專利名稱：檢測禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，特別涉及一種檢測禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒以及利用所述試劑盒檢測禽白血病病毒群特異性抗原的方法。屬于生物技術領域。
背景技術：
禽白血病病毒(ALV)屬反轉錄病毒科，禽C性反轉錄病毒屬，可引起禽類多種腫瘤性疾病。本病在世界各地均有發生，感染率高，發病率低，是危害養禽業的主要疾病之一。禽白血病主要危害有兩個方面，一是產生腫瘤，導致雞的死亡；二是引起母雞產蛋率下降、蛋重減輕等生產指標的改變；而且，還可以引起雞的免疫抑制，繼發其他細菌和病毒的感染，造成嚴重的經濟損失。近些年來，在國內許多省份，ALV-J主要感染15到29周齡蛋雞，弓丨起產蛋量顯著下降，趾骨周圍皮膚和羽毛處淋巴結出血。1997年和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內爆發，給養禽業造成了巨大的經濟損失。目前，該病尚無徹底可行的防治措施。迄今為止尚無有效地疫苗可用。預防本病的主要方法是培育具有遺傳性抵抗力的新品種，淘汰陽性雞，凈化種群，經過幾代選育出無白血病的雞群。自1868年，Roloff報道禽白血病以來，研究工作者就對其進行長期的研究，并在病毒的分離、鑒定、檢測和診斷方面取得了相當大的成就。建立了很多禽白血病的檢測方法，如病毒中和試驗、瓊脂擴散實驗、補體結合試驗、ELISA、放射免疫、免疫熒光技術等。國外很早就建立了檢測該病的ELISA診斷試劑盒，但國內目前為止還沒有令人滿意的商品化禽白血病診斷試劑。禽白血病病毒的主要蛋白質組分有gag基因編碼的核心蛋白，pol基因編碼的3種酶，env基因編碼的兩種糖蛋白。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特異性抗原，是一種高度保守的非糖基化蛋白，有許多病毒抗原位點，是制備檢測抗體的首選抗原。本發明利用本實驗室制備的針對p27的單克隆抗體和多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA方法，為ALV的檢測和流行病學調查以及ALV的早期診斷提供依據。

發明內容
本發明的目的之一在于建立一種檢測禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其操作簡單，特異性好，敏感性高，具有良好的可靠性；本發明的目的之二在于提供了一種使用以上所述的試劑盒進行禽白血病病毒群特異性抗原檢測的方法；本發明的目的之三在于提供用于建立以上所述試劑盒的單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株；本發明的目的之四在于提供所述的雜交瘤細胞株在制備檢測或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途；及所述的單克隆抗體在制備檢測或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段本發明發明人從黑龍江省某雞場送檢的海蘭褐蛋雞病料中分離鑒定出I株J亞群禽白血病病毒(ALV-J)，命名為HLJ09MDJ-I。為了解其分子特征，對其進行了全基因組測序，并與其他毒株進行了比較。結果表明，HLJ09MDJ-1分離株的gag和pol基因非常保守，與各參考毒株的同源性為97. 5% 99. 0% ；env基因的同源性為88. 4% 97. 5%。與參考毒株相比，HLJ09MDJ-1分離株與HPRS-103株的親緣關系較近。該毒株HLJ09MDJ-1及全序列分析已分別記載在2010年11期的《動物醫學進展》題目為“蛋雞J亞群禽白血病病毒HLJ09MDJ-I株的分離鑒定”和2010年第8卷的《Virologyjournal〉〉，題目為“Novel sequences of subgroup J avian leukosis viruses associatedwith hemangioma in Chinese layer hens”的文中，公眾可通過中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室禽傳染病研究室獲取得到。兩篇文章以全文引用的方式并入本發明的說明書中。