專利名稱：一種增強大腸桿菌l-苯丙氨酸胞外分泌的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種通過基因工程技術和發酵的手段增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。
背景技術：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是一種人體必需但自身無法合成的具有生理活性的芳香族氨基酸，也是一種重要的醫藥和食用化學品中間體，在醫藥行業主要用于生產抗腫瘤藥物和氨基酸輸液制劑，在食品行業主要用于合成二肽甜味劑阿斯巴甜，具有良好的應用前景。生產L-苯丙氨酸的方法主要有水解抽提法、化學合成法、酶法和發酵法四種，其中，微生物發酵法所利用原料廉價易得，又可在常溫常壓下進行，是目前國內外生產L-苯丙氨酸的主流方法。L-苯丙氨酸在大腸桿菌細胞內通過芳香族氨基酸合成代謝途徑合成:葡萄糖進入細胞后經過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤蘚糖，在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(AroG)的作用下進入莽草酸途徑，在莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脫氫酶(YdiB)等酶類的作用下合成分支酸，之后經分支酸變位元酶和預苯酸脫水酶(PheA)等酶作用生成芳香族氨基酸前體物，再經過酪氨酸轉氨酶(TyrB)的作用合成L-苯丙氨酸。從自然界中篩選出的具有產酸能力的微生物菌株一般氨基酸積累量有限；通過特別修飾選育出的突變株雖可提高L-苯丙氨酸的生產效率，但其盲目性大，工作量繁重，生產成本高，且突變株一般攜帶有營養缺陷，產量進一步提高受到限制。通過基因克隆手段解除代謝調控位點以促進目的產物合成已成功應用于檸檬酸、乳酸、琥珀酸等多種代謝產物的發酵生產，是L-苯丙氨酸工業化生產的必然趨勢，但是，L-苯丙氨酸的代謝調控受限于基因轉錄起始、轉錄過程、翻譯起始、翻譯過程、酶量、酶活等多水平、不同層次的反饋控制，且由于質粒載體的大小受到限制，很難通過過量表達連續的多個基因來解除所有的調控位點，此外，大腸桿菌在發酵過程中會積累副產物一乙酸，其可限制菌體的生長及目的產物的合成，降低產率。總之，可高產L-苯丙氨酸且發酵成本低廉的基因工程菌株目前尚未見報道，難以形成產業化。

發明內容
針對現有技術存在的上述缺陷，本發明的目的在于提供一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。本發明可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產量高，有害副產物乙酸濃度低，發酵成本低廉，工藝簡單，適宜產業化生產。本發明的技術方案如下:一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是將可同時過量表達酪氨酸轉氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸_7_磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA 、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質粒轉化宿主大腸桿菌,并通過液體發酵生產L-苯丙氨酸。
其進一步的技術方案為:所述重組質粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代謝調控，并插入載體構建而成；所述液體發酵條件控制如下:發酵培養基的起始葡萄糖濃度為3 15g/L，發酵過程中的葡萄糖濃度為I 4g/L ;發酵溫度35 42°C，發酵pH值6.5 7.5，通氣量0.5
1.0vvm，溶氧量為初始氧濃度的10 35%，發酵時間48 72h。所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因的天然啟動子被其它不受末端代謝產物反饋阻遏的強啟動子所替換，以增強其表達水平。所述TyrB編碼基因編碼框的起始堿基序列被SEQ ID NO:1所示的堿基序列替換，以解除其與阻遏蛋白TyrR的結合能力。所述AroG氨基酸序列中第146位的天門冬氨酸被替換成天門冬酰胺，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。所述PheA的R-domain結構域被刪除，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。