專利名稱：唐氏綜合征產前無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種唐氏綜合征產前無創檢測試劑盒，本診斷試劑盒能夠對第9周后的孕婦進行早期的檢測和診斷，根據檢測結果從基因層面準確診斷出胎兒是否患有唐氏綜合征。
背景技術：
新生兒中有少部分存在先天性遺傳病或出生缺陷，給社會和家庭帶來巨大的經濟和精神負擔。2007年中國有1564萬新生兒出生，其中出生缺陷率超過1%。出生缺陷是影響我國全民健康水平和人口素質的重要問題。國家“十一五”規劃綱要將生殖健康相關技術列為科技發展優先主題；2006-2020年國家中長期規劃也將“出生缺陷防治”作為重點領域和優先主題。我國每年約出生80 120萬缺陷嬰兒；造成經濟損失約10億元人民幣。 遺傳病是新生兒缺陷的最主要原因之一，而且許多先天性出生缺陷往往缺乏有效的治療方法，因此早期診斷和預防是目前降低出生缺陷的最有效措施。唐氏綜合征是小兒最為常見的由常染色體畸變性所導致的出生缺陷類疾病。顧名思義，該病是由先天因素造成的具有特殊表型的智能障礙。我國活產嬰兒中唐氏綜合征的發生率約為0.5%。-O. 6%。，男女之比為3 2，60%的患兒在胎兒早期即夭折流產。患兒的主要臨床特征為智能障礙、體格發育落后和特殊面容，并可伴有多發畸形，給患兒及家庭帶來極大的痛苦。因此，胎兒有否換上唐氏綜合征是孕婦選擇進行產前檢查的主要原因，是降低畸形兒出生率最為有效的辦法之一。現在世界上進行這類診斷通常是在孕期第16到18周間進行的，辦法一是通過子宮穿刺羊膜腔，從羊水中獲取胚胎細胞，二是提取胎盤組織進行活體檢查，但這兩種辦法都比較復雜，且都是采用介入式方法進行，對孕婦和胎兒有可能引起一定的損傷，甚至有時會引發宮內感染、羊膜破裂、流產、胎兒畸形或死亡等。由于其潛在的風險，此類診斷臨床上一般只針對高齡孕婦和有家族畸形遺傳史的孕婦進行，其排查和檢測的范圍小，因此，也難以對整個新生兒先天性遺傳病或出生缺陷的產前診斷做出足夠的貢獻。目前，開發新的方便、安全的胎兒基因或染色體診斷技術是國內外相關領域的熱點領域。比如從外周血中獲取或富集胚胎細胞用于胎兒遺傳診斷近年來取得了一定的進展。如法國國家衛生與醫學研究所(INSERM)的科學家利用胚胎細胞比母體血液細胞大的特點，嘗試從孕婦的血液中分離出胚胎細胞，然后再通過分析母體和父體基因的遺傳特性， 進行細胞篩選。對13名孕期為11到12周的孕婦進行的診斷實驗表明，這種細胞篩選法是可行的，母體血液化驗法在理論上可以替代羊膜腔穿刺術和胎盤活組織檢查。但是其檢查不同胎兒畸形癥狀時的敏感性、可靠性還有待確認，且由于胚胎細胞數量少，對于檢驗仍然存在較大的困難。本領域需要提供更方便、安全的非介入性胎兒基因或染色體診斷相關技術。本試劑盒正是基于此而開發的，只要孕婦的孕周達到12周，即可向醫生咨詢進行非侵入性的唐氏綜合征無創產前檢測，大大減輕了孕婦的痛苦和風險，具有很好的應用前景。

發明內容
基于能夠利用孕婦血液循環中游離的DNA來建立胎兒的有效DNA文庫，從而同時完成21號染色體三體綜合征，13三體綜合征，18三體綜合征的檢測。且結果準確，無假陽性和無假陰性的基礎上，本發明提供一種唐氏綜合征產前無創檢測試劑盒。該試劑盒包括T4 DNA連接酶緩沖液；Klenow 片段(5 單位 /ul)；T4多核苷酸激酶(T4 PNK)；接頭序列；DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。測序反應體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I. DNA 的獲取從孕婦的離體外周血液中提取的DNA片段。獲取孕婦的離體外周血衆，使用試劑盒QIAamp DNA Midi reagent set (Qiagen, catlog#51183)提取血漿中的游離DNA，方法是使用該試劑盒中的血液和體液處理方法 ("blood and body fluid" protocol) qDNA 的純化過程使用 the QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒自動進行在QIAcube (Qiagen 9001292)上進行，此步驟可通過這些試劑盒自動完成。·2.末端修復從孕婦的血液中提取的DNA是雙鏈DNA片段，這些片段是平端的，或含有3或5'突出端。這一步是通過T4 DNA聚合酶，大腸桿菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，和多核苷酸激酶T4，使突出端磷酸化成平末端。3'到5'外切酶活性去除3'突出端，聚合酶活性填充5'突出端。Sambrook等(1989)對這一步過程做了更詳細的解釋。重要的是這種方法采用了大腸桿菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，而不是用步驟三使用的缺失了到5'外切酶活性的Klenow片段。材料從血漿DNA 中提取 DNA (DNA I 至 5ng，30 μ I 水)。Τ4 DNA連接酶緩沖液與IOmM ΑΤΡ。dNTP s 的混合物(IOmM)。T4 DNA 聚合酶(3 單位 / μ I)。Klenow 片段(5 單位 / μ I)。Τ4 PNK (Τ4多核苷酸激酶，10單位/ μ I)，QIAquick PCR擴增純化試劑盒(QIAGEN 公司，目錄編號#28104)。程序(I)以I : 5的比例，用水稀釋lU/ul濃度的DNA偶合聚合酶。(2)準備以下反應的組合
權利要求
1.一種用于唐氏綜合征產前無創檢測篩查的試劑盒，其特征在于T4 DNA連接酶緩沖液、Klenow片段(5單位/ul)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、接頭序列、DNA測序引物、PCR反應組件、DNA測序反應組件等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的接頭序列是指將DNA片段進行修飾，從而能夠在PCR儀中進行擴增制備文庫的兩對特異性的接頭序列。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的PCR引物是指用PCR方法特異性擴增出接頭序列修飾后的DNA片段的一對PCR引物。
4.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是指針對于每個 DNA文庫第I號-第22號染色體進行測序統計分析的I條特異性測序引物序列。
5.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的2對接頭序列如下(1)接頭序列la 5/ ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'接頭序列 Ib : 5' pGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT3'(2)接頭序列2a 5/ pGATCGGAAGAGCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG 3'接頭序列 2b :5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT3'。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的I對PCR引物序列如下(1)PCR引物序列I5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3'(2)PCR 弓丨物序列 2:5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT3'。
7.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的I條測序引物序列如下測序引物序列5' ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'。
8.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1) 0 反應體系10父？0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測唐氏綜合征的產前無創檢測試劑盒。該試劑盒包括T4DNA連接酶緩沖液、Klenow片段(5單位/ul)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、接頭序列、DNA測序引物、PCR反應組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過從孕婦的外周血中建立離體的DNA文庫，能夠針對胎兒的基因組序列準確測序，從而用于胎兒的唐氏綜合癥篩查，且結果準確，無假陽性和無假陰性。并且檢測可以用于少量的離體外周血樣本，大大減輕了孕婦的痛苦和風險，具有很好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102605083SQ201210086800
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者伍建, 姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司