本發明從ALV-J (HLJ09MDJ-1)病毒株感染的DF-1細胞的凍融裂解液中提取DNA，通過PCR方法擴增出禽白血病群特異性抗原p27基因，將其克隆至pMD18-T載體，酶切鑒定后進行序列測定和分析。最后將P27基因亞克隆到載體pET-30a(+)，轉化受體菌BL21，IPTG誘導表達，經SDS-PAGE檢測獲得融合蛋白。經過Western-blot檢測,證明表達的蛋白具有良好的反應原性。將純化的P27蛋白作為抗原，免疫7周齡BALB/c小鼠，利用淋巴細胞雜交瘤技術，最終制備了 5株能夠分泌抗p27蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。其分泌的單克隆抗體效價高達IO7以上，且分泌抗體穩定、特異性高。ALV-J，ALV-A, ALV-B是常見的外源性禽白血病病毒，5株雜交瘤細胞株能夠與ALV-J，ALV-A，ALV-B發生特異性反應，能夠觀察到明顯的熒光，且與DF-I細胞不反應。本發明從五株雜交瘤細胞株挑選出了一株特異性好且效價較高的分泌抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株2E5，分類命名為雜交瘤細胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其微生物保藏號為CGMCCNo. 5961，保藏時間為2012年3月29日。進一步的本發明還提供了由所述的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體。再進一步的，本發明又提供了所述的雜交瘤細胞株在制備檢測或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。及所述的單克隆抗體在制備檢測或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。本發明利用得到的單克隆抗體建立了一種檢測禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于包括包被抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體的酶標板；所述的單克隆抗體由雜交瘤細胞株分泌產生，所述的雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5961。在本發明中，優選的，所述的單克隆抗體的包被量為2 ii g/ML。本發明的試劑盒進一步的還可包括抗禽白血病病毒p27蛋白的多抗、酶標抗兔二抗、封閉液以及稀釋液等，所述的封閉液優選為含有50g/L的脫脂奶粉的IOmM pH7. 2的磷酸緩沖液；所述的稀釋液優選為IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液。所述的試劑盒能夠用于制備檢測禽白血病群特異性抗原的試劑。在本發明的ー個具體實施例中，優選的，所述的試劑盒包括酶標板由保藏編號為CGMCC No. 5961的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體2E5包被，包被量為Zyg/ML; 多克隆抗體抗p27蛋白的多克隆抗體，濃度為4 μ g/ML ；酶標ニ抗HPR標記的羊抗兔IgG(sigma公司)；封閉液含有50g/L的脫脂奶粉的IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液；稀釋液10mM pH 7. 2的磷酸緩沖液；洗滌液含O. 5%吐溫20的IOmM pH 7. 2的PBS緩沖液；陰性對照未接毒生物DF-I細胞培養液；陽性對照ALV-J(HLJ09MDJ-1)的DF-1細胞培養液；顯色液TMB顯色液(TianGen)；終止液2mol/L硫酸溶液。其他的任何可獲得的禽白血病病毒(ALV)都可作為本發明試劑盒中的陽性對照，而達到相同的技術效果。本發明還提供了利用所述的試劑盒檢測禽白血病病毒群特異性抗原的方法，其特征在于按照雙抗體夾心ELISA檢測方法進行檢測，具體的包括以下步驟(I)包被抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體的酶標板4°C過夜后用含O. 5%吐溫20的磷酸緩沖液洗滌，37°C封閉液封閉4h，洗板；(2)加入待檢樣品，室溫孵育，洗板；(3)加入純化的多抗，室溫孵育，洗板；(4)加入酶標抗兔ニ抗，室溫孵育，洗板；(5)加入TMB顯色液，室溫顯色，最后加2mol/L硫酸終止反應，測定OD45tlnm值。