所述強啟動子包括Pk和/或Plj啟動子本發明的有益技術效果如下:本發明運用基因工程手段將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾，如引入強啟動子、刪除結構域、堿基替換、氨基酸突變等，使上述基因所受的代謝調控得到解除，再插入載體成功構建得到可同時過量表達TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以 及YdiB的表達質粒,轉化該質粒的宿主大腸桿菌可高產L-苯丙氨酸；其中，通過增強L-苯丙氨酸合成代謝通路所需酶類(AroG、PheA、AroK、YdiB以及TyrB)的表達水平，可加快L-苯丙氨酸的合成速率，同時，YddG的表達增強可加快L-苯丙氨酸的胞外轉運速率，降低胞內濃度，從而降低L-苯丙氨酸對代謝合成途徑產生的反饋抑制，最終達到提高其代謝通量和發酵強度的目的；本發明方法可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產量高(可達62g/L)，有害副產物乙酸濃度低(< 3g/L)，發酵成本低廉，工藝簡單，適宜產業化生產。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明進行具體說明。以下實施例所涉及試驗材料如下:大腸桿菌擬合DNA提取自大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110 (購自美國模式菌種收集中心ATCC，保藏編號為ATCC NO:27325) ；pMD 18T_simpleVector購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內切酶EcoR 1、EcoRV、Afl I1、Nco
1、Kpn I，DNA聚合酶，連接酶均購自賽默飛公司；質粒pSY130-14 (包含Pl啟動子)由本發明人實驗室保藏，其構建方法可參照如下文獻報道:S Sugimoto, M Yabuta, NKato,T Seki,T Yoshida, H Taguchi(1987)Hyperproduction of phenylalanine byEscherichia col1:application of a temperature-controllable expression vectorcarrying the repressor-promoter system of bacteriophage lambda.Journal ofBiotechnology.5:237 - 253 ；RNAprep Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒(離心柱型含DNAase)購自天根生化科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time購自寶生物工程(大連)有限公司。其它原料和試劑為市售國產或進口分析純商品。所使用儀器設備均為本領域常規儀器設備。以下實施例所用種子培養基為LB培養基，其組成為:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，其余成分為水；所用液體發酵培養基組成為=K2HPO4.3H20 13.57g/L, KH2PO4 4.5g/L, (NH)4SO2 lg/L, MgSO4 lg/L, arginine0.lg/L, histidine 0.lg/L,isolecine 0.lg/L, valine 0.lg/L, proline 0.2g/L, p-aminobenzoic acid 0.02g/L, p-hydroxybenzoic0.02g/L, CaCl2 0.015g/L, VB10.075g/L, FeSO4.7H20 0.1175g/L, Na-Citrate 0.lg/L,微量元素溶液1.5ml/L,其余成分為水(微量元素溶液組成為:Al2(SO4)3.18H20 2g/L, CoSO4.7H20 0.75g/L, CuSO4.5H20 2.5g/L, H3BO3 0.5g/L,MnSO4.7H20 24g/L, Na2MoO4.2H203g/L, NiSO4.6H20 2.5g/L, ZnSO4.7H20 15g/L，其余成分為水)。實施例1構建過量表達AroG、PheA、AroK以及YdiB的質粒pR15ABK1.1 3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG代謝調控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板，用上游引物aroG15_F146 (堿基序列如SEQ ID NO: 2所示)和下游引物aroG_Hind III _RV (堿基序列如SEQ ID NO: 3所示)進行PCR擴增獲得基因片段A，以大腸桿菌擬核DNA為模板，用上游引物aroG_Kpn I _Fff (堿基序列如SEQ ID勵:4所示)和下游引物&1'0615_1 146 (堿基序列如SEQ ID NO: 5所示)進行PCR擴增獲得基因片段B。