專利名稱：系統性紅斑狼瘡檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種系統性紅斑狼瘡的基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估系統性紅斑狼瘡發生的風險級別，并且指導系統性紅斑狼瘡高危人群提早預防和治療。
背景技術：
系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種較為常見的自身免疫性疾病，其特征為多種自身抗體的產生及免疫復合物的形成，最終由于針對自身的免疫反應造成幾乎全身各個系統的損害如循環系統、泌尿系統、消化系統以及中樞神經系統的病變。SLE的病因和發病機制尚未完全明了，目前認為該病屬于多基因遺傳病，遺傳因素及環境因素共同參與本病的發生、發展過程。SLE好發于女性，特別是育齡期婦女，累及心、 腦、腎等全身多個重要臟器。據估計，目前我國有SLE患者100多萬人，平均患病率位居全球第二位。眾多研究發現，該疾病具有較高的遺傳傾向，通過分子診斷檢測與SLE發生密切相關的基因位點就可以提前評估受檢者患SLE的風險，提早預防和治療。細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原 4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen4, CTLA-4)是活化T細胞表面所表達的一種膜融合蛋白，對T細胞的活化起關鍵的負性調節作用，因此CTLA-4基因成為自身免疫性疾病的一個侯選易感基因。研究數據顯示，CTLA-4基因第I外顯子A49G多態性除了與SLE的發生密切相關外，還與Graves眼病、白癜風、自身免疫甲狀腺病等相關。2004年徐安平等對中國南方地區人群研究結果顯示CTLA4基因-1722T/C位點多態性與SLE明顯相關，SLE患者TC基因型頻率明顯高于正常對照組。2009年孟煒課題組對中國南方人群研究發現CTLA-4基因-1722T/C位點與SLE 相關，病例組和對照組T/T、C/T、C/C基因型頻率有顯著差異，SLE患者TT基因頻率明顯升高。國內外的臨床研究數據顯示，CTLA-4基因-1722T/C位點多態性除了與SLE的發生密切相關外，還可以作為白癜風、乳腺癌等多種疾病發生的獨立危險因素。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因是葉酸代謝中的關鍵基因之一，維持正常的同型半胱氨酸水平。徐曉龔等2007年測定了 54例SLE患者和62例正常對照者的Hey、 VitB12葉酸的水平，并檢測MTHFR基因677位的多態性。結果顯示疾病組CC基因型頻率顯著低于正常對照組，總的突變T等位基因頻率顯著高于對照組。2009年，馮磊光等人對52 例SLE患者(男5例，女47例；平均年齡37 14. 34歲)及78例年齡性別相匹配的健康對照者(男8例，女70例；平均年齡34±8. 53歲)作病例-對照研究。結果發現，研究人群中MTHFR 677TT純合變異型及T等位基因在SLE患者中顯著增多，MTHFR基因677TT純合變異與SLE的發病有關，是SLE的危險因素。CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3個SNPs可以作為SLE的獨立危險因素進行基因檢測。因此，建立簡單、快速的系統性紅斑狼瘡易感基因檢測方法，及時篩查出易患系統性紅斑狼瘡的高危人群，有針對性的進行健康指導，對于保障人類安全健康具有非常重要的意義。

發明內容
基于CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3個SNPs位點基因型可用來評估系統性紅斑狼瘡發病風險級別，本發明提供一種系統性紅斑狼瘡基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3個SNPs位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70 %乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(I) CTLA4 (A49G)正向引物5’ -CTGAACACCGCTCCCATAAA-3’CTLA4 (A49G)反向引物5 ’ -GAATACAGAGCCAGCCAAGC-3 ’(2)CTLA4(T-1772C)正向引物5，-CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3，CTLA4(T-1772C)反向引物5’ -TGTATGTGGGTAGGAGATGGA-3’(3) MTHFR (C677T)正向引物5 ’ -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3 ’MTHFR (C677T)反向引物5 ’ -GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT-3 ’
PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I 分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1)CTLA4(A49G)測序引物5’ -CTGAACACCGCTCCCATAAA-3’(2)CTLA4(T-1772C)測序引物5，-CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3，(3)MTHFR(C677T)測序引物5’ -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3’反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98°C 2min，進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.為人群進行系統性紅斑狼瘡基因檢測的服務I.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CTLA4基因上A49G和T_1772C、 MTHFR基因上C677T的3個SNPs位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。3.系統性紅斑狼瘡基因高危人群風險評估分析通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具系統性紅斑狼瘡風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀系統性紅斑狼瘡基因檢測報告單。
權利要求
1.一種篩查系統性紅斑狼瘡高危人群的基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測 CTLA4基因上A49G和T_1772C、MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA檢測探針、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、 EDTA溶液、70 %乙醇溶液、100 %乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對CTLA4 基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性(SNPs)位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3個SNPs位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下(1)CTLA4 (A49G)正向引物5 ’ -CTGAACACCGCTCCCATAAA-3 ’CTLA4(A49G)反向引物5’ -GAATACAGAGCCAGCCAAGC-3’(2)CTLA4(T-1772C)正向引物5’-CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3’CTLA4(T-1772C)反向引物5’ -TGTATGTGGGTAGGAGATGGA-3’(3)MTHFR(C677T)正向引物5’-AGGGAGGCTTCAACTACGC-3’MTHFR(C677T)反向引物5’ -GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT-3’。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下(1)CTLA4(A49G)測序引物5’-CTGAACACCGCTCCCATAAA-3’(2)CTLA4(T-1772C)測序引物5’-CACAGAAGCAAAGAACCCAT-3’(3)MTHFR(C677T)測序引物5’-AGGGAGGCTTCAACTACGC-3’。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)PCR反應體系10XPCR 反應緩沖液 2. 5ul，25mM dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3.2uM DNA 測序引物 lul，125mMEDTA 溶液 Iul，100% 乙醇溶液 15111，70%乙醇溶液30111，！1101 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測系統性紅斑狼瘡基因突變位點方法，檢測探針以及檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CTLA4基因上A49G和T-1772C、MTHFR基因上C677T的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與檢測探針、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與系統性紅斑狼瘡發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型，從基因層面來評估系統性紅斑狼瘡的風險級別，提早預防系統性紅斑狼瘡的發病。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102605082SQ201210086798
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者姜麗, 李為為 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司