為了確定出最佳反應條件，本發明在不同反應條件下，對單抗2E5包被量(8yg/ml>4 μ g/ml>2 μ g/ml、l μ g/ml)，多抗工作濃度(8 μ g/ml>4 μ g/ml>2 μ g/ml、l μ g/ml) ,HRP標記的抗兔ニ抗稀釋度(I 8000,1 5000,1 3000)，病毒、單抗、酶標ニ抗(O. 5h、lh、I. 5h)及TMB工作最佳作用時間(10min、15min、20min)，封閉液的種類(10g/L BSA、50g/L脫脂奶粉、10g/L魚明膠)進行ELISA實驗，檢測同一陽性和陰性樣品。選擇OD45tol值接近于I. O, P/N值最大的條件為最佳條件。經試驗確定DAS-ELISA單抗2E5最佳包被量為2 μ g/ML，多抗最佳濃度為4 μ g/ML，酶標ニ抗最佳稀釋度為I : 3000(以上四要素通過方陣法確定)，病毒抗原、多抗、酶標ニ抗及TMB最佳作用時間分別為lh, lh, Ih和20min。封閉液選擇含有50g/L脫脂奶粉的IOmM pH 7. 2磷酸緩沖液。本實驗中建立的DAS-ELISA是以抗p27蛋白的単體和多抗分別作為捕獲抗體和檢測抗體，而不是ALV其他蛋白的單抗和多杭，是因為p27是主要的群特異性抗原，在不同ALV亞群中高度保守，且有許多病毒抗原位點，是制備檢測抗體的首選抗原。本實驗建立的DAS-ELISA具有良好的敏感性和特異性，能夠檢測到I. 25ng/mlp27蛋白，且與常見的禽類病毒不反應(IBV，MDV，AIV等)。ALV-J，ALV-A，ALV-B是常見的外源性禽白血病病毒，DAS-ELISA與ALV-J、ALV-A和ALV-B反應特異，為禽白血病的診斷、防控和凈化奠定了基礎。在人工感染試驗中，PCR最早檢出陽性為感染ALV后第11天(lid. p. i.)，DAS-ELISA最早檢出陽性是在12d.p. i.。DAS-ELISA檢測到ALV比PCR方法晚一天，敏感性良好，且與PCR的符合率很高。PCR方法檢測ALV早有文獻報道，但是DAS-ELISA與PCR相t匕，具有方便、省時和批量檢測的優點。DAS-ELSIA在攻毒后12天后就能檢測到ALV’為ALV的檢測和及時淘汰陽性雞群奠定了基礎。利用DAS-ELSIA檢測了 491份蛋清樣品和190份肛拭子樣品，與PCR方法符合率分別為96. 5%和88. 9%。總之，ALV DAS-ELISA檢測方法的建立，為ALV的檢測和防控奠定了基礎。


圖I為p27基因的PCR擴增及重組表達載體pET_30a-p27的酶切鑒定；圖A為p27基因的PCR擴增(M DNA Marker DL2000 ；1 :p27基因PCR產物；2 :陰性對照)；圖8為重組表 達載體 pET-30a-p27 的酶切鑒定(I pET-30a-p27BamH I/Sal I ；M1 DNA Marker DL2000 ；M2 DNA Marker DL 15000)圖2A為誘導表達p27蛋白的SDS-PAGE分析；圖2B為p27蛋白的Western blot分析；al.低分子量標準蛋白Marker ；a2. a3. a4誘導后表達產物；a5.誘導前表達產物；a6.純化后的p27蛋白；bl.純化的p27蛋白；b2.低分子量標準蛋白Marker圖3為單抗的特異性鑒定；圖4為單抗間接熒光免疫反應(IFA)分析結果；圖5為多克隆抗體間接免疫滅光結果；A =ALV-A間接免疫熒光結果；B =ALV-B間接免疫熒光結果；C =ALV-J間接免疫熒光結果；D :陰性對照；圖6為單抗2E5和多抗的間接免疫熒光鑒定；圖7為DAS-ELSIA的敏感性分析；圖8為DAS-ELSIA的特異性性分析。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例I抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體及分泌該抗體雜交瘤細胞株的制備I、材料和方法I. I病毒、實驗動物、細胞和血清ALV毒株ALV-J(HLJ09MDJ-1)、ALV-A和ALV-B由哈爾濱獸醫研究所分離鑒定，提供；IBV, MDV，AIV H5, AIV H7, AIV H9, I LTV, FPV, IBDV, NDV, ARV 和 REV 由哈爾濱獸醫研究所提供；3周齡BALB/c小鼠，2月齡新西蘭家兔和SPF雞由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心提供；DF-1、S/P20細胞由本實驗室保存；兔抗天然p27蛋白陽性血清由本實驗室制備。I. 2載體、細菌克隆載體PMD-18T、原核表達載體pET_30a、大腸桿菌DH5a和BL21菌種由本實驗
