專利名稱：Edta在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用。
背景技術：
大腸桿菌表達系統是現今實驗室應用甚至工業生產應用最早、最為廣泛的表達系統。其本身天然的特點賦予其巨大的應用價值，這些特點包括(1)其全基因組測序完成， 遺傳背景非常詳細；(2)基因克隆表達系統成熟完善；(3)繁殖迅速、培養簡單、操作方便、 遺傳穩定；(4)細胞本身表達蛋白組分少、表達量低，易于純化回收外源重組蛋白；( 被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌由于其特殊的細胞壁結構所形成的滲透屏障，嚴重阻礙了它的工業生產應用，主要的限制因素有(1)外源重組蛋白只能在胞內表達，無法分泌到細胞外；(2)外源重組蛋白在胞內表達過程中易形成無活性的包涵體，嚴重降低重組蛋白的活性質量；(3) 外源重組蛋白表達量總體偏低。因此，實現大腸桿菌表達系統的胞外分泌同時提高其表達水平具有重要的工業應用價值。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種EDTA(乙二胺四乙酸) 在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，是基于發現EDTA具有提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量的性能所得到的技術方案；所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，具體包含以下步驟用誘導劑對含有重組載體的大腸桿菌進行誘導培養，加入EDTA或是加入EDTA和溶菌酶繼續培養即可；所述的重組載體優選為將核苷酸序列如下所示的堿性內切葡聚糖酶基因 III-3-a克隆到原核表達載體pET-28a (+)中得到的重組載體pET-28a_III-3-a或是將核苷酸序列如下所示的淀粉酶基因克隆到原核表達載體pET18a(+)中得到的重組載體 pET-28a-III-A ；堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a的序列如下所示GAAGGAAACACTCGTGAAGACAATTTTAATCATTTATTAGGTAATGACAATGTTAAGCGCCCTTCCGAG GCTGGCGCATTACAATTACAAGAAGTCGATGGACAAATGACATTAGTAGATCAAGATGGAGAAAAAATTCAATTACG TGGAATGAGTACACACGGATTACAATGGTTTCCTGAGATTTTAAATGATAACGCATACAAAGCTCTTACTAACGATT GGGAATCAAATATGATTCGTCTAGCTATGTATGTCGGTGAAAATGGCTATGCTTCAAATCCAGATTTAATTAAAAGC AGAGTCATTAAAGGAATAGATCTTGCTATTGAAAATGACATGTATGTCATTGTTGACTGGCATGTACATGCACCTGGTGATCCTAGAGATCCGGTTTAYGCffGGTGCAGAAGATTTCTTTAGAGAAATTGCAGCATTATATCCTAACAATCCAC
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AGAAAGAGGAAAGAGAAGCCGTGAAAGCTGAAAGAGAAGTAGCTAGAGAAGCAGCGAAAGAGGAAAGAGAAACCGCA
AAAGAAGAAAAGAAAGAGGCTACGAAAAAATAA ； 淀粉酶基因的序列如下所示 GTAAATGGCACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCATTGGAAACGATTG CAGAATGATGCGGAACATTTATCGGATATCGGAATCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACAAAGGAACGAGCCA ATCCGATAACGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAAAGGGACGGTCAGAACGAAAT ACGGCACAAAATCAGAGCTTCAAGATGCGATCGGCTCACTGCATTCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGGTT TTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCAACAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGCCAATAGAAATCAGGA AACTTCGGGGGAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATTTTCGTTTTCCGGGCCGTGGAAACACGTACAGTGATTTTA AATGGCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAATCCCGGAAGATCAGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGG