專利名稱：一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)dha的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及w-3多不飽和脂肪酸DHA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生物合成方法。
背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(PUFAs)是ー類被廣泛研究和關(guān)注的脂肪酸。PUFAs主要包括Co-6和《-3PUFAS兩種類型，每ー種類型都包括多個(gè)從短碳鏈(18C)到長(zhǎng)碳鏈(22C)的、且含有多個(gè)不飽和鍵的脂肪酸。越來(lái)越多的研究證明，PUFAs具有廣泛的生物學(xué)功能，它們參與細(xì)胞膜的構(gòu)成并作為許多細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程中的信號(hào)分子，與人類的多種疾病的發(fā)生緊密相關(guān)，其適宜的含量對(duì)于人類及其他哺乳動(dòng)物的正常發(fā)育和保持良好的健康狀況極其重要。
-6PUFAs從總體上來(lái)說(shuō)對(duì)人體意義不大，其過(guò)量的攝入反而危害人體健康。《 -3PUFAs已經(jīng)被證實(shí)在預(yù)防和治療心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、癌癥等多種疾病方面有著重要作用。其中特別是二十ニ碳六烯酸(docosahexaenoic acid ；DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid, EPA),對(duì)人體健康具有重要的積極意義。DHA可促進(jìn)腦、視網(wǎng)膜形成和延緩腦的衰老。英國(guó)腦營(yíng)養(yǎng)化學(xué)研究所的Michael教授在首屆國(guó)際DHA學(xué)術(shù)討論會(huì)上提出“DHA不僅可以促進(jìn)人腦活動(dòng)，還使頭腦聰明”。后來(lái)的研究證實(shí)=DHA是人腦的主要組成物質(zhì)之一，約占人腦脂肪的10%左右。主要以磷脂的形式存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞如大腦突觸體細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞如視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的膜磷酯酰こ醇胺中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則從反面證實(shí)，若神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜中DHA積累不足，可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜電流圖波形改變及視覺(jué)靈敏度下降。G. J. An-derson研究了 EPA對(duì)小雞腦發(fā)育的影響。他發(fā)現(xiàn)，EPA能迅速在腦中合成DHA并蓄積，這說(shuō)明DHA是真正對(duì)腦的發(fā)育起重要作用的物質(zhì)。因此，在腦的早期形成過(guò)程中，適時(shí)、適量、持續(xù)補(bǔ)充人體必需的多不飽和脂肪酸是重要的和必要的。DHA對(duì)維持腦的功能、延緩腦的衰老也起重要作用。如果缺乏DHA，已形成的腦的突起會(huì)逐漸萎縮，腦細(xì)胞間的信息傳遞能力就會(huì)下降，同時(shí)還會(huì)使感觀功能衰退。日本研究證實(shí)，DHA在一定程度上可以提高腦的柔軟性，抑制腦的老化，有益健腦。DHA能改善心腦血管功能和大腦供能狀況，使大腦的自我營(yíng)養(yǎng)體系得到完善，因而對(duì)因年齡等萎縮死亡的腦細(xì)胞起明顯的修復(fù)作用。所以，給大腦補(bǔ)充DHA在一定程度上能達(dá)到預(yù)防、治療老年性癡呆的目的。DHA可起到降血脂、預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的功能。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病，也是世界上死亡率最高的疾病之一。高血脂是致病的重要因素。大量的實(shí)驗(yàn)表明富含EPA和DHA的魚(yú)油能有效地降低血液中的中性脂質(zhì)、總膽固醇、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白。DHA降膽固醇的作用較EPA強(qiáng)。DHA可抑制腫瘤生長(zhǎng)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，以海產(chǎn)物為主食的愛(ài)斯基摩婦女，因患 乳腺癌而死亡的人非常少。成澤富雄報(bào)道魚(yú)油中DHA和EPA均具有抑制直腸癌的作用，而且DHA的抑制效果更強(qiáng)。Dustin等發(fā)現(xiàn)DHA能抑制巨噬細(xì)胞的激活及具有殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。DHA還可降低治療胃癌、膀胱癌、子宮癌等抗腫瘤藥物的耐藥性，并且高純度DHA可抑制大腸粘膜上產(chǎn)生異常腺窩及抑制異常腺窩的生長(zhǎng)。在濃度為2. 0mg/ml吋，DHA和EPA都能使PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)減少65%。DHA可起到抗炎、抑制過(guò)敏反應(yīng)的作用。愛(ài)斯基摩人患喘息性氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等以自身免疫異常為原因的慢性炎癥性疾病的發(fā)病率明顯低于當(dāng)?shù)氐陌追N人。大量從海魚(yú)、海獸中攝取DHA、EPA無(wú)疑是ー個(gè)重要的原因。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂EPA的動(dòng)物，其實(shí)驗(yàn)性炎癥的水腫程度降低。DHA和EPA在陸地動(dòng)物中含量甚微或根本沒(méi)有。但在高等動(dòng)物的腦組織、眼角膜、肇丸及精液中，都含有較高的DHA。DHA屬于《3系列長(zhǎng)碳鏈多不飽和脂肪酸，它們和《6系列的脂肪酸在動(dòng)物體內(nèi)是不能相互轉(zhuǎn)化的。在人體中，能將從植物中攝取的a-亞麻酸微量地轉(zhuǎn)化為EPA和DHA，能滿足一般人的健康需要。但是老年人、幼兒及糖尿病人則不能將a -亞麻酸有效地轉(zhuǎn)化為EPA和DHA。這些 人需要從食物中直接攝取EPA和DHA。由于哺乳動(dòng)物及人類自身都不能合成的《_3PUFAs (也不能合成《-6PUFAs)，因此人體對(duì)它們的需要必須依靠從食物來(lái)源獲取。由于自然界《-6PUFAs豐富而《-3PUFAs極少，從而使人體中《-6PUFAs的攝入過(guò)多而《_3PUFAs仍然嚴(yán)重不足，人體中《-6/ -3的比率高達(dá)16以上。因此，人體増加其攝入量成為合理利用脂肪酸的關(guān)鍵。由于DHA對(duì)維持健康的重要性，以及良好的療效和很小的副作用等優(yōu)點(diǎn)，使它ー躍而成為ー種新型的營(yíng)養(yǎng)品、保健品和療效食品。廣泛被用于保健膠囊、食品、飼料等產(chǎn)品中。日本已把高含量DHA魚(yú)油確定為21世紀(jì)的智能食品加以開(kāi)發(fā)應(yīng)用。我國(guó)自“九五”規(guī)劃起也把DHA/EPA作為“海洋藍(lán)色工程”的重要項(xiàng)目之一來(lái)進(jìn)行實(shí)施開(kāi)發(fā)。我國(guó)衛(wèi)生部也批準(zhǔn)了不少魚(yú)油EPA、DHA方面的保健食品。如何獲取到豐富的DHA是當(dāng)今世界范圍內(nèi)人們所關(guān)心的ー個(gè)問(wèn)題。目前的主要來(lái)源是海產(chǎn)魚(yú)油。魚(yú)油中DHA和EPA的含量并不穩(wěn)定，受魚(yú)的品種、季節(jié)及產(chǎn)地的影響。魚(yú)油中二者的含量在4% 40%之間，由于所用的原材料大都很貴，產(chǎn)品價(jià)格昂貴。另外魚(yú)油有魚(yú)腥味，使得應(yīng)用受到一定的限制，重金屬汞污染也是ー個(gè)限制應(yīng)用因素。