室保存。I. 3 試劑 DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒購自AXYGEN公司；T4DNA連接酶、IPTG、PMD18-T載體等購自大連寶生物工程(Takara)有限公司；原核表達載體pET_30a購買自Novagen公司；HPR標記的羊抗鼠IgG、抗鼠突光二抗購自Sigma公司，免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；1640培養基、HAT、HT購自GibcoBRL，蛋白純化用填充材料購自GE healthcare。I. 4引物的設計與合成根據HLJ09MDJ-1毒株的序列(潘偉，高玉龍，秦立廷，等.蛋雞J亞群禽白血病病毒株HLJ09MDJ-1的分離鑒定及全基因組序列分析，中國畜牧獸醫學會畜牧獸醫生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫免疫分會第八次學術研討會論文集[C]. 2010.)，用軟件，premier 5. 0設計一對引物pi、p2用于擴增p27基因，是含有BamH I和SalI酶切位點的一對特異性引物，上游引物Pl 5，CGGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGAC 3’，含有BamH I酶切位點。下游引物 P2 :5’ ACGTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGACG 3’，含有 Sal I 酶切位點。I. 5DNA提取和p27基因的擴增將毒株HLJ09MDJ-1接種到對數期生長DF-I細胞的6孔板上，7天后收集細胞培養板并凍融DF-I細胞3次。用DNA提取試劑盒從DF-I細胞凍融液中提取DNA (操作按說明書進行)。以提取的DNA為模板進行PCR，反應條件為94°C 5min，94°C 30s, 56°C 30s，72°C lmin，擴增35次，最后72°C延伸lOmin。擴增產物于I %瓊脂糖凝膠電泳分析。擴增產物進行測序，測序結果如SEQ ID No. 2所示。其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。I. 6重組表達載體pET-30a_p27的構建及鑒定利用AXYGEN凝膠回收試劑盒回收PCR產物，連接于pMD_18T載體后轉化，提取質粒，用BamH I和SalI雙酶切鑒定，鑒定為陽性的重組質粒的命名為pMD_P27并送生物公司測序。利用BamH I和SalI雙酶切質粒pMD_p27和pET_30a，分別回收720bp和4900bp片段，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化BL21感受態細菌，小量提取質粒，BamH I和SalI雙酶切鑒定出陽性質粒，命名為pET-30a-p27。I. 7p27基因在原核表達系統中的表達、純化及活性檢測挑取單個含有口￡1'-30&- 27的乩-21細菌菌落加入1(&11(1001^/1111)的LB中，37°C過夜振搖培養，次日擴大培養至0D_約為0. 8，加入IPTG至終濃度0. ImM,于37°C誘導6h，收獲細菌。離心后，將菌體用PBS重懸(50iiL PBS/mL LB)，于4°C過夜后，超聲波溫和裂解菌體，離心取上清，12% SDS-PAGE電泳分析。而后轉印到NC膜上，封閉后，酶標兔抗p27抗體3000倍稀釋孵育，加底物顯色。由于p27蛋白與His Tag是以融合蛋白的形式表達，因此可以用Ni填料對其進行非變性純化,具體方法參照按照GE healthcare公司His Trap HP使用說明書進行。將純化的His-p27融合蛋白和重組蛋白用兔抗自然P27蛋白陽性血清進行Western blot分析。I. 8免疫動物