GAAGGAAAAGCGTGGGATTGGGAAGTATCAAGTGAAAACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTA CGACCACCCTGATGTCGTGGCAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATGCGAATGAACTGTCATTAGACGGCTTCC GTATTGATGCCGCCAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGGTTCAGGCGGTCAGACAGGCGACGGGAAAA GAAATGTTTACGGTTGCGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAACTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAATCAATCCGTGTTTGATGTTCCGCTTCATTTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATATGAGGC GTTTGCTGGACGGTACCGTTGTGTCCGAGCATCCGGAAAAGGCGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACACAGCCG GGACAGTCATTGGAATCGACAGTCCAAACTTGGTTTAAACCGCTTGCATACGCCTTTATTTTGACAAGAGAATCCGG TTATCCTCAGGTGTTCTATGGGGATATGTACGGGACAAAAGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAGATA AGATAGAGCCGATTTTAAAAGCGCGTAAGGAGTACGCATACGGGCCCCAGCACGATTATATTGACCACCCGGATGTG ATCGGATGGACGAGGGAAGGTGACAGCTCCGCCGCCAAATCAGGTTTGGCCGCTTTAATCACGGACGGACCCGGCGG ATCAAAGCGGATGTATGCCGGCCTGAAAAATGCCGGCGAGACATGGTATGACATAACGGGCAACCGTTCAGATACTG TAAAAATCGGATCTGACGGCTGGGGAGAGTTTCATGTAAACGGAGGGTCCGTCTCCATTTATGTTCAGAAATAA ；所述的大腸桿菌通常指的是基因工程上常用于作為宿主菌的大腸桿菌，優選為大腸桿菌 E. coli BL21 Star (DE3)菌株；所述的誘導劑優選為IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)；所述的IPTG的使用條件優選為含有重組載體的大腸桿菌處于對數生長期時加入 IPTG, IPTG 的終濃度為 0. 1 1. Ommol/L ；所述的對數生長期指的是細胞在一定的環境下經過了短暫的適應期，進而快速生長的時期；所述的IPTG的使用條件更優選為含有重組載體的大腸桿菌的OD6tltl為0. 6時加入 IPTG, IPTG 的終濃度為 0. 2mmol/L ；所述的誘導培養的條件優選為23 30°C培養；更優選為23°C培養；所述的EDTA的加入時間為添加誘導劑后；所述的EDTA和溶菌酶的加入時間為添加誘導劑后；所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，更優選包含以下步驟(1)將含有重組載體的大腸桿菌培養至OD6tltl為0. 6時，加入IPTG于23°C、250r/ min誘導培養，IPTG的終濃度為0. 2mmol/L ；(2)誘導培養至第4 20h時加入EDTA，或是加入EDTA和溶菌酶；EDTA的終濃度為質量體積比0. 2 1%，溶菌酶的終濃度為0. 05 0. 25mg/L ；(3)繼續培養至菌體處于穩定期后期，收集上清；步驟( 更優選為誘導培養至第1 時加入EDTA，或是加入EDTA和溶菌酶；EDTA 的終濃度為質量體積比5%，溶菌酶的終濃度為0. 15mg/L ；步驟(3)中所述的穩定期指的是菌體的比生長速度等于零，培養液中菌體的濃度保持不變的階段；步驟(3)更優選為誘導培養18 25小時，收集培養上清。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(1)本發明發明人發現EDTA具有提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量的性能，而且與EGTA(乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸)、瓜氨酸、鹽酸胍和Triton X-100 相比，EDTA提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量的效果最佳。(2)本發明所提供的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用方法，操作簡單，成本低廉。(3)通過實驗證明，本發明所提供的應用方法能較好地將分子量較大、分泌較難的蛋白的胞外分泌量和表達量提高，以堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a為例，其包括M12個核苷酸，理論分子量(MWt)為90kD左右，是分子量較大、分泌較難的蛋白，根據數據比對可以發現本發明讓堿性內切葡聚糖酶的分泌量從10. 9%提升到66.3%，細胞表達重組蛋白總量(表達量)提高了 80%以上，在此方法下，細胞外重組蛋白分泌量高于不用EDTA和溶菌酶的表達重組蛋白總量，效果十分顯著。因此，本發明對其他分子量很大，表達分泌較難的外源蛋白有很好的參考價值，對分子量更小的蛋白有更好的參照價值。


