專利名稱：在大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法
技術領域：
本發明涉及ー種蛋白的表達和純化方法，更具體地說，涉及ー種采用麥芽糖結合蛋白/多聚組氨酸ニ元標 簽表達系統在大腸桿菌中表達和純化得到水通道蛋白AqpZ的方法。
背景技術：
水分子的跨膜運輸是生命的基本活動之一。水分子快速的跨膜運輸是生物體得以迅速地適應細胞外環境滲透壓變化的ー個重要的因素。水通道蛋白Aquaporins是重要固有蛋白的重要成員之一。它是水分子進出細胞專ー性的跨膜通道，因此在維持細胞內環境穩態發揮著重要的作用。水通道蛋白遍布整個生物界，從原核細菌到真核動植物都有水通道被鑒定出來。大腸桿菌水通道蛋白Aquaporin Z (AqpZ)是第一個被發現的原核生物水通道蛋白。由于AqpZ的發現，一系列新的水通道蛋白家族成員也被陸續解析出來。所以水通道蛋白AqpZ已經成為研究微生物水分子運輸、生物物理，生理及結構的模式蛋白。AqpZ的分子晶體結構已經被逐步的解析清楚。AqpZ是由具有6個跨膜區域，5個相互連接的環和2個保守的NPA box (asparagines-proline-alanine)裝配而成的。AcipZ的高度疏水性，經過強烈的壓縮之后形成了高度穩定且具有SDS抗性(SDS-Resistance)。在中性條件下，即使1%的SDS也不能使它解聚。在功能上，AqpZ對水有極高的滲透性，且該過程所需活化能很低，而且AqpZ是個“純”的水通道蛋白，不能夠運輸甘油和尿素等ー些小分子。研究表明重整到脂質體后，AqpZ表現出高度滲透系數(Pf=10*10_14 cm's^subunit^1)和低的滲透活化能(Ea=3. 8 kcal/mol)。以此速率,大約O. 14 μ g水通道蛋白AcipZ就能回收2. 4升的廢水(每個人每天最低需水量)。由于AqpZ結構和功能上的優勢，已被選作制備生物仿生復合膜的候選蛋白之一。但是缺乏有效手段獲得足夠量的AqpZ蛋白樣品已成為該技術的主要瓶頸之一。主要由于AqpZ蛋白強烈的疏水性，它在細胞內的大量表達會造成細胞毒性，影響宿主細胞的正常代謝，因此其表達水平受到大大的限制，AqpZ在大腸桿菌體系的表達量僅僅只有2. 5 mg/L。有研究表明采用融合表達策略可以大大提高AqpZ的表達水平，但是大部分蛋白都是以包涵體形式存在，仍然不能大量獲得具有生物功能的AqpZ。主要的原因是親水性標簽還不能夠完全中和AqpZ強烈的疏水性。因此，很難滿足結構學研究和制備基于水通道蛋白的水回收裝置的要求。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供了一種在大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，它包括以下步驟
(O大腸桿菌水通道蛋白AqpZ-HIS的擴增根據NCBI上的大腸桿菌水通道蛋白基因序列設計2對引物，通過設計引物在AqpZ基因的3’端人為的添加8個HIS親和標簽，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；根據pMAL-p2和pMAL_c5e這兩個載體的多克隆位點特點，在第一引物的上下游分別加上及 HI和I限制性內切酶位點以適用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分別加上及 HI和歷III限制性內切酶位點以適用于pMAL_c5e，利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA
(2)重組表達載體的構建將步驟I得到的帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的 DNA定向克隆到用同樣的內切酶雙酶切過的表達載體pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元標簽重組表達載體pMAL-p2-AqpZ_HIS及pMAL-c5e-AqpZ_HIS ;將這兩個二元標簽重組表達載體化到大腸桿菌DH5 a感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素的LB平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，進行雙酶切和測序鑒定;