另外一條途徑是利用真菌和藻類生物合成DHA，可克服魚(yú)油資源的限制，產(chǎn)品也沒(méi)有腥臭味。研究表明，ー些微生物具有合成EPA、DHA的能力。主要有真菌和藻類。水霉目的破囊壺菌Thraustochytrium和裂埴壺菌Schizochytri-um能產(chǎn)生有意義含量的DHA,金藻中的DHA含量約為10%;甲藻也含有高含量的DHA。隨著一系列《3脂肪酸去飽和酶基因的發(fā)現(xiàn)和功能驗(yàn)證，通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)《-3PUFAs已經(jīng)逐步成為科學(xué)家們所努力的方向。《_3脂肪酸去飽和酶基因是 -3PUFAs合成的關(guān)鍵基因，它們利用《-6PUFAs為底物在脂肪酸碳鏈甲基端第三個(gè)碳催化生成ー個(gè)不飽和鍵(烯鍵)而合成相應(yīng)的《-3PUFAs。近年來(lái)，各國(guó)的科學(xué)家克隆了多個(gè)《_3脂肪酸去飽和酶基因，但其中大部分基因只能合成18C的《-3PUFAs，開(kāi)發(fā)利用價(jià)值不大。雖然也有報(bào)道能夠合成更長(zhǎng)鏈的《_3PUFAs基因，如真菌Saprolegnia diclina的w_3脂肪酸去飽和酶能夠合成20C的co_3PUFAs,另一種真菌Mortierella alpina 1S-4不但能夠合成20C的《-3PUFAs，還能合成18C的《_3PUFAs。但直到目前尚未見(jiàn)這些基因被用于基因工程技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物手段來(lái)生產(chǎn)《_3PUFAs。真正被用于此類研究的基因是來(lái)自于線蟲(chóng)C. elegans的《 _3脂肪酸去飽和酶基因fat_l。該基因被轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及小鼠中能使從18C到22C的《-3PUFAs的含量増加，顯示出來(lái)很大的可開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。但美中不足的是所合成的《_3PUFAs中價(jià)值更大的22C的DHA的水平仍然很低。
自1978年Dyerberg發(fā)表有關(guān)愛(ài)斯基摩人的流行病學(xué)調(diào)查以來(lái)，對(duì)EPA和DHA的生理和藥理作用的研究已取得顯著成就，研究范圍從原來(lái)的基礎(chǔ)研究，藥理和臨床研究，逐步擴(kuò)大到作為醫(yī)藥品、高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品的應(yīng)用研究。由于EPA和DHA是理想的療效食品或營(yíng)養(yǎng)品，極少的毒副作用，可以期待在我國(guó)也為大眾所接受和歡迎。所以，培養(yǎng)富含EPA和DHA的陸生哺乳動(dòng)物如豬等，必將有ー個(gè)光明的前途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是ー種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)DHA的方法及其專用試劑盒本發(fā)明所提供的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)DHA的試劑盒，包括《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因和哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因。所述《-3脂肪酸去飽和酶基因?yàn)榫€蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae)的《_3脂肪酸去飽和酶基因，優(yōu)選為sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因?yàn)樾∈笾舅嵫娱L(zhǎng)酶基因，優(yōu)選為小鼠elovl2基因，所述 小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?yàn)樾∈笾舅崛ワ柡兔富颍瑑?yōu)選為小鼠A6desaturase基因，所述小鼠A 6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3。所述試劑盒中還包括真核表達(dá)載體，所述真核表達(dá)載體為pCAGGS，真核表達(dá)載體pCAGGS購(gòu)自Addgene，其序列已經(jīng)由該公司公布；所述試劑盒還包括抗性篩選標(biāo)記基因；所述抗性篩選標(biāo)記基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因和hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，優(yōu)選為序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸！neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，優(yōu)選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優(yōu)選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。本發(fā)明還提供一種制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的方法。所述制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的方法是利用上述試劑盒制備哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，具體是將《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞中，篩選獲得穩(wěn)定整合及表達(dá)《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。所述《-3脂肪酸去飽和酶基因?yàn)榫€蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae)的《_3脂肪酸去飽和酶基因，優(yōu)選為sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因?yàn)槭笾舅嵫娱L(zhǎng)酶基因，優(yōu)選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?yàn)槭笾舅崛ワ柡兔富颍瑑?yōu)選為小鼠A 6desaturase基因，所述小鼠A6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為鼠細(xì)胞，優(yōu)選為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Kl(CH0-K1)。所述co-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因和哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因先分別以真核表達(dá)載體為出發(fā)載體，分別構(gòu)建得到表達(dá)《_3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因的重組表達(dá)載體和表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體，然后三個(gè)重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，篩選得到所述哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；所述真核表達(dá)載體為pCAGGS，pCAGGS購(gòu)自addgene公司，其序列已由該公司公布。