及Signal P3. 0 (http://www. cbs. dtu. dk/services/Signal P/)找出信號妝。通過 BLAST對目的片段進行分析比較，發現其與來自Bacteroidescellulosilyticus DSM 14838的hypothetical protein具有序列相似性51%和同源性65%,信號肽位置在第22位氨基酸處。二、在大腸桿菌中的表達I)擴增cel28a基因的PCR引物設計用vector NTI軟件搜索酶切位點及primer permier 5. O軟件設計引物擴增序列，正向引物Fl和反向引物Rl的5’端分別加上Nde I和Xho I酶切位點(Fl和Rl中帶下劃線)，預計PCR反應將特異性地擴增出大約為1596bp的DNA條帶。擴增基因的PCR正向引物和反向引物分別為Fl :5’ GGAATTCCATATGATGTGTGGAGGAGATGACAGTTCAAG 3’Rl :5’ CCGCTCGAGCCATTTCGGTGCTTTGTTATATATTG 3’2) ce128a 基因的 PCR 擴增用含有目的基因pBAC質粒作為模板，以Fl和Rl為正反向引物作為PCR擴增反應。反應體系為模板5-30ng，lul正向引物(IOuM)，Iul反向引物(IOuM), dNTP 0. 25mM,5XFastPfu Buffer 10ul,FastPfu DNA polymerase :2. 5units(購自 TransGen 公司)，加水至50ul。PCR反應程序為第一階段預變性95°C，2min ;第二階段變性95°C，20sec，退火60°C，20sec ;延伸72°C，30sec，共35個循壞。第三階段延伸，72°C，5min。PCR反應特異性擴增出一條為1596bpDNA條帶。結果附圖3，其中泳道I為Trans5k DNA Marker(片段大小從大到小為5000bp, 3000bp, 2000bp, 1500bp, IOOObp, 800bp, 500bp, 300bp);泳道 2 為原質粒；泳道3為PCR反應特異性擴增出的一條1596bp的DNA條帶。將PCR產物經Nde I和Xho I雙酶切后，通過膠回收雙酶切的PCR產物。圖中顯示，片段已擴增出。3)重組質粒的構建及鑒定將雙酶切的PCR產物和相同雙酶切后的載體pET28a(+)，用T4 Iigase連接酶16°C過夜連接，連接產物轉化至BL21 (DE3)，提取重組質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定。圖4是重 組質粒的酶切電泳圖譜，泳道I為Ikb的marker (片段大小從大到小為IOOOObp,8000bp,7000bp,6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp);泳道 2-9 為重組質粒經Nde I 和Xho I雙酶切后釋放出一條5. 3kb的載體帶和一條與PCR產物同樣大小1596bp的外源插入片段的8個克隆。說明挑取的克隆中有假陽性的存在，從雙重鑒定中挑選出四個插入片段最佳的做PCR鑒定實驗。圖5是質粒PCR電泳圖，泳道I為Trans5k DNA Marker (片段大小從大到小為5000bp,3000bp,2000bp, 1500bp, lOOObp，800bp，500bp，300bp)，泳道 2-5 可以看到酶切正確的4個克隆均擴增出一條1596bp的DNA條帶。結果顯示片段已連接到載體上。4) ce 128a 基因在 E. coli BL21(DE3)中的表達、純化重組質粒轉化至BL21(DE3)中得到轉化體，在37°C下200rpm培養3. 5小時，在0D600 為 O. 6 時加終濃度為 ImM 的 IPTG(isopropy- β -D-thiogalactoside) 16 °C 過夜誘導表達，培養液15000Xg，5min收集菌體。將菌體用20mM Tris-HClbuffer (pH 7. 9，含有 500mM NaCl、5mM imidazole)，冰上超聲破碎。30，000 X g，4°C 離心 30min。將上清加到Ni-NTA(購自Novagen公司)親和層析柱上。圖6為轉化體誘導表達圖，泳道I為蛋白Marker (片段從到小為80kD、60kD、40kD、30kD、20kD、12kD);泳道2為空載體培養7小時圖；泳道3為重組質粒培養7小時圖；泳道4重組質粒誘導前蛋白圖；泳道5為重組質粒誘導后圖；泳道6為蛋白純化圖。結果表明，cel28a在大腸桿菌中得到了表達，菌體破碎后，發現蛋白為可溶性的，方便了酶學性質的分析。三、纖維素酶基因cel28a的活性和酶特異性底物分析I)纖維素酶活性測定用DNS法測定纖維素酶活將羧甲基纖維素鈉用0. IM pH 5. 5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋，取100 μ L稀釋酶液加底物I %的羧甲基纖維素鈉900 μ L，在50°C反應15min，加2mL DNS終止反應。對照則先加底物，反應結束后再加2mL DNS，最后加入100 μ L稀釋酶液，沸水煮5min，冷卻后于540nm波長下測其OD值，計算酶活。纖維素酶活性單位定義在一定條件下，每分鐘催化CMC生成Iumol還原糖所需的酶量為I個活性單位(IU)。2)酶特異性底物分析將不同的底物用乙酸-乙酸鈉(pH5. 0)緩沖液溶解溶度為I %，在酶反應最適pH和溫度下，測定纖維素酶對不同底物的作用。結果表明(表I)，纖維素酶對CMC、燕麥木聚糖的活力分別為20. 56±1. 75U/mg、12. 11±2. llU/mg，對濾紙、微晶纖維素有輕微的降解能力。說明該酶不僅具有纖維素酶活性還具有木聚糖酶活性。表I
權利要求
1.一種纖維素和木聚糖雙功能酶基因cel28a，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNO. I所示的核苷酸序列。
2.如權利要求I所述的纖維素木聚糖雙功能酶CEL28A，其特征在于，具有序列表中的SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.含有權利要求I所述的纖維素和木聚糖雙功能酶基因cel28a的重組質粒。
4.通過將權利要求3所述的重組質粒轉化寄主細胞而獲得的轉化體。
5.如權利要求4所述的轉化體，其特征在于寄主細胞為大腸桿菌。
6.一種纖維素和木聚糖雙功能酶的制備方法，其特征在于包括培養權利要求5所述的轉化體，通過誘導蛋白表達、過Ni柱純化從而獲得重組纖維素、木聚糖雙功能酶的步驟。
7.如權利要求2所述的纖維素和木聚糖雙功能酶在飼料工業中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種纖維素和木聚糖雙功能酶及其編碼基因和應用。cel28a具有SEQID NO.1所示的核苷酸序列或者同源序列，其中同源序列具有與SEQIDNO.2所示的氨基酸序列51％的同源性。該基因全長1596bp，編碼一個含531個氨基酸的纖維素、木聚糖雙功能酶，以及一個含有22個氨基酸的信號肽。本發明的纖維素木聚糖雙功能酶具有一定的耐熱性，可作為一種飼料添加劑應用于飼料等行業中。
文檔編號C12N15/63GK102634529SQ20121008466
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月20日 優先權日2012年3月20日
發明者姜海琴, 張子軍, 張運海, 李呂木, 王力生, 程建波, 章孝榮, 范彩云, 蔡海瑩 申請人:安徽農業大學