(3)工程菌株的構建及誘導表達將步驟2鑒定正確的的質粒轉化到大腸桿菌表達宿主Rosetta (DE3)中，并接種到含有100 u g/mL氨芐霉素和34 u g/mL氯霉素的LB培養基中，在200-250轉/分鐘轉速、30°C下培養過夜，得到種子液；然后，把種子液接種到SOC培養基搖瓶中，種子液與SOC培養基的體積比為1:50，在200-250轉/分鐘轉速、30°C下培養至0D600為I. 5時加入IPTG至IPTG的摩爾濃度為0. 6 mM,并繼續誘導培養8小時，然后5000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，即得到超表達水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體；
(4)超聲波破碎步驟3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體，12000轉/分鐘離心10分鐘后收集上清；
(5)純化步驟4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。本發明的的有益效果是
(1)通過PCR方法在大腸桿菌水通道蛋白AqpZ基因序列的3’-端人為的添加8個組氣酸標簽，獲得具有8 X組氣酸標簽的基因序列；
(2)將基因序列克隆于含MBP融合表達標簽載體pMAL-p2及pMAL_c5e上，獲得二元標簽融合表達載體，使融合蛋白能夠在大腸桿菌中高效表達，并避免了由于AqpZ強烈的疏水性對宿主細胞造成的毒性；
(3)融合蛋白MBP-AqpZ-HIS為嵌膜表達保證了水通道蛋白空間折疊的正確性，為獲得功能性AqpZ奠定了基礎；
(4)通過特異性酶切可以將標簽MBP去除，后通過Co2+-NTA親和層析可以獲得高純度AqpZ-HIS ；
(5)首次利用二元標簽表達系統用于膜蛋白水通道蛋白AqpZ的表達與分離純化，對結構學研究和制備基于水通道蛋白的水回收裝置具有重要意義。


圖I 為 pMAL-p2-AqpZ_HIS 質粒圖譜；
圖 2 為 pMAL-c5e-AqpZ_HIS 質粒圖譜；
圖3為融合蛋白在4種不同宿主誘導和不誘導培養6小時后的生物量及對應的融合蛋白表達水平柱狀 圖4為SDS-PAGE分析融合蛋白在4種宿主中的表達情況電泳圖，圖中為無誘導樣品；
圖 5 為 Rosetta (DE3) /pMAL_p2-AqpZ_HIS 在 30°C下的生長曲線；
圖6為SDS-PAGE分析在不同生長階段(1，2，3，4，7小時)進行誘導對融合蛋白表達水平電泳圖，圖中“”為無誘導樣品，"marker ”為蛋白分子量標準；圖7為不同濃度IPTG濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM)誘導下融合蛋白的表達水平柱狀 圖8為SDS-PAGE分析不同濃度IPTG濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM)誘導下融合蛋白的表達水平電泳圖，圖中“”為無誘導樣品，“marker ”為蛋白分子量標準；
圖9為不同誘導后培養時間下融合蛋白的表達水平曲線；
圖10為SDS-PAGE分析不同誘導后培養時間下融合蛋白的表達水平電泳圖，圖中為無誘導樣品，“marker”為蛋白分子量標準；
圖11為融合蛋白MBP-AqpZ-HIS嵌膜表達的鑒定電泳圖，圖中，“Tot”破胞后上清；“M” 超高速離心下的沉淀即膜組分；“S” :超高速離心下的上清即可溶組分，“marker”為蛋白分子量標準；
圖12為融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的純化，圖中，I :上樣起始樣品；2，3:穿透樣品；4_9 洗脫樣品，“marker”為蛋白分子量標準；
圖13為融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的特異性酶切，圖中，I factor Xa酶切樣品；2 :腸激酶酶切樣品；3 :酶切前樣品，“marker”為蛋白分子量標準；
圖14為基于兩步親和層析法AqpZ-HIS的分離純化，圖中，I :上樣起始樣品；2，3 :穿透樣品；3，4，5:洗脫樣品，“marker”為蛋白分子量標準；
圖15為細胞裂解上清液的特異性酶切，圖中，I :腸激酶酶切后樣品；2 :腸激酶酶切前樣品，“marker”為蛋白分子量標準；
圖16為基于一步親和層析法AqpZ-HIS的分離純化，“marker”為蛋白分子量標準。
具體實施例方式本發明在大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，包括以下步驟