所述重組表達(dá)載體是以真核表達(dá)載體為出發(fā)載體，將所述真核表達(dá)載體先插入抗性篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建具有抗性篩選標(biāo)記的重組表達(dá)載體，然后插入所述《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因或哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因，獲得表達(dá)《_3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因的重組表達(dá)載體或表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體；所述抗性篩選標(biāo)記基因zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5,端第564-938位核苷酸，優(yōu)選為自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核 苷酸，優(yōu)選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優(yōu)選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。上述方法制備的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍本發(fā)明所提供的促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)DHA的方法，是利用上述試劑盒制備哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，促進(jìn)該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系生產(chǎn)DHA，具體步驟包括I)利用上述試劑盒按照上述的方法制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；2)以花生四烯酸為底物培養(yǎng)步驟I)所述的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，獲得細(xì)胞內(nèi)DHA積累量提高的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述培養(yǎng)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系所用的培養(yǎng)基為添加花生四烯酸的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，所述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基為添加終濃度為10% (體積百分含量)小牛血清，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基；所述花生四烯酸在所述添加花生四烯酸的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為25-75umol/L，優(yōu)選50umol/L。所述方法還包括提取培養(yǎng)后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的脂肪酸，獲得DHA含量提高的脂肪酸。上述L-谷氨酰胺的添加量為2mM ;非必需氨基酸的添カロ量為 L-Alanine 15mg/L, L-Asparagine H208. 9mg/L L-Aspartic acid 13. 30mg/L, L-Glutamic acid 14. 70mg/L, Glycine7. 50mg/L, L-Proline 11. 50mg/L, L-Serine10.50mg/L。所述方法中，所述培養(yǎng)時(shí)間為48-96小時(shí)，優(yōu)選72小時(shí)。本發(fā)明所提供的試劑盒可以用于制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，或者轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)(使用顯微注射方法及體細(xì)胞克隆方法獲得上述試劑盒中的三種基因在動(dòng)物染色體上穩(wěn)定整合及表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)提高動(dòng)物體內(nèi)DHA含量。本發(fā)明促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)DHA的方法將所述試劑盒中的線蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae)的 _3脂肪酸去飽和酶基因如(如sfat-1)與哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(如elovl2)及哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因(如A6desaturase)三者共同轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，將該細(xì)胞系以花生四烯酸為底物進(jìn)行培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成豐富的DHA。原理是將線蟲(chóng)C. briggssae的《_3脂肪酸去飽和酶基因sfat_l、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因elovl2、哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因A6desaturase在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中共表達(dá)，以花生四烯酸為出發(fā)原料，經(jīng)sfatl轉(zhuǎn)化成EPA，再經(jīng)elovl2和A 6desaturase進(jìn)行碳鏈的延伸和去飽和作用，生成DHA。在這個(gè)過(guò)程中，通過(guò)供給充足的底物，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)入的三個(gè)基因的共同作用，使細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)方向由底物向產(chǎn)物方向進(jìn)行，從而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)生成豐富的DHA。通過(guò)對(duì)CHO-kl細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)證明，該方法促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DHA的生成，使細(xì)胞脂肪酸中的DHA產(chǎn)量大大增加，由占細(xì)胞總脂肪酸的I. 02%增加到7. 31%。


圖I為陸生哺乳動(dòng)物從植物中攝取18碳的a -亞麻酸微量地轉(zhuǎn)化為EPA和DHA 的過(guò)程示意2為pCAGGS-sfatl-zeo表達(dá)載體示意3為pCAGGS-sfatl-zeo表達(dá)載體NcoI酶切鑒定4為pCAGGS-elovl2_neo表達(dá)載體示意5為pCAGGS-elovl2_neo表達(dá)載體EcoRI和KpnI雙酶切酶切鑒定6 為 pCAGGS- A 6desaturase_hygro 表達(dá)載體不意7 為 pCAGGS- A 6desaturase_hygro 表達(dá)載體 EcoRI、NcoI、PvuI 單酶切酶切鑒定8 為 A 6desaturase (通過(guò)表達(dá)載體 pCAGGS-A 6desaturase_hygro)、elovl2 (通過(guò)表達(dá)載體 pCAGGS-elovl2_neo)、sfatl (通過(guò)表達(dá)載體 pCAGGS-sfatl-zeo)三基因共轉(zhuǎn)CHO-Kl細(xì)胞的陽(yáng)性單細(xì)胞克隆的RT-PCR鑒定。圖8中，1-4 :無(wú)模板對(duì)照，5_8 :轉(zhuǎn)染三種空載體的CHO-Kl單細(xì)胞克隆，9-12和13-16 :轉(zhuǎn)染三種表達(dá)載體的陽(yáng)性單克隆13號(hào)和 28 號(hào)。1、5、9、13 擴(kuò)增 A6desaturase 基因，2、6、10、14 擴(kuò)增 elovl2 基因，3、7、11、15 擴(kuò)增sfatl基因，4、8、12、16擴(kuò)增內(nèi)參GAPDH基因。圖9為轉(zhuǎn)染單個(gè)sfatl表達(dá)載體和共轉(zhuǎn)染三基因表達(dá)載體的CHO-Kl單克隆細(xì)胞的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)脂肪酸測(cè)定圖；3 :單轉(zhuǎn)染sfatl的CHO-Kl單克隆的脂肪酸測(cè)定。DHA峰出現(xiàn)在27. 13的位置，含量占總脂肪酸的I. 02% ；2 :轉(zhuǎn)染三種基因的CHO-Kl單克隆的脂肪酸測(cè)定。DHA峰出現(xiàn)在27. 22的位置。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染三種基因的CHO-Kl細(xì)胞中生成了更為豐富的DHA，含量占總脂肪酸的7. 31%。