圖1是pET_28a (+)表達載體圖。圖2是pET48a(+)表達載體多克隆位點圖。圖3是重組質粒的構建凝膠電泳圖，其中泳道M為 DNAmaker ；泳道 1 為 Bacillus sp. III-3 基因組；泳道 2 為基因 III-3-a ； 泳道3為重組質粒pETj8a-III-3-a ；泳道4為EcoR I和HindIII雙酶切的重組質粒 pET-28a-I-l-a 酶切圖。圖4是重組大腸桿菌誘導溫度對總酶活的影響圖。圖5是重組大腸桿菌IPTG濃度對酶活的影響圖。圖6是EDTA加入時間對胞外酶活的影響圖。圖7是同時加入EDTA和溶菌酶對表達量的影響圖。圖8是同時加入EDTA和溶菌酶對重組大腸桿菌生長趨勢的影響圖。圖9是EDTA和溶菌酶對胞外重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道M為protein maker ；泳道1為培養E. coli BL21的上清液；泳道2為培養重組菌E. coli III-3-a的上清液；泳道3為加入0. 15mg/mL溶菌酶后培養重組菌E. coli III-1-l-a的上清液；泳道4為加入0. 5% EDTA后培養重組菌E. coli III-1-l-a的上清液；泳道5為加入0. 5% EDTA和0. 15mg/mL溶菌酶后培養重組菌E. coli Ill-I+a的上清液。圖10是溶菌酶加入時間對胞外酶活的影響圖。圖11是加入EDTA和溶菌酶后不同誘導時間的培養液的SDS-PAGE電泳圖，其中 泳道M為protein maker ；泳道1-7分別為誘導培養12、14、16、18、20、22、M小時加入0. 5% EDTA和0. 15mg/mL溶菌酶后的上清液。圖12是加入EDTA對淀粉酶分泌量的影響圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1(一 )材料1、菌株和質粒芽孢桿菌Bacillus sp. III-3 (保藏號CGMCC No. 2138，保藏日2007 年 8 月 22 日，已在專利號200710030787. 6、名稱一種嗜堿芽孢桿菌及其產生的內切葡聚糖酶和應用中公布)作為堿性纖維素酶基因的原始菌，E. coli ToplOdnvitrogen公司)用于質粒的維護和操作，E. coli BL21Star(DE3) (Invitrogen公司)作為表達宿主菌。表達質粒為 pET-28a(+) (Invitrogen公司，其質粒圖譜如圖1所示，多克隆位點圖如圖2所示)。2、培養基每升培養基中含有10g復合蛋白胨，5g酵母粉，5NaCl，pH值為7。3、儀器MyCyclerTM thermal cycler PCR 儀、DNA 及蛋白電泳系統為 Bio-rad 公司產品； 分光光度計及微量分光光度計為Pharmacia Biotech公司產品；Thermomixer comfort溫控振蕩儀、移液槍、臺式離心機為Eppendorf公司產品；恒溫搖床及恒溫水浴鍋為WAGEN公司產品；勻漿機、低溫高速離心機為BECKMAN和Sigma公司產品；Dolphin-DOC成像系統為美國WEALTEC公司產品。( 二)實驗方法1、重組大腸桿菌的構建芽孢桿菌Bacillus sp. III-3基因組的獲得方法參照omega基因提取試劑盒說明書；DNA限制性酶切、連接、PCR擴增均參照Takera試劑說明書；用于擴增堿性纖維素酶基因III-3-a的引物(上海生工合成)為上游引物(EcoRI) :5，-CCGggatccGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3，下游引物(HindIII):5，-CCCacgcgtTTATTTTTTCGTAGCCTCTTTC_3，；PCR產物和表達質粒pET48a(+)經雙酶切后連接轉化E. coli ToplO獲得重組質粒pETj8a-III-3-a，轉化E. coli BL2 IStar (DE3)，經菌液PCR和測序，檢驗獲取重組大腸桿菌 E. coli III-3-a。2、堿性纖維素酶活力的測定用ImL pH 8. O 的 Tris-HCl 緩沖液(0. Olmol/L)制備的 (質量百分比)CMC-Na 溶液，加入100 μ L經適當稀釋的酶液，40°C反應30min，加入ImL DNS (3，5- 二硝基水楊酸) 溶液(DNS溶液的濃度為0. 63% )沸水浴10分鐘，再加入2mL蒸餾水于540nm測定還原糖， 并扣除空白試驗測定值。將上述條件下每小時由底物產生Img葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力國際單位，用U/mL表示，葡糖糖濃度用DNS法測定。