I、大腸桿菌水通道蛋白AqpZ-HIS的擴增根據NCBI上的大腸桿菌水通道蛋白基因序列設計2對引物。通過設計引物在AqpZ基因的3’端人為的添加8個HIS親和標簽。第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。根據pMAL-p2和pMAL-c5e這兩個載體的多克隆位點特點，在第一引物的上下游分別加上及 HI和I限制性內切酶位點以適用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分別加上及 HI和歷III限制性內切酶位點以適用于pMAL-c5e,利用聚合酶鏈式反應,得到帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA。pMAL-p2和pMAL-c5e這兩個載體為NEB公司的產品。2、重組表達載體的構建將步驟I得到的帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同樣的內切酶雙酶切過的表達載體pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元標簽重組表達載體pMAL-p2-AqpZ_HIS及pMAL-c5e-AqpZ_HIS ;將這兩個二元標簽重組表達載體化到大腸桿菌DH5 a感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素的LB平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，進行雙酶切和測序鑒定;
3、工程菌株的構建及誘導表達將步驟2鑒定正確的的質粒轉化到大腸桿菌表達宿主Rosetta (DE3)中，并接種到含有100 u g/mL氨芐霉素和34 u g/mL氯霉素的LB培養基中，在200-250轉/分鐘轉速、30°C下培養過夜，得到種子液。然后，把種子液接種到SOC培養基搖瓶中，種子液與SOC培養基的體積比為1:50，在200-250轉/分鐘轉速、3(^下培養至0D600為I. 5時加入IPTG至IPTG的摩爾濃度為0. 6 mM,并繼續誘導培養8小時，然后5000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，即得到超表達水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體。其中，Rosetta (DE3)為MERCK公司的產品。LB培養基包括10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉，溶劑為水。SOC培養基包括20g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，0. 5g/L氯化鈉，2. 5 mM氯化鉀IOmM氯化鎂，20mM葡萄糖。4、超聲波破碎步驟3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體，12000轉/分鐘離心10分鐘后收集上清。5、純化步驟4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。該步驟可以通過以下兩種方案來實現
純化方法之一向上清中加入Triton XlOO至Triton XlOO的體積百分比濃度為4%，室溫振蕩I小時，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清；上清上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱后，再用平衡緩沖液平衡，沖洗，最后用洗脫液洗脫結合到Co2+-NTA親和層析柱上的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS。采用脫鹽柱GlO將純化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的緩沖液置換到factor Xa工作緩沖液或腸激酶工作緩沖液中，加入腸激酶或factor Xa在20°C酶切10小時。將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，再次上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱，再平衡，沖洗最后用洗脫液洗脫結合到Co2+-NTA親和層析柱上的AqpZ-HIS，得到高純度的水通道蛋白AqpZ-HIS。上述的平衡緩沖液pH為8. 0，包括20mM Tris-HCl.O. 5M NaCl、20mM咪唑和1%Triton X100，上述的洗脫液 pH 為 8. 0，包括 20mM Tris-HCl.O. 5M NaCl、250mM 咪唑和 1%Triton XlOO ;腸激酶工作緩沖液 pH 為 8. 