以基因片段A和B為模板，通過重疊PCR (按照PCR定點突變技術進行，參考文獻如下:Ho, S.N., H.D.Hunt, R.M.Horton, J.K.Pullen, and L.R.Pease (1989) Site-directedmutagenesis by overl ap extension using the polymerase chain reaction.Gene.77:51-59)擴增目的片段，引物設計如下:上游引物aroG_Sma I _FW堿基序列如SEQID N0:6所示，下游引物aroG_Afl II _EcoR I _RV堿基序列如SEQ ID N0:7所示，經上海生工生物工程有限公司測序，確定該片段AroG15基因編碼的AroG第146位天門冬氨酸被替換為天門冬酰胺。通過酶切連接反應將上述擴增片段連接到質粒pSY130-14上，具體方法參見相應限制性內切酶或連接酶說明書，構建得到質粒PR15，該質粒解除了苯丙氨酸對AroG基因的代謝調控，通過強啟動子Pk啟動AroG表達。1.2分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA代謝調控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板擴增PheA基因催化活性中心第I 900bp堿基序列，刪除負責反饋抑制的R-domain結構域,引物設計如下:上游引物pheA_Sma I _FW堿基序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物堿基序列pheA_Nco I _BamH I _EcoR V _RV如SEQ IDN0:9所示；通過酶切連接反應將該擴增片段連接到上述質粒PR15，具體方法參見相應限制性內切酶或連接酶說明書，構建得到質粒pR15A,該質粒解除了苯丙氨酸對AroG和PheA基因的代謝調控，通過強啟動子Pk啟動AroG表達，通過強啟動子啟動PheA表達。1.3莽草酸激酶AroK和莽草酸脫氫酶YdiB代謝調控的解除通過重疊PCR (方法同1.1)將AroK和YdiB編碼基因連接在一起，引物設計如下:第一對，上游引物ydiB_Sma I _FW堿基序列如SEQ ID NO: 10所示，下游引物ydiB_aroK_RV堿基序列如SEQ ID NO:ll所示，第二對，上游引物aroK_ydiB_FV堿基序列如SEQ ID NO: 12所示，下游引物aroK_Sma I _RV堿基序列如SEQ ID NO: 13所示；通過酶切連接反應將該擴增片段連接到上述質粒PR15A，位于PheA編碼基因后，具體方法參見相應限制性內切酶或連接酶說明書，構建得到質粒PR15ABK，該質粒解除了 AroG、PheA、AroK以及YdiB基因所受的代謝調控，并且使上述基因的天然啟動子被Pk和匕啟動子所替換，通過強啟動子Pk啟動AroG表達，通過強啟動子Pl啟動PheA、AroK以及YdiB的表達。實施例2酪氨酸轉氨酶TyrB代謝調控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板進行PCR擴增獲得tyrB編碼基因，引物設計如下:上游引物tyrB_EcoRV_SD_SB_FW堿基序列如SEQ ID NO: 14所示，下游引物tyrB_Afl II _EcoR I _RV堿基序列如SEQ ID NO: 15所示，其中，SD序列AAGGAGGAACAGAC為核糖體結合位點，SB序列ATGTTCCAGAAGGTCGATG (如SEQ ID NO:1所示)為替換后的tyrB基因編碼框起始堿基序列。將擴增獲得TyrB編碼基因與pMD 18T_simple Vector連接，經上海生工生物工程有限公司測序并鑒定正確后，通過酶切連接反應(具體方法參見相應限制性內切酶或連接酶說明書)與實施例1構建的質粒PR15ABK連接，將tyrB編碼基因置于強啟動子Pk后方，從而構建得到可同時過量表達TyrB、AroG、PheA、AroK以及YdiB的質粒，通過強啟動子Pk啟動AroG和tyrB表達，通過 強啟動子啟動PheA、AroK以及YdiB的表達；按照《分子克隆實驗指南》所述操作步驟轉化大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110進行液體發酵，發酵結束，測得發酵液中L-苯丙氨酸濃度為45g/L，乙酸濃度為2.2g/L。上述液體發酵生產方法具體如下:種子培養:取菌株接種于LB培養基，于33°C振蕩培養12h，搖床轉速200rpm，得到活化種子液。液體發酵培養:用高濃度葡萄糖液調整液體發酵培養基的葡萄糖濃度為15g/L，用濃氨水調整pH值至6.5 7.5，并調整通氣量為0.5vvm，發酵溫度為35°C，以體積百分比5%的接種量接種上述活化種子液，當菌體0D_=3.0時，調整發酵溫度為42°C，通氣量為
