專利名稱：海洋微生物發酵生產低溫豆豉溶栓酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及ー種低溫豆豉溶栓酶海洋微生物發酵生產方法。該方法生產的海洋低溫豆豉溶栓酶在溶解血栓、激活體內纖溶酶原方面有獨特優勢，可以廣泛應用于溶栓藥物和溶栓保健品的生產。
背景技術：
豆豉溶栓酶(Nattokinase，簡稱NK)是ー種堿性絲氨酸蛋白酶，無毒性，可ロ服(李江偉等，中國藥學雜志，1999)，易被人體吸收，能直接溶解纖維蛋白，具有強烈溶栓功能(郝征紅等，農業工程學報，2008 ;彭勇等，高技木通訊，2002)，且溶栓作用時間長，作為新一代理想的預防和治療血栓的生化藥物，具有廣闊的應用前景(陶琳，氨基酸和生物資源，2004)。早期臨床上應用最多的溶栓劑是鏈激酶、尿激酶等，雖可以促進血液中血纖維蛋白溶酶的形成或可以直接對血栓進行溶解，但都存在不同程度的不足，如半衰期短、抗原性強、副作用較大等，很難成為ー種大眾藥品(盧露，中國調味品，2011)。溶栓研究中期階段，鑒于NK獨特的優勢，對其研究開始起步并日漸增多，主要集中普通微生物發酵生產中溫型NK，處于菌株選育、發酵條件優化、酶學性質，酶分離純化以及工程菌構建等(陶琳，氨基酸和生物資源，2004 ;豆孝偉，現代食品科技，2006)，普通微生物發酵生產NK已然成為研究的熱點。而海洋微生物發酵生產低溫NK的研究尚在起步階段，產業化、規?；Ｑ笪⑸锇l酵生產NK還未見報道。鑒于早期溶栓劑的不足，普通微生物大規模發酵的可行性，利用海洋微生物發酵生產低溫NK具有先進性。海洋微生物發酵生產的NK與普通微生物發酵生產的中溫NK具有很大的應用優勢。普通微生物發酵生產的NK最適作用溫度一般為45 550C，而人體的生理溫度一般為36. 5 37°C，致使普通微生物發酵生產的NK不能充分發揮作用，出現治療效果差或沒有效果。海洋微生物(低溫、寡營養、低光照、高壓)發酵生產的NK最適作用溫度一般為35 40°C，比較接近人體的生理溫度，應用于治療效果比較明顯。海洋NK在生理溫度下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短溶栓過程的時間，這將有助于NK在臨床醫學上的應用和推廣，從根本上彌補早期臨床溶栓藥物的不足。鑒于海洋微生物發酵生產的NK上述的優勢，海洋NK作為臨床新型溶栓藥物具有廣闊的應用前景和開發潛力。

發明內容
本發明的目的是提供ー種海洋微生物發酵生產低溫NK的方法。該方法主要是海洋微生物經過定向馴化后，在常規條件下液體發酵生產低溫NK的方法，這種生產方法獲得的低溫NK活性可以達到120U/ml，如再經過系列分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。ロ服2000U 4000U每日用量應用于小鼠實驗，22 37天表現出明顯的溶栓效果。該酶制劑應用方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊馄渌芩▌玫谋锥?。本發明所述的ー種海洋微生物發酵生產低溫NK的方法具體包括以下步驟(I)將產生低溫NK的海洋微生物進行定向馴化，使其在培養條件下生長良好；
(2)按常規方法將低溫NK產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體ー級種子和ニ級種子；(3)將液體一級種子或ニ級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養60 96h吋，即海洋微生物發酵生產低溫NK結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。NK產生菌(例如，CGMCC菌種編號I. 47或I. 3)先活化、定向馴化后，按本發明產酶條件發酵生產低溫NK。馴化后的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在_80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. Og7NaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種定向馴化培養基蛋白胨3. O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纖維蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，瓊脂18 22g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，12TC高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基胰蛋白胨8. O 12. 0g，酵母粉4. O 6. 0g，NaCl 8. O 10. Og,自來水I. 0L, pH自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖13. O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2
I.7g, CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3
0.7g, NaCl 8.0 12. 0g，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生NK的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種進行定向馴化，使其在培養條件下生長良好；(4)按常規方法將定向馴化后的低溫NK產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發酵液體積3 5%的接種量接入10L的產酶培養基中，在10 12°C培養84 96h吋，即海洋微生物發酵生產低溫NK結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫NK制劑。實施例ニ
(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. Og7NaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