具體實(shí)施例方式我們研究組克隆了來(lái)自于線蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去飽和酶基因sfat-Usimilar to fat_l)，研究表明該基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因豬中均能有效地把《 -6多不飽和脂肪酸(《 -6PUFAS)轉(zhuǎn)變成《 -3多不飽和脂肪酸(《 -3PUFAs)，在我們制備的sfat-1轉(zhuǎn)基因豬肌肉組織中，生成的20碳的EPA約占總脂肪酸含量的16%，DHA約占總脂肪酸含量的4%。sfat-1和fat_l基因功能的研究提示我們，來(lái)自于線蟲(chóng)的這兩個(gè)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最適合轉(zhuǎn)化生成20碳的EPA，而DHA的生成量依然遠(yuǎn)低于EPA。很有意思的是，在我們的轉(zhuǎn)基因豬肌肉組織的脂肪酸測(cè)定結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)20碳的EPA的確是來(lái)源于20碳的花生四烯酸，即20碳的花生四烯酸在sfatl基因產(chǎn)物的催化下，去飽和生成了 20碳的EPA，從結(jié)果中可以看到花生四烯酸的大幅度減少和EPA的大幅度生成，兩者之間存在明確的此消彼長(zhǎng)關(guān)系。而DHA盡管也達(dá)到了占總脂肪酸4%的含量，但是在GC-MS圖上并看不到上述此消彼長(zhǎng)的現(xiàn)象，事實(shí)上，生成DHA的22碳的《 6脂肪酸底物原料在豬肌肉中本來(lái)就含量極少，不足以作為底物支持4%的DHA產(chǎn)出。因此，我們推測(cè)4%的DHA的產(chǎn)出并不是以22碳的《6脂肪酸為原料而生成的，而應(yīng)該是豬利用內(nèi)源性的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以生成的豐富的EPA為原料，經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)和去飽和兩步作用，而生成了 4%的DHA。據(jù)此我們推測(cè)，如果能夠強(qiáng)化這種內(nèi)源性的延長(zhǎng)和去飽和作用，就能夠以“接力棒式”的轉(zhuǎn)化方法，把sfat-1基因生成的豐富的EPA轉(zhuǎn)化成DHA，將可能在陸生哺乳動(dòng)物如豬等體內(nèi)生成豐富的、具有更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的DHA。陸生哺乳動(dòng)物雖然不能自身合成《_3PUFAs，但是可以從植物中攝取18碳的a -亞麻酸微量地轉(zhuǎn)化為EPA和DHA(見(jiàn)圖I)，這個(gè)過(guò)程中包括碳鏈的延長(zhǎng)、去飽和、P -氧化三種步驟。其中碳鏈的延長(zhǎng)和去飽和為限速步驟。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，EPA向DHA轉(zhuǎn)化的兩個(gè)關(guān)鍵酶分別是負(fù)責(zé)脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)的延長(zhǎng)酶和負(fù)責(zé)脂肪酸去飽和的△ 6去飽和酶。在上述研究基礎(chǔ)的啟迪下，發(fā)明人發(fā)明了一種生產(chǎn)DHA的方法，將我們克隆的線蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去飽和酶基因sfat_l與哺乳動(dòng)物脂肪酸 延長(zhǎng)酶基因elovl2及脂肪酸去飽和酶基因A6desaturase三者共同轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物體內(nèi)，有可能在轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物自身體內(nèi)生成豐富的DHA。其中轉(zhuǎn)入的sfat-1基因負(fù)責(zé)生成豐富的EPA，而后兩者在強(qiáng)化表達(dá)的情況下，增強(qiáng)EPA向DHA轉(zhuǎn)化的效率，從而把前者生成的豐富的EPA轉(zhuǎn)化成豐富的DHA。從而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物體內(nèi)形成一條DHA生產(chǎn)的高效代謝鏈。本發(fā)明使用三種基因共同聯(lián)合作用，以花生四烯酸為出發(fā)原料，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)生成豐富的DHA。下面以中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞K1(CH0-K1細(xì)胞)為例，闡明本發(fā)明的技術(shù)方案。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。內(nèi)切酶、分子生物學(xué)方面的試劑購(gòu)于Promega公司；其他試劑購(gòu)自sigma公司；peasy-T 載體購(gòu)自 promega 公司。elovl2 基因、A 6desaturase 基因購(gòu)自 openbiosystems公司。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞Kl (CHO-Kl)細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、利用sfatl、elovl2、A 6desaturase三基因共同轉(zhuǎn)染在CH0-K1細(xì)胞中生成豐富DHA的方法。一、pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS- A 6desaturase-hygro> pCAGGS-elovl2_neo 三種高效表達(dá)載體的構(gòu)建。I、pCAGGS-sfatl-zeo 表達(dá)載體的構(gòu)建I)篩選標(biāo)記zeocin抗性基因的獲得質(zhì)粒pVgRXR(購(gòu)自invitrogen公司，該公司已公布了其序列)上面帶有zeocin抗性基因，我們?cè)趜eocin抗性基因cDNA上游設(shè)計(jì)上游引物P 1(P I :5’ CGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG3’ ；P I引物擴(kuò)增的下游序列中帶有ー個(gè)天然Stu I位點(diǎn))，在zeocin抗性基因cDNA下游設(shè)計(jì)下游引物P2 (P2 :5’GAaggcctTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACG 3’ ；帶有Stu I位點(diǎn))，利用上述引物，通過(guò)PCR從質(zhì)粒pVgRXR上擴(kuò)增獲得目的片段，PCR 條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；65°C 45sec ；72°C Imin ；30 循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存；PCR獲得的片段其大小為946bp，其核苷酸序列為序列表中的序列4，自序列表中序列4的5'端第486-563位核苷酸為Em7pix)m0ter ；自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸為zeocin抗性基因cDNA。然后將PCR獲得的片段克隆到peasy-T載體上，獲得帶有zeocin抗性基因cDNA的重組載體命名為peasy_T_zeo。