0.8vvm,改變攪拌轉速控制溶氧量為初始氧濃度的10 35%，通過流加高濃度葡萄糖液控制培養基葡萄糖濃度為4g/L，并通過流加濃氨水控制pH值為6.5 7.5，發酵48h。上述L-苯丙氨酸濃度測定方法:采用C18反向色譜柱，以7%甲醇為流動相，檢測波長210nm。上述乙酸濃度測定方法:采用Shodex SHlOll離子交換色譜柱在50°C的溫度下，以0.0lmol/L的稀硫酸為流動相，流速0.8ml/min，利用示差檢測器進行監測。實施例3甲基紫羅堿外轉運蛋白(methyl viologen efflux pump,YddG)代謝調控的解除以大腸桿菌擬合DNA為模板進行PCR擴增獲得yddG編碼基因，引物設計如下:上游引物 yddG_EcoRV_SD_FW 堿基序列如 SEQ ID NO: 16 所示，下游引物 yddG_NcoI_KpnI_RV堿基序列如SEQ ID NO: 17所示，其中，SD序列AAGGAGGAACAGAC為核糖體結合位點。將擴增獲得的yddG編碼基因與pMD 18T_simple Vector連接，經上海生工生物工程有限公司測序并鑒定正確后，通過酶切連接反應(具體方法參見相應限制性內切酶或連接酶說明書)與實施例2構建的質粒連接，將yddG編碼基因置于強啟動子匕后方，構建得到可同時過量表達YddG、TyrB、AroG、PheA、AroK以及YdiB的的重組表達質粒，通過強啟動子Pk啟動AroG和tyrB表達，通過強啟動子Pl啟動PheA、AroK、YdiB以及YddG的表達。按照《分子克隆實驗指南》所述操作步驟轉化大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110，構建得到增強型L-苯丙氨酸生產菌株E.coli W14，以E.coliW14作為發酵菌株，按照實施例2所述方法進行液體發酵，發酵結束，測得發酵液中L-苯丙氨酸濃度為55g/L，乙酸濃度為3g/L，測定方法同實施例1。實施例4 TyrB和YddG過量表達的熒光定量PCR驗證取E.coli W14 和 E.coli W3110 (含轉化質粒 pR15ABK 的大腸桿菌 Escherichiacoli str.K-12substr.W3H0)分別接種于LB培養基，于33°C過夜振蕩培養，然后以體積百分比5%的接種量接種至液體發酵培養基(補加終濃度為5g/L的葡萄糖)，于35°C振蕩培養9h，再轉為38°C培養，并于培養第Ilh和第15h取樣，采用RNApr印Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒(離心柱型含DNAase)提取總RNA，具體操作步驟參見試劑盒使用說明書，并米用 PrimeScriptRT Master Mix Perfect Real Time 在 CFX96 Bio-Rad Real-Time PCRDetection System (Bio-Rad)進行熒光定量 PCR，以 ihfB 作為內參基因，以 E.coli W3110作為對照菌株，于 CFX96 Bio-Rad Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)分別對tyrB,yddG和ihfB基因進行熒光定量PCR擴增，tyrB、yddG和ihfB基因的擴增上下游引物堿基序列(TyrBa、TyrBb，YddGa、YddGb，ihfBa、ihfBb)分別如 SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21 以及 SEQ ID N0:22、SEQ ID NO:23 所示，擴增條件如下:預變性95°C 30s,然后95°C 5s, 60°C 35s循環40次，并采用梯度稀釋法獲得標準曲線，yddG:y=-3.286X+11.895 (E=IOl.5%R2=0.981) ；tyrB:y=-3.334x+15.335 (E=99.5%R2=0.988)；ihfB:y=-3.364+21.121 (E=98.3.1%R2=0.988)，采用 Th' 法(參考文獻如下:LivakK, Shmittgen TD (2001)Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and t\\e2^^ Δετ method.Methods25:402 - 408)計算 tyrB 和 yddG 的表達水平，與E.coli W3110相比，E.coli W14菌株中tyrB和yddG的表達水平在培養第Ilh分別提高至4.85和5.17，第15h分別提高至12.57和5.97，證明E.coli W14菌株可同時過量表達tyrB和yddG。以上數據分析采用CFX Manager 3.0 (Bio-Rad)進行。