I.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種定向馴化培養基蛋白胨3. O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纖維蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，瓊脂18 22g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，12TC高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基胰蛋白胨8. O 12. 0g，酵母粉4. O 6. 0g，NaCl 8. O 10. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。④發酵產酶培養基葡萄糖13. O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2 I. 7g, CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3
0.7g, NaCl 8.0 12. 0g，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生低溫NK的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種進行定向馴化，使其在培養條件下生長良好；(4)按常規方法將定向馴化后的低溫NK產生菌在在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和ニ級種子；(5)將(4)制備的ニ級種子按發酵液體積5 7%的接種量接入50L的產酶培養基中，在12 14°C培養72 84h吋，即海洋微生物發酵生產低溫NK結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫NK制劑。實施例三(I)培養基制備①菌種活化培養基蛋白胨15. 0g，牛肉膏10. Og7NaCl 10. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0,121°C高壓蒸汽滅菌 30min。②菌種定向馴化培養基蛋白胨3. O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纖維蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，瓊脂18 22g，蒸餾水I. 0L, pH值自然，12TC高壓蒸汽滅菌30mino③液體種子培養基胰蛋白胨8. O 12. 0g，酵母粉4. O 6. 0g，NaCl 8. O 10. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
④發酵產酶培養基葡萄糖13. O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2 I. 7g, CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3
0.7g, NaCl 8.0 12. 0g，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生NK的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將⑵活化好的菌種進行定向馴化，使其在培養條件下生長良好；(4)按常規方法將產物定向馴化后的低溫NK產生菌在10 16°C培養24 36h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和ニ級種子；
(5)將(4)制備的ニ級種子按發酵液體積7 9%的接種量接入200L的產酶培養基中，在14 16°C培養60 72h時，即海洋微生物發酵生產低溫NK結束。(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶
液。 (7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫NK制劑。
權利要求
1.ー種海洋微生物發酵生產低溫豆豉溶栓酶(NK)的方法，其包括以下步驟 (1)將產生低溫NK的海洋微生物進行定向馴化，使其在培養條件下生長良好； (2)按常規方法將低溫NK產生菌在10 16°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和ニ級種子； (3)將液體一級種子或ニ級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基中，在10 16°C培養60 96h時，即海洋微生物發酵生產低溫NK結束； (4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液； (5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(5)之后進ー步包括將步驟(5)得到的粗酶液進ー步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種定向馴化培養基、液體種子培養基、發酵產酶培養基分別為 (1)菌種定向馴化培養基蛋白胨3.O 7. 0g，牛肉膏3. O 7. 0g，纖維蛋白10. O 20. 0g, NaCl 5.0 15. 0g，瓊脂18 22g，蒸餾水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30mino (2)液體種子培養基胰蛋白胨8.O 12. 0g，酵母粉4. O 6. Og7NaCl 8. O 10. Og,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基葡萄糖13.O 17. 0g，蛋白胨13. O 17. Og,酵母粉I. 2 I. 7g，CaCl2 ·2Η20 O. I 0. 3g, K2HPO4 2· O 3. 0g，MgSO4 ·5Η20 0· 3 0. 7g, KH2PO4 O. 3 O. 7g,NaCl 8.0 12. Og,自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種海洋微生物發酵生產低溫豆豉溶栓酶的方法是將產生低溫豆豉溶栓酶的海洋微生物進行定向馴化，使其在培養條件下生長良好；將定向馴化的豆豉溶栓酶產生菌在10～16℃培養24～36h而后按5～8％的接種量進行逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在10～16℃培養60～96h時，即海洋微生物發酵生產低溫豆豉溶栓酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/50GK102653751SQ20121010888
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月13日 優先權日2012年4月13日
發明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 王貴鵬, 竇少華, 遲乃玉 申請人:大連大學