2)pCAGGS_zeo載體的構(gòu)建使用stul酶切peasy-T-zeo,割下890bp (自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸)的帶有zeocin抗性基因的片段，然后克隆到表達(dá)載體pCAGGS (addgene公司購(gòu)買(mǎi),該公司已公布了其序列)的stul位點(diǎn)中。pCAGGS stul位點(diǎn)的上游有sv40啟動(dòng)子,下游有sv40polyA,可用于插入的zeocin抗性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。3) pCAGGS-sfatl-zeo的構(gòu)建sfatl基因(Sfatl序列是序列表中序列I所不的序列)由北京中美泰和公司全基因人工合成，合成的sfatl基因克隆在peasy-T載體上，合成的基因兩頭分別各設(shè)計(jì)了ー個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)。從中美泰和公司獲得的peasyT-sfatl載體上，使用EcoRI切出I. 2Kb的線蟲(chóng)的《_3脂肪酸去飽和酶基因sfat_l，使用EcoRI切開(kāi)上述的pCAGGS-zeo載體，將I. 2Kb的sfatl基因克隆進(jìn)pCAGGS-zeo載體，最終獲得pCAGGS-sfatl-zeo表達(dá)載體(載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示)。使用NcoI對(duì)最終 獲得的pCAGGS-sfatl-zeo表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，應(yīng)獲得2901bp，1805bp, 1578bp，600bp4個(gè)片段，酶切結(jié)果與設(shè)想的完全一致，具體的酶切鑒定圖如圖3所示，證明最終獲得的表達(dá)載體是正確的，序列測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。圖3中，泳道1-5為pCAGGS-sfatl-zeo的酶切結(jié)果，泳道MIV為分子量marker。2> pCAGGS-elovl2-neo 表達(dá)載體的構(gòu)建l)pCAGGS-neo 載體的構(gòu)建質(zhì)粒 peasyfiox(購(gòu)自 addgene 公司，addgene 公司已公布了其序列)上帶有完整的篩選標(biāo)記neomycin抗性基因表達(dá)框架，neomycin抗性基因表達(dá)框架在neomycin抗性基因的上游有pGK啟動(dòng)子，下游有bGH polyA。我們使用XhoI和BamHI雙酶切,切下2. IKb的neomycin抗性基因表達(dá)框架,該neomycin抗性基因表達(dá)框架的核苷酸序列為序列表中的序列5 (自序列表中序列5的5'端第7-566位核苷酸為pGK啟動(dòng)子，自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸為neomycin抗性基因，自序列表中序列5的5'端第1371-2107位核苷酸為bGH polyA序列)，末端平頭化后，連接到pCAGGS的stul位點(diǎn)中，可表達(dá)neomycin抗性基因的重組載體,命名為pCAGGS_neo載體。2) elovl2基因的克隆小鼠elovl2基因購(gòu)買(mǎi)自openbiosystems公司，其序列為序列表中序列2所示的序列，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)ー對(duì)引物P3和P4，P3 (5’CGgaattcATGGAGCAGCTGAAGGCCITTGA3’)帶有ー個(gè) EcoRI 位點(diǎn)，P4(5’GGggtaccTTAITGAGCCTTCTTGTCCGTC3’)帶有ー個(gè)KpnI位點(diǎn)，以購(gòu)買(mǎi)的小鼠elovl2基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件94°C 4min ；94°C 30sec ；62°C 45sec ；72°C Imin ;30 循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。擴(kuò)增出大小為 879bp 的elovl2基因，將該擴(kuò)增得到的基因克隆入peasy-T載體中，得到表達(dá)elovl2的重組載體，命名為 peasy_T_elovl2 載體。3)使用 EcoRI 和 KpnI 從 peasy_T_elovl2 載體中切下 879bp 的 elovl2 基因，克隆入pCAGGS-neo載體的EcoRI和KpnI位點(diǎn)中，最終得到pCAGGS-elovl2_neo表達(dá)載體(載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示)。使用EcoRI和KpnI對(duì)最終獲得的pCAGGS-elovl2_neo表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定，應(yīng)切出879bp和6717bp兩個(gè)片段，酶切結(jié)果與設(shè)想的完全一致，具體酶切結(jié)果如圖5所示，證明最終獲得的表達(dá)elovl2基因的pCAGGS-el0V12-ne0表達(dá)載體是正確的，序列測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。pCAGGS-el0V12-ne0中的elovl2序列為序列表中序列2所示的序列。圖5中，泳道MIV為分子量marker。3、pCAGGS- A 6desaturase-hygro 表達(dá)載體的構(gòu)建I)篩選標(biāo)記hygro抗性基因的獲得質(zhì)粒pcDNA3. 1/hygro (購(gòu)自invitrogen公司，該公司已公布了該載體的序列)上帶有hygro基因，我們?cè)趆ygro cDNA上游設(shè)計(jì)上游引物P5 (5，AGTTCCGCCCATTCTC3，)，引物P5下游有天然的stul酶切位點(diǎn)。在hygrocDNA 下游設(shè)計(jì)下游引物 P6 (5，GAaggcctCTAITCCTTTGCCCTCGG3’ ；帶有 Stu I 位點(diǎn))，以質(zhì)粒pcDNA3. 1/hygro為模板，利用P5和P6為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的片段hygro，其大小為1209bp，其核苷酸序列為序列表中序列6(自序列6的5'端第1-124位核苷酸為SV40promoter/ori,自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸為hygro抗性基因)PCR 條件為94で 4min ；94°C 30sec ；52°C 45sec ；72°C Imin ;30 循環(huán)；72で IOmin ;4で保存。將獲得的PCR產(chǎn)物克隆到peasy-T載體上，獲得序列中含有hygro序列的重組載體，命名為peasy-T-hygrOo2)pCAGGS-hygro載體的構(gòu)建利用引物兩頭自帶的stul位點(diǎn)，使用stul酶切peasy-T-hygro,割下1093bp(自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸)的含有hygro基因的片段,然后將hygro克隆到表達(dá)載體pCAGGS的stul位點(diǎn)中獲得重組表達(dá)載體。pCAGGS stul位點(diǎn)的上游有sv40啟動(dòng)子,下游有sv40polyA,可用于插入的hygro基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。將驗(yàn)證正確的可表達(dá)hygro基因的重組表達(dá)載體命名為pCAGGS-hygro。3) A 6desaturase 基因的克隆小鼠 A 6desaturase 基因(A 6desaturase 序列為序列表中序列3所示的序列)購(gòu)買(mǎi)自openbiosystems公司，設(shè)計(jì)ー對(duì)引物P7和P8,P7 (5’CGgaattcATGGGGAAGGGAGGTAACCAG 3，)帶有ー個(gè) EcoRI 位點(diǎn)，P8 (5，CCGgagctcTCAITTATGGAGGTAAGCATCCAG3’)帶有ー個(gè)SacI位點(diǎn)，以小鼠A 6desaturase基因?yàn)槟０澹訮7和P8為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；62°C 45sec ；72°C Imin ;30 循環(huán)；72V IOmin ;4°C保存。