實施例5 yddG的過量表達對胞內和胞外L-苯丙氨酸濃度的影響M9培養基中胞內胞外L-苯丙氨酸濃度測定方法:將E.coli W14和E.coliW3110(同實施例4，對照菌株)分別接種于LB培養基，于200rpm培養9h后，升溫至38°C繼續培養2h，取出菌體用無菌生理鹽水(0.9%NaCl)洗滌兩次，再用M9培養基(先配制5XM9鹽溶液=Na2PO4.7H20 12.8g，KH2PO4 3.0g, NaCl0.5g，NH4Cl 1.0g，滅菌，使用時取 5XM9 鹽溶液200ml,加入已滅菌的 lmol/L 的 MgSO4 2ml, lmol/L 的 CaCl2 0.1ml, 20%葡萄糖溶液 20ml,用滅菌雙蒸水定容至1000ml)調整0D_至6，于38°C培養，在lh、2h、3h和8h取樣測定胞內胞外L-苯丙氨酸濃度。胞內L-苯丙氨酸測定方法如下:取適量發酵液調整0D_至3 (相當于菌體數量為I 2X109CFU/ml)，離心收集ImL菌體，水洗兩次，加入250 μ L 35%高氯酸于振蕩器劇烈振蕩5min，加入280 μ L 2.7mol/L Na2CO3中和，離心除去細胞碎片，用作液相分析，L-苯丙氨酸濃度測定方法同實施例1 (假設大腸桿菌細胞體積為I μ m3)。實驗結果參見表I和表2。 表I M9培養基中胞外L-苯丙氨酸濃度變化
權利要求
1.一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法,其特征在于:將可同時過量表達酪氨酸轉氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸_7_磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質粒轉化宿主大腸桿菌，并通過液體發酵生產L-苯丙氨酸。
2.根據權利要求1所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述重組質粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG, AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代 謝調控，并插入載體構建而成。
3.根據權利要求1所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于所述液體發酵條件控制如下:發酵培養基的起始葡萄糖濃度為3 15g/L，發酵過程中的葡萄糖濃度為I 4g/L;發酵溫度35 42°C，發酵pH值6.5 7.5，通氣量0.5 1.0vvm，溶氧量為初始氧濃度的10 35%，發酵時間48 72h。
4.根據權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因的天然啟動子被其它不受末端代謝產物反饋阻遏的強啟動子所替換，以增強其表達水平。
5.根據權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述TyrB編碼基因編碼框的起始堿基序列被SEQ ID NO:1所示的堿基序列替換，以解除其與阻遏蛋白TyrR的結合能力。
6.根據權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述AroG氨基酸序列中第146位的天門冬氨酸被替換成天門冬酰胺，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。
7.根據權利要求2所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述PheA的R-domain結構域被刪除，以解除苯丙氨酸對其的反饋抑制。
8.根據權利要求4所述增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，其特征在于:所述強啟動子包括Pk和/或Plj啟動子。
全文摘要
本發明公開一種增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是將可同時過量表達酪氨酸轉氨酶TyrB、甲基紫羅堿外轉運蛋白YddG、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG、分支酸變位酶和預苯酸脫水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脫氫酶YdiB的重組質粒轉化宿主大腸桿菌，并通過液體發酵生產L-苯丙氨酸，所述重組質粒是將大腸桿菌來源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB編碼基因進行人工修飾以解除其所受代謝調控，并插入載體構建而成。本發明可明顯增強大腸桿菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸產量高，有害副產物乙酸濃度低，發酵成本低廉，工藝簡單，適宜產業化生產。
文檔編號C12R1/19GK103146773SQ201310074890
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者劉雙平, 石貴陽, 張梁, 丁重陽, 何冬旭, 李贏 申請人:江南大學