0，包括 50 mM Tris-HCl,2 mM CaCl2,50 mM NaCl和 1% Triton X100 ;factor Xa工作緩沖液為pH8. 0，包括50 mM Tris-HCl,2 mM CaCl2,200mM NaCl和1% Triton X100 ;它們的溶劑均為水，百分比除特別說明外，均為體積百分比。純化方法之二 向上清中加入Triton X100至Triton X100的體積百分比濃度為4%，室溫振蕩I小時，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清；加入腸激酶在20°C酶切20小時。將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱，再用平衡緩沖液平衡，沖洗，最后用洗脫液洗脫結合到Co2+-NTA親和層析柱上的AqpZ-HIS，得到高純度的水通道蛋白AqpZ-HIS。為讓本發明的上述和其他目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。步驟I、大腸桿菌基因組提取方法I)取I. 5ml在LB培養基中培養過夜的大腸桿菌菌液加入I. 5ml離心管中，12000轉/分鐘離心I分鐘收集菌體，棄上清。2)加入 190 u L TE 重懸沉淀，并加入 IOii L 10% SDS, 30 u L 10 mg/mL 溶菌酶，IuL 20 mg/L蛋白酶K混勻于37°C溫浴I小時。3 )加入 30 ii L 5 M NaCl，混勻。4)加入300 u L CTAB/NaCl混合溶液，混勻，于65°C溫浴20分鐘。5) 300 u L酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，12000轉/分鐘離心10分鐘。將
上清移至干凈離心管。6)加入300 UL氯仿/異戊醇(24:1)抽提，取上清至干凈離心管。7)加入300 u L異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10分鐘,沉淀DNA。8) 12000 rpm離心10分鐘，小心去除上清，加入700 u L 70%乙醇，12000轉/分鐘離心10分鐘，棄乙醇。9)風干除去殘留乙醇，用20111，用無菌水溶解大腸桿菌基因組0嫩。步驟2、構建 pMAL-c5e-AqpZ_HIS 工程菌
1)大腸桿菌水通道蛋白AqpZ基因的獲得
a)根據購于NEB公司的pMAL-p2和pMAL_C5e的多克隆位點序列特點和NCBI數據庫上面提供的大腸桿菌K12的水通道蛋白AqpZ的序列，按照引物設計原則，設計2對引物，用于擴增水通道蛋白AqpZ全長序列，其中在一條引物上下游分別加上ife HI和I限制性內切酶位點用于pMAL_p2，在另一條引物上下游分別加上歷III和及 HI限制性內切酶位點用于pMAL-c5e，并在下游引物上添加8個組氨酸標簽基因。第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。b)利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA :該反應程序如下預變性94°C，5分鐘；變性95 °C，30秒；復性58 °C，30秒；延伸72°C，I分鐘，共30個循環，最后一次反應延伸時間為10分鐘。取聚合酶鏈式反應產物進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，采用購于Qiagen公司的膠回收試劑盒回收瓊脂糖凝膠中的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA ；
2)重組表達載體pMAL-p2-AqpZ_HIS 和 pMAL-c5e-AqpZ_HIS 的構建
a)將水通道蛋白AqpZ基因用I和BamHI雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收水通道蛋白AqpZ基因片段，pMAL_p2空質粒同樣用這兩個酶進行酶切后回收雙酶切過的質粒片段；同樣地，將水通道蛋白AqpZ基因用III和及 HI雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收水通道蛋白AqpZ基因片段，pMAL_c5e空質粒同樣用這兩個酶進行酶切后回收雙酶切過的質粒片段；
b)將回收的水通道蛋白AqpZ基因片段和酶切過的質粒片段按濃度比41的比例加入200 u I小離心管中，用T4連接酶在16°C下連接過夜；