擴(kuò)增出大小為1335bp的A 6desaturase基因，克隆入peasy-T載體中，得到序列中含有小鼠A 6desaturase基因的重組表達(dá)載體，將驗(yàn)證正確的載體命名為peasy-T- A 6desaturase 載體。4)使用 EcoRI 和 SacI 從 peasy-T-A 6desaturase 載體中切下 I33Sbp 的A 6desaturase基因，克隆入pCAGGS-hygro載體的EcoRI和SacI位點(diǎn)中，最終得到pCAGGS-elovl2_neo表達(dá)載體(載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖6所示)。使用EcoR I、Nco I、Pvu I對(duì)最終獲得的pCAGGS-A6desaturase_hygro表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定,EcoR I應(yīng)切出2569bp,4659bp兩個(gè)片段；Nco I應(yīng)切出3518bp，320Ibp，509bp三個(gè)片段；Pvu I應(yīng)切出2261bp，4967bp兩個(gè)片段，酶切結(jié)果與設(shè)想的完全一致，具體結(jié)果如圖7所示，結(jié)果證明最終獲得的表達(dá)載體pCAGGS-A 6desaturase_hygro是正確的可表達(dá)A6desaturase的重組載體，序列測(cè)定結(jié)果也證實(shí)了表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。pCAGGS-A 6desaturase_hygro載體中的A6desaturase序列為序列表中序列3所示的序列。圖7中，泳道MII和MIV均為分子量markeroニ、共轉(zhuǎn)染表達(dá)sfatl、elovl2以及A 6desaturase的表達(dá)載體的陽(yáng)性CH0-K1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建
I、CH0-K1細(xì)胞的培養(yǎng)將CH0-K1細(xì)胞解凍，放入6孔板中培養(yǎng)。使用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基(添加終濃度為10% (體積百分含量)FBS(小牛血清，購(gòu)自hyclone公司，貨號(hào)SH30084. 03), I X L-glutamine (100 X L-谷氨酰胺，200mM,使用時(shí)稀釋100倍即為I XL-glutamine ；購(gòu)自 hyclone 公司，貨號(hào) SH30034. 01), I XNon-Essential AA(100X非必需氨基酸，使用時(shí)稀釋100倍即為I XNon-Essential AA ;購(gòu)自hyclone公司，貨號(hào) SH30238. 01 ；100X 非必需氨基酸的組分為L(zhǎng)-Alaninel500mg/L, L-Asparagine H2O890mg/L L-Aspartic acid 1330mg/L, L-Glutamic acidl470mg/L, Glycine 750mg/L,L-Proline 1150mg/L, L-Serine 1050mg/L)的 DMEM 培養(yǎng)基(購(gòu)自 hyclone 公司，貨號(hào)SH30022. OlB))，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)CHO-Kl細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)到約90%的匯合度時(shí)，用于下述轉(zhuǎn)染步驟。2、CHO-Kl細(xì)胞的轉(zhuǎn)染第一步先使用pCAGGS-sfat l-zeo表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在獲得sfatl基因穩(wěn)定整合的單細(xì)胞克隆的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行第二步的轉(zhuǎn)染，即使用后兩種表達(dá)載體pCAGGS-elovl2_neo表達(dá)載體和pCAGGS- A 6desaturase-hygro表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。具體轉(zhuǎn)染的方法如下所述轉(zhuǎn)染前使用QIAGEN的質(zhì)粒大提試劑盒提取上述三種表達(dá)載體，三種質(zhì)粒均使用AhdI酶切進(jìn)行線性化，按照每個(gè)6孔細(xì)胞使用4ug的DNA量進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),取5ul DNA混合液與IOul脂質(zhì)體Iipptectamine 2000混勻進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基，24小時(shí)后以I : 10(或更高的稀釋比)傳代，再24h后添加抗性素(G418、博萊霉素或潮霉素)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，使用的G418 (篩選轉(zhuǎn)染pCAGGS-sfatl-zeo的細(xì)胞)篩選濃度為800iig/ml，博萊霉素(篩選轉(zhuǎn)染pCAGGS-el0V12-ne0的細(xì)胞)濃度為600 ii g/ml,潮霉素(篩選轉(zhuǎn)染 pCAGGS-A 6desaturase_hygro 的細(xì)胞)濃度為 350 ii g/ml。在添加上述濃度的抗生素的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的抗性壓力下培養(yǎng)7-10d后進(jìn)行單克隆細(xì)胞的篩選，將細(xì)胞分散到96孔板中，每個(gè)孔只有一個(gè)細(xì)胞，期間一直用抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間為2個(gè)月，得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS_A6 desaturase-hygro和pCAGGS-elovl2-neo的陽(yáng)性CH0-K1轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞克隆。同時(shí)將pCAGGS-zeo、pCAGGS_neo和pCAGGS-hygro分別按照上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入CH0-K1細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)pCAGGS-zeo、pCAGGS-neo和pCAGGS-hygro三種空載體的單細(xì)胞克隆作為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照。3、陽(yáng)性CH0-K1單克隆細(xì)胞的鑒定使用RT-PCR的方法鑒定步驟2獲得的轉(zhuǎn)染了 pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS-A6desaturase_hygro 和 pCAGGS-elovl2_neo 的陽(yáng)性 CH0-K1 轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞克隆。設(shè)計(jì)引物 P9 (5，CTCTGACTGACCGCGTTACTCCCAC 3’ )，位于 pCAGGS 中的雞 a -actin 第一外顯子的上。引物 P10(5’ CCAGTCCCGGTAGTGATCAAGATC 3’)，位于 A 6desaturase 基因內(nèi)部；引物 Pll (5，CCTTCTTGTCCGTCATGCCATTAG 3’)，位于 elovl2 基因內(nèi)部；引物 P12(5’ GTTGGTGAAAGCGTGGTGAAGITTG3’)位于 sfatl 基因內(nèi)部。引物 P13 (5，CTGGCCAAGGTCATCCATGACAACC3’ )和 P14(5’ CTGTTGCTGTAGCCGTATTCATTGTC3 )位于內(nèi)源性參照基因 GAPDH 內(nèi)部。使用Trizol方法提取CH0-K1單克隆細(xì)胞中的總mRNA，使用oligo-dT反轉(zhuǎn)錄后，反應(yīng)條件為30°C IOmin ；42°C 60min ；1個(gè)循環(huán)；4°C保存。