3、SDS-PAGESDS-PAGE根據Sambrook等的方法進行。4、發酵溫度對酶活的影響將過夜培養的菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD6tltl為0. 6時加入終濃度為lmmol/L的誘導物IPTG，分別置于23°C、30°C、37°C、250r/min培養，誘導培養0、2、4、 8、12、16、20小時后測總酶活。5、IPTG濃度對酶活的影響將過夜培養的菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD6tltl為0. 6時加入終濃度為 0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 2mmol/L 的誘導物 IPTG，置于 23°C 250r/min 培養，誘導培養 0、2、 4、8、12、16、20小時后測總酶活。6、誘導時菌體濃度對酶活的影響將過夜培養的菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD600為0. 4,0. 6,0. 8、1. 0時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，置于23°C 250r/min培養，誘導培養0、2、4、 8、12、16、20小時后測總酶活.7、不同化合物對酶活的影響將過夜培養菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD6tltl為0. 6時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，在23°C、250r/min進行誘導培養，誘導培養12個小時后加入培養基終濃度分別為0,0. 2%,0. 5%U. 0%U. 5%,2.0% (g/ml)的EDTA、EGTA、瓜氨酸、鹽酸胍、Triton X-100，誘導培養16和20個小時后用培養基上清液測細胞外酶活。8、EDTA加入時間對酶活的影響將過夜培養菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD6tltl為0. 6時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，在23°C、250r/min進行誘導培養，誘導培養4、8、12、16個小時后加入培養基終濃度分別為0. 5%的EDTA，誘導培養20個小時后用培養基上清液測細胞外酶活。9、溶菌酶及EDTA和溶菌酶對胞外酶活的影響將過夜培養菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待0D_為0. 6時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，在23°C、250r/min進行誘導培養，誘導培養12個小時后加入培養基終濃度分別為0和0. 5% (g/ml)的EDTA，再同時分別加入培養基終濃度為0. 05、 0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3mg/mL的溶菌酶，誘導培養14、16、18、20、22小時后用培養基上清液測細胞外酶活。10、溶菌酶及EDTA和溶菌酶對重組大腸桿菌生長趨勢的影響將過夜培養菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待0D_為0. 6時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，在23°C、250r/min進行誘導培養，誘導培養12個小時后加入培養基終濃度分別為0和0. 5% (g/ml)的EDTA，再同時分別加入培養基終濃度為0. 05、 0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3mg/mL 的溶菌酶，誘導培養 12、14、16、18、20、22 小時后取 0. 5mL 菌液稀釋5倍于600nm測吸光值。11、溶菌酶加入時間對酶活的影響將過夜培養菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD6tltl為0. 6時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，在23°C、250r/min進行誘導培養，誘導培養12個小時后加入培養基終濃度分別為0和0. 5% (g/ml)的EDTA，再分別在誘導培養12、14、16、18、20小時后加入培養基終濃度為0. 15mg/mL的溶菌酶，誘導培養22小時后用培養基上清液測細胞外酶活。12、EDTA和溶菌酶對細胞酶活的影響將過夜培養菌種500微升加到50毫升LB培養基中，待OD6tltl為0. 6時加入終濃度為0. 2mmol/L的誘導物IPTG，在23°C、250r/min進行誘導培養，誘導培養12個小時后加入培養基終濃度分別為0和0. 5%的EDTA和0. 15mg/mL的溶菌酶，誘導培養20小時后用培養基上清液測細胞外酶活，同時離心去除上清液，加PH為9的Tris-HCl緩沖溶液，再檢測細胞內酶活。(三)實驗結果1、重組大腸桿菌的構建以芽孢桿菌Bacillus sp. III-3基因組為模板PCR獲得M12bp堿性纖維素酶基因III-3-a(核苷酸序列如SEQ ID :N0. 1所示)，用EcoR I和HindIII雙酶切基因III_3_a與質粒pET18a(+)，再連接獲得表達質粒，經轉化、檢測獲得重組大腸桿菌E. coli III-3-a (結果如圖3所示)。2、發酵溫度對酶活的影響經測定，重組大腸桿菌E. coli III-3-a在23°C培養時酶活力最高，結果如圖4所