c )以上連接產物10 ill轉化200 ill 0&(12法制備的DH5a感受態細胞，然后，加入37°C預熱的LB培養基Iml后置于37°C搖床，在180轉/分鐘轉速下振蕩I小時。d)上述菌液在4000轉/分鐘轉速下離心I分鐘后，棄去Iml上清，剩余溶液用移液器輕輕吹打混勻后涂布在含有氨芐霉素的LB平板，并置于37°C培養箱培養12小時以上；、e)隨機挑取上述平板中的單菌落，小量擴增后提取質粒，抵后Bam HI和IiHind III和及 HI進行雙酶切鑒定，得到含有水通道蛋白AqpZ的重組表達載體pMAL-p2-AqpZ-HIS 和 pMAL-c5e-AqpZ_HIS ;其質粒圖譜分別見圖 I 和圖 2。步驟3、重組水通道蛋白Z表達 條件的優化
以載體pMAL-p2-AqpZ-HIS為例，來介紹重組水通道蛋白AqpZ表達條件的優化。在搖瓶培養環境通過單因素實驗設計，改變培養過程中的一個因素，其他因素不變，優化表達AqpZ基因工程菌表達條件。重組水通道蛋白AqpZ表達條件優化的因素包括表達宿主的優化，誘導時機的優化，誘導劑IPTG濃度的優化和誘導后培養時間的優化。a)表達宿主的優化將測序正確的克隆的質粒轉化到表達宿主BL21(DE3)，C41 (DE3), C43 (DE3)和Rosetta(DE3)中。挑取重組大腸桿菌單克隆到5ml含有相應抗生素的LB培養基，300C 220轉/分鐘培養過夜，然后以1:50的比例接種到新鮮的SOC培養基(50ml/250 ml)，30°C分別培養至0D600約為I. O后，加入IPTG至IPTG濃度為I. O mM, 30°C誘導6小時。5000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，用17 ml預冷的破胞緩沖液清洗菌體兩次后，重懸菌體后進行超聲波破碎(工作5s，停7s，功率300W 30個循環)10000轉/分鐘離心10分鐘上清即為可溶性蛋白。SDS-PAGE分析檢測融合蛋白MBP-AqpZ-HIS表達情況。結果見圖3，4。從圖中可以看出，融合蛋白MBP-AqpZ-HIS在這四種大腸桿菌BL21 (DE3)，C41 (DE3), C43 (DE3)及 Rosetta (DE3)分別為 175、153、163 和 186mg/L。Rosetta (DE3)為最佳表達宿主。通過比較誘導和沒有誘導最終的菌濃度發現此載體的表達產物并沒有對宿主細胞產生毒害作用。b)誘導時機的優化為了確定最佳的誘導時機，我們在測量了重組菌Rosetta(DE3) /pMAL-p2-AqpZ-HIS在30°C下的生長曲線結果如圖5，確定出該重組菌的不同的生長階段延滯期、對數生長期前期、對數生長期中期、對數生長期后期及穩定期，并分別加入IPTG至IPTG濃度為ImM，30°C下誘導培養6個小時后測定融合蛋白MBP-AqpZ-HIS蛋白表達量。結果如圖6，誘導時機對融合蛋白的表達水平有著明顯的影響，其中在對數生長期中期誘導時融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的表達水平最高。過早或太遲誘導都將導致表達水平急劇下降，尤其是延滯期及穩定期誘導目標蛋白基本不表達。c)誘導劑量的優化當菌體生長到對數生長期時(0D 1. 5)，加入IPTG至IPTG濃度分別為O. 2，O. 4，O. 6，O. 8，I. O mM，30°C下誘導培養6個小時后測定融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的表達量。結果如圖7，8，當誘導劑IPTG加入濃度為O. 6 mM時，融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的表達量達到最大值240 mg/L。d)誘導后培養時間的優化在30°C培養條件下，當菌體生長到對數生長期中期時用0.6 mM IPTG進行誘導，測定融合蛋白MBP-AqpZ-HIS表達水平隨誘導后培養時間的變化趨勢。如圖9，10所示，當誘導后繼續培養8個小時目標融合蛋白表達量達到最大值，即最佳的誘導后培養時間為8小時。e)最佳表達條件根據以上結果確定最佳的表達條件是以Rosetta (DE3)為表達宿主，在對數生長期中期開始用O. 6 mM IPTG誘導8個小時。步驟4 MBP-AqpZ-HIS嵌膜表達的鑒定
將表達有MBP-AqpZ-HIS的大腸桿菌破胞上清液等量分成若干份，160000g離心I小時。上清即為可溶組分，沉淀即為膜組分。SDS-PAGE分析檢測融合蛋白MBP-AqpZ-HI S分布情況。如圖11所示，結果表明MBP-AqpZ-HIS全部出現在細胞膜組分中，這揭示了MBP-AqpZ-HIS是以嵌膜形式表達的。步驟5 AqpZ-HIS的分離純化 I) AqpZ-HIS的分離純化方法之一