三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄分別進(jìn)行RT-PCR鑒定，其中P9和PlO用于A6desaturase基因轉(zhuǎn)錄的鑒定，PCR條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。陽(yáng)性細(xì)胞克隆應(yīng)該擴(kuò)增出IlOObp片段。P9和 Pll 用于 elovl2基因轉(zhuǎn)錄的鑒定，PCR條件為MV 4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。陽(yáng)性細(xì)胞克隆應(yīng)該擴(kuò)增出950bp片段。P9和P12用于 sfatl 基因轉(zhuǎn)錄的鑒定，PCR條件為94°C 4min ；94°C 30sec ；65°C 45sec ；72°C Imin ；30循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。陽(yáng)性細(xì)胞克隆應(yīng)該擴(kuò)增出571bp片段。P13和P14用于內(nèi)源性參照GAPDH基因轉(zhuǎn)錄的鑒定，PCR條件為94°C4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循環(huán)；72°C IOmin ；4°C soak。應(yīng)擴(kuò)增出500bp的片段，作為內(nèi)源性參照。以上述轉(zhuǎn)pCAGGS-zeo、pCAGGS-neo和pCAGGS-hygro三種空載體的單細(xì)胞克隆作為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照。結(jié)果如圖8所示，結(jié)果顯示我們獲得了 6株共轉(zhuǎn)染有三個(gè)基因的CHO-Kl單克隆細(xì)胞株，三個(gè)基因都穩(wěn)定整合在CHO-Kl細(xì)胞染色體上，且三個(gè)基因都能高效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。圖8中僅給出陽(yáng)性單克隆13號(hào)和28號(hào)為例。三、CHO-Kl細(xì)胞中的脂肪酸測(cè)定I. CHO-Kl轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的培養(yǎng) 挑選I株三基因共轉(zhuǎn)的CHO-Kl單克隆細(xì)胞(陽(yáng)性單克隆13號(hào))進(jìn)行脂肪酸的測(cè)定，以單轉(zhuǎn)有sfatl的CHO-Kl單克隆細(xì)胞株為對(duì)照。將所獲得的單克隆細(xì)胞按小于10%的比例傳代培養(yǎng)至150 X 150mm的大培養(yǎng)皿，每皿加入30mL無(wú)抗性動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基(添加終濃度為10% (體積百分含量)FBS (小牛血清，購(gòu)自hyclone公司，貨號(hào)SH30084. 03)，I XL-glutamine (L-谷氨酸胺，購(gòu)自 hyclone 公司，貨號(hào) SH30034. 01)，I XNon-EssentialAA (非必需氨基酸，購(gòu)自hyclone公司，貨號(hào)SH30238. 01)的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自hyclone公司，貨號(hào)SH30022. 01B))，以50umol/L的終濃度在培養(yǎng)基中加入花生四烯酸。加入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基和底物72h內(nèi)不做任何處理，靜態(tài)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。72h后收集細(xì)胞進(jìn)行脂肪酸的抽提。2. CH0-K1細(xì)胞脂肪酸抽提及甲酯化用胰酶消化，離心收集2個(gè)大培養(yǎng)皿中的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染)。加入氯仿和甲醇(氯仿和甲醇體積比為I : I) 4mL混勻，搖勻至細(xì)胞均勻散開(kāi)。加入3. 5mL蒸餾水搖勻，3500r/min，室溫離心5min，分層后吸取下層氯仿(含全部脂肪酸)。殘液中再次加氯仿3mL抽提，再次3500r/min，室溫離心5min后吸取下層氯仿層。將兩次收集的液體3500r/min，室溫(25°C )離心5min，吸取下層液體，用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞Ｏ蚱浼尤隝mL氯仿重溶后再次用氮?dú)獯蹈伞＜尤隝ml 2. 5%硫酸/甲醇溶液(在甲醇中加入2. 5ml的硫酸,用甲醇定容到IOOml))混勻，70°C加熱I小時(shí)，期間輕搖不要晃到管壁。冷卻到室溫，加入ImL去離子水和ImL正己烷，用カ振搖晃勻，2500r/min,室溫離心5min,小心吸取上清(正己燒層)。在殘液中加入ImL正己烷再次抽提，2500r/min,室溫離心5min，再次吸取上清(正己烷層)。將兩次的上清液混在一起用氮?dú)獯蹈傻玫街舅帷?.脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定將步驟2獲得的脂肪酸用ImL正己烷吹打沖洗后裝入I. 5mL離心管，吸取上清(0. 8mL)經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥糜贕C-MS分析，使用儀器為GC-TOF高分辨氣質(zhì)聯(lián)用儀。分析條件氣相色譜儀(GC) :HP6890 ;色譜柱DB-5，30mX0. 25mmX0. 25ii L ;恒流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積 Iu し進(jìn)樣ロ溫度 260°C ;升溫程序?yàn)?50°C— 160°C (30°C /min) — 240°C (8°C /min) 280°C (30°C /min)載氣He,流速lmL/min。外標(biāo)法校正儀器。EI+離子源，源溫180°C，質(zhì)譜轟擊電子能量為70eV，質(zhì)量掃描范圍20 800U.譜庫(kù)檢索=MassLynx和NIST。CH0-K1細(xì)胞脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)果顯示與只轉(zhuǎn)入表達(dá)sfatl的CH0-K1細(xì)胞對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)染并表達(dá)sfatl、elovl2、A6desaturase三種外源基因的CH0-K1細(xì)胞中生成了更為豐富的DHA，單轉(zhuǎn)染sfatl的CH0-K1細(xì)胞中DHA的含量占總脂肪酸的比例為1. 02%，而共轉(zhuǎn)染并表達(dá)三種外源基因的CHO-Kl細(xì)胞中DHA的含量占總脂肪酸的比例達(dá)到了 7. 31 %， 效果非常明顯，顯示動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中添加的花生四烯酸被更有效地轉(zhuǎn)化成DHA。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)DHA的試劑盒,包括線蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae) -3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因和哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述線蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去飽和酶基因?yàn)閟fatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I ;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因?yàn)樾∈笾舅嵫娱L(zhǎng)酶基因，優(yōu)選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?yàn)樾∈笾舅崛ワ柡兔富颍瑑?yōu)選為小鼠Aedesaturase基因，所述小鼠A6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括真核表達(dá)載體，所述真核表達(dá)載體為pCAGGS ;所述試劑盒還包括抗性篩選標(biāo)記基因；所述抗性篩選標(biāo)記基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，優(yōu)選為自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，優(yōu)選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優(yōu)選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。