7J\ ο3、IPTG濃度對酶活的影響經測定，IPTG培養基終濃度為0. 2mmol/L時重組大腸桿菌E. coli III-3-a酶活力最高，結果如圖5所示。4、不同化合物對酶活的影響分別向培養基中加入適量五種典型的化合物，增強大腸桿菌的膜通透性，使目的蛋白分泌到培養基。經測定，EDTA在五種化合物中效果最好，在誘導培養12小時后加入培養基終濃度為0. 5%的EDTA能使重組大腸桿菌E. coli III-3-a胞外原始酶活從2. 3U/mL 提高到17. 4U/mL,結果如表1所示。表 權利要求
1.EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用。
2.根據權利要求1所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于包含以下步驟用誘導劑對含有重組載體的大腸桿菌進行誘導培養，加入 EDTA或是加入EDTA和溶菌酶繼續培養；所述的大腸桿菌指的是用于作為宿主菌的大腸桿菌。
3.根據權利要求2所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于所述的重組載體為將核苷酸序列如SEQ ID :No. 1所示的堿性內切葡聚糖酶基因III-3-a克隆到原核表達載體pET48a(+)中得到的重組載體pET-28a-III-3-a或是將核苷酸序列如SEQ ID:N0.2所示的淀粉酶基因克隆到原核表達載體pET- a(+)中得到的重組載體pETj8a-III-A。
4.根據權利要求2所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于所述的誘導劑為IPTG ；所述的誘導培養的條件為23 37°C培養。
5.根據權利要求4所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于所述的IPTG的使用條件為含有重組載體的大腸桿菌處于對數生長期時加入IPTG， IPTG的終濃度為0. 2 1. Ommol/Lο
6.根據權利要求2所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于所述的大腸桿菌為大腸桿菌E. coli BL21Star(DE3)0
7.根據權利要求2所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于所述的EDTA的加入時間為含有重組載體的大腸桿菌處于對數生長期；所述的EDTA和溶菌酶的加入時間為含有重組載體的大腸桿菌處于對數生長期。
8.根據權利要求1 7任一項所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于包含以下步驟(1)將含有重組載體的大腸桿菌培養至OD6tltl為0.6時，加入IPTG于23°C、250r/min誘導培養，IPTG的終濃度為0. 2mmol/L ；(2)誘導培養至第4 20h時加入EDTA，或是加入EDTA和溶菌酶；EDTA的終濃度為質量體積比0. 2 1%，溶菌酶的終濃度為0. 05 0. 25mg/L ；(3)繼續培養至菌體處于穩定期后期，收集上清。
9.根據權利要求8所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于步驟( 為誘導培養至第1 時加入EDTA，或是加入EDTA和溶菌酶； EDTA的終濃度為質量體積比5%，溶菌酶的終濃度為0. 15mg/L。
10.根據權利要求8所述的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用，其特征在于步驟(3)為繼續培養18 25小時，收集上清。
全文摘要
本發明公開了EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用。本發明發明人發現EDTA具有提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量的性能，而且與EGTA、瓜氨酸、鹽酸胍和Triton X-100相比，EDTA提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量的效果最佳。本發明所提供的應用方法中，是在用誘導劑對含有重組載體的大腸桿菌誘導培養后，再加入EDTA或是加入EDTA和溶菌酶繼續培養即可。本發明所提供的EDTA在提高大腸桿菌重組蛋白胞外分泌量和表達量中的應用方法，操作簡單，成本低廉，而且能較好地將分子量較大、分泌較難的蛋白的胞外分泌量和表達量提高。
文檔編號C12N9/42GK102392003SQ201110329338
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者劉森林, 杜坤, 邢苗, 陳偉釗 申請人:深圳大學