a)將上述步驟3中所得到表達重組水通道蛋白Z的發酵液于5000rpm,4°C離心10分鐘，棄上清收集菌體。所得菌體用預冷的細胞裂解液清洗兩次后，用平衡緩沖液重懸菌體；
b)重懸后菌液用超聲波進行破碎，超聲條件300瓦，工作7秒，間隔5秒，重復30次，冰浴。在4°C，13000轉/分鐘條件下離心，收集上清；
c)將上述上清液加入終濃度為4%Triton X100，在4°C下溫和溫和振蕩I小時。12000轉/分鐘離心30分鐘收集上清； d)取上清用10倍柱體積的平衡緩沖液平衡Co2+-NTA親和層析柱，加入上述上清并使其在柱內平衡，用平衡緩沖液沖洗Co2+-NTA親和層析柱后用洗脫液洗脫，然后用SDS-PAGE分析純化情況；結果如圖12所示，Co2+-NTA親和層析柱可以有效的純化融合蛋白MBP-AqpZ-HIS。e)采用脫鹽柱GlO將純化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的緩沖液置換到factor Xa或腸激酶的工作緩沖液中，加入腸激酶或factor Xa在20°C酶切10小時，然后用SDS-PAGE分析酶切情況；如圖13所示，factor Xa的酶切效率比腸激酶高，并且能夠將融合蛋白酶切完全，這為下一步的純化奠定了基礎。f)將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，再次上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱，用平衡緩沖液沖洗Co2+-NTA親和層析柱后用洗脫液洗脫，然后用SDS-PAGE分析純化情況；如圖14所示，洗脫下來的AqpZ-HIS在SDS-PAGE呈現出“一大一小，大主小次”的帶型。通過以分子量標準比較，其大的主帶大約為SOkDa位置與AqpZ-HIS四聚體的位置相對應，其小的次帶約為23kDa位置與AqpZ-HIS單體的位置相對應。通過以上結果可以看出方法I分離純化AqpZ-HIS是成功的。5) AqpZ-HIS的分離純化方法之二
a)將上述步驟3中所得到表達重組水通道蛋白Z的發酵液于5000rpm,4°C離心10分鐘，棄上清收集菌體。所得菌體用預冷的細胞裂解液清洗兩次后，用腸激酶的工作緩沖液重懸菌體；
b)重懸后菌液用超聲波進行破碎，超聲條件300瓦，工作7秒，間隔5秒，重復30次，冰浴。在4°C，13000轉/分鐘條件下離心；
c)將上述上清液加入終濃度為4%Triton X100，在4°C下溫和振蕩I小時。12000轉/分鐘離心30分鐘收集上清；
d)加入腸激酶在20°C酶切20小時，然后用SDS-PAGE分析酶切情況；結果如圖15所示，由于破胞上清液成分復雜干擾了酶切反應使得需要經過大約48小時才能將融合蛋白酶切完全。e)將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，再次上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱，用平衡緩沖液沖洗Co2+-NTA親和層析柱后用洗脫液洗脫，然后用SDS-PAGE分析純化情況；結果如圖16所示，與方法一相同洗脫下來的AqpZ-HIS在SDS-PAGE呈現出“一大一小，大主小次”的帶型。這說明方法2也是成功的。
權利要求
1.一種大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，它包括以下步驟 (O大腸桿菌水通道蛋白AqpZ-HIS的擴增根據NCBI上的大腸桿菌水通道蛋白基因序列設計2對引物，通過設計引物在AqpZ基因的3’端人為的添加8個HIS親和標簽，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；根據pMAL-p2和pMAL-c5e這兩個載體的多克隆位點特點，在第一引物的上下游分別加上及 HI和5 / I限制性內切酶位點以適用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分別加上及 HI和沿/？