4.一種制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的方法，是將線蟲(chóng)(Caenorhabditis briggssae) w-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?qū)腚x體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，篩選獲得穩(wěn)定整合及表達(dá)《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，即為DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述線蟲(chóng)(Caenorhabditisbriggssae)的《_3脂肪酸去飽和酶基因?yàn)閟fatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列為序列表中序列I;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因?yàn)槭笾舅嵫娱L(zhǎng)酶基因，優(yōu)選為小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列為序列表中序列2 ;所述哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?yàn)槭笾舅崛ワ柡兔富颍瑑?yōu)選為小鼠A6desaturase基因,所述小鼠A 6desaturase基因的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為鼠細(xì)胞，優(yōu)選為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞K1。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因和哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因先分別以真核表達(dá)載體為出發(fā)載體，分別構(gòu)建得到表達(dá)Co-3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因的重組表達(dá)載體和表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體，然后三個(gè)重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，篩選得到所述哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；所述真核表達(dá)載體為pCAGGS。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述重組表達(dá)載體是以真核表達(dá)載體為出發(fā)載體，將所述真核表達(dá)載體先插入抗性篩選標(biāo)記基因，構(gòu)建具有抗性篩選標(biāo)記的重組表達(dá)載體，然后插入所述《_3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因或哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因，獲得表達(dá)《_3脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因的重組表達(dá)載體或表達(dá)哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因的重組表達(dá)載體；所述抗性篩選標(biāo)記基因?yàn)閦eocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，優(yōu)選為自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，優(yōu)選序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，優(yōu)選自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。
8.權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述方法制備的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
9.一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)DHA的方法，包括下述步驟 1)按照權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的方法制備哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 2)以花生四烯酸為底物培養(yǎng)所述的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，獲得細(xì)胞內(nèi)DHA積累量提高的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系所用的培養(yǎng)基為添加花生四烯酸的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，所述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基為添加終濃度為10% (體積百分含量)小牛血清，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基；所述花生四烯酸在所述添加花生四烯酸的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為25-75umol/L，優(yōu)選50umol/L ;所述方法還包括提取培養(yǎng)后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的脂肪酸，獲得DHA含量提高的脂肪酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)DHA的方法。該方法下述步驟1)制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；2)以花生四烯酸為底物培養(yǎng)所述的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，獲得細(xì)胞內(nèi)DHA積累量提高的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。其中制備DHA生產(chǎn)能力提高的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的方法，是將ω-3脂肪酸去飽和酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸延長(zhǎng)酶基因、哺乳動(dòng)物脂肪酸去飽和酶基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞中，篩選獲得表達(dá)三種基因的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102660576SQ20121010702
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者吳曉潔, 周顏榮, 孫曉燕, 左珊珊, 林艷麗, 熊富銀, 陳紅星 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所