i/ III限制性內切酶位點以適用于pMAL_c5e，利用聚合酶鏈式反應，得到帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA (2)重組表達載體的構建將步驟I得到的帶組氨酸標簽的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同樣的內切酶雙酶切過的表達載體pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的ニ元標簽重組表達載體pMAL-p2-AqpZ-HIS及pMAL-c5e-AqpZ-HIS ;將這兩個ニ元標簽重組表達載體化到大腸桿菌DH5CI感受態中，然后，涂布在含氨芐霉素的LB平板上，培養過夜，隨機挑取平板上生長的菌落，堿法抽提質粒DNA，進行雙酶切和測序鑒定; (3)工程菌株的構建及誘導表達將步驟2鑒定正確的的質粒轉化到大腸桿菌表達宿主Rosetta (DE3)中，并接種到含有100 μ g/mL氨芐霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB培養基中，在200-250轉/分鐘轉速、30°C下培養過夜，得到種子液；然后，把種子液接種到SOC培養基搖瓶中，種子液與SOC培養基的體積比為1:50，在200-250轉/分鐘轉速、30°C下培養至0D600為I. 5時加入IPTG至IPTG的摩爾濃度為O. 6 mM,并繼續誘導培養8小時，然后5000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體，即得到超表達水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體； (4)超聲波破碎步驟3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體，12000轉/分鐘離心10分鐘后收集上清； (5)純化步驟4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。
2.根據權利要求I所述大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步驟(5)具體為向上清中加入Triton XlOO至Triton XlOO的體積百分比濃度為4%，室溫振蕩I小吋，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清；上清上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱后，再用平衡緩沖液平衡，沖洗，最后用洗脫液洗脫結合到Co2+-NTA親和層析柱上的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS ;采用脫鹽柱GlO將純化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的緩沖液置換到factor Xa工作緩沖液或腸激酶工作緩沖液中，加入腸激酶或factor Xa在20°C酶切10小時；將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，再次上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱，再平衡，沖洗最后用洗脫液洗脫結合到Co2+-NTA親和層析柱上的AqpZ-HIS，得到高純度的水通道蛋白AqpZ-HIS。
3.根據權利要求I所述大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步驟(5)具體為向上清中加入Triton X100至Triton X100的體積百分比濃度為4%，室溫振蕩I小吋，12000轉/分鐘離心30分鐘后收集上清；加入腸激酶在20°C酶切20小時；將酶切徹底的反應液用平衡緩沖液十倍稀釋后，上樣于用平衡緩沖液平衡好的Co2+-NTA親和層析柱，再用平衡緩沖液平衡，沖洗，最后用洗脫液洗脫結合到Co2+-NTA親和層析柱上的AqpZ-HIS，得到高純度的水通道蛋白AqpZ-HIS
全文摘要
本發明公開了一種在大腸桿菌中嵌膜表達和純化水通道蛋白AqpZ的方法，該方法首先擴增大腸桿菌水通道蛋白AqpZ-HIS，然后構建重組表達載體并構建及誘導表達工程菌株，超聲波破碎得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌體，最后純化得到水通道蛋白AqpZ；本發明實現了在大腸桿菌中高效表達麥芽糖結合蛋白-水通道蛋白AqpZ-多聚組氨酸二元標簽融合蛋白，克服了傳統超表達AqpZ對宿主細胞造成的毒性及形成不溶性包涵體問題；而且，通過本方法表達的水通道蛋白只需通過兩輪的簡單的親和色譜分離就可以得到高純度的水通道蛋白AqpZ，操作簡單可適用于工業化生產。
文檔編號C12N15/70GK102643849SQ20121010349
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者徐志南, 潘劍峰, 蔡謹, 黃磊 申請人:浙江大學