把純化的p27蛋白(2mg/ml)加等量的弗氏完全佐劑，皮下注射7周齡BLAB/c小鼠，每只0.05ml ;21d后用含等量弗氏不完全佐劑的p27蛋白腹腔注射二次免疫，O. Iml/只，21天后僅用p27蛋白腹腔兼尾靜脈注射O. 05mL/只加強免疫，3d后取脾用于融合。I. 9陽性雜交瘤細胞株的建立取上述免疫鼠的脾制成細胞懸液與處于對數生長期的S/P20細胞以8 I的比例進行融合。待融合細胞長至孔底1/2或1/3時，通過間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細胞株，再利用有限稀釋法連續克隆2 3次。至陽性率為100%后進行擴大培養，凍存于液氮中。I. 10抗p27蛋白的單克隆 抗體的制備將篩選得到的雜交瘤細胞進行擴大培養后，以5X 106/0. 5ml雜交瘤細胞腹腔注射BLAB/C小鼠1ml，14d后待小鼠腹圍增大后用注射器收集腹水，1000r/min離心lOmin，上清以O. 45 μ m濾器過濾后即為腹水MAb粗制品。I. 11單抗的效價測定及亞類的測定將純化的p27蛋白作I : 1000稀釋包被酶聯反應板，用間接ELISA法測定腹水中MAb效價，以P/N > 2. 5的最大稀釋度作為抗體的效價。用免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒檢測五株p27單抗的亞類。操作步驟按照試劑盒說明書進行。I. 12單抗的特異性鑒定I. 12. I五株單抗與禽類常見病毒的交叉反應將ALV-J, ALV-A, ALV-B, IBV，MDV，AIV H5,AIV H7,AIV H9, ILTV, FPV，IBDV,NDV，ARV和REV等14種病毒根據蛋白含量的不同，全部稀釋至約15 μ g/mL包被酶聯反應板，間接法ELISA檢測與單抗反應，DF-I細胞凍融離心后上清作為陰性對照，PBS作為空白對照。OD45tl >0.2判定為陽性。I. 12. 2五株單抗與ALV-J、ALV-A, ALV-B間接熒光免疫反應將ALV-J(HLJ09MDJ-1) ,ALV-A和ALV-B禽白血病病毒接種于含DF-1細胞的24孔細胞板，將不接種病毒的DF-I作為陰性對照。5d后將培養液棄掉，用無水こ醇固定15min，將單抗2E5、3H8、4B7、6D9和10G2做I : 200稀釋，加入細胞板孔內，室溫孵育lh。PBST洗4次，抗鼠熒光二抗做I : 200稀釋加入細胞板孔內，避光室溫孵育lh，用PBST洗板4次，加入PBS，熒光顯微鏡觀察結果。2 結果2. I重組質粒pET-30a_p27的鑒定提取DNA，經PCR擴增，O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增所得片段大小約720bp，與預期大小相符(見圖1A)，將重組質粒pET-30a-p27用BamH I和Sal I雙酶切鑒定，與預期的結果相符(見圖1B)。擴增所得到p27基因全長717bp，編碼239個氨基酸殘基。2. 2p27基因的表達、重組蛋白純化及蛋白活性檢測將表達蛋白在非變性條件下純化獲得HIS-p27融合蛋白，獲得分子量約為34kD的重組P27蛋白(圖2A)，重組p27蛋白經SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用兔抗天然p27蛋白陽性血清進行Western blot分析,結果所表達的蛋白具有生物反應活性(圖2B)。2. 3細胞融合率陽性雜交瘤細胞株的建立細胞融合率為89. 4%，最終篩選出5株持續分泌抗ALV p27蛋白的MAb雜交瘤細胞株，編號分別是2E5、3H8、4B7、6D9和10G2。本發明從五株雜交瘤細胞株挑選出了一株特異性好且效價較高的分泌抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，其微生物保藏號為=CGMCC No. 5961，保藏時間為2012年3月29日。2. 4單抗效價測定及亞類的測定用已建立的ELISA方法對五株單抗做效價測定的結果為2E5:27 ;3H8:21° ;4B7:29 ;6D9:27和10G2:28。免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒測定五株單抗的結果為2E5為IgG2b ;3H8、4B7、6D9 和 10G2 全部是 IgGl。2. 5單抗特異性鑒定IBV，MDV，AIV H5, AIV H7, AIV H9, I LTV, FPV，IBDV, NDV，ARV 和 REV 與五株單抗反應的OD值均小于O. 15，且ALV-J，ALV-A, ALV-B與五株單抗反應的OD值均大于I. 2。表明五株單抗有良好的特異性(圖3)。分析熒光顯微鏡觀察單抗2E5、3H8、4B7、6D9和10G2分別與ALV-J (HLJ09MDJ-1) ,ALV-A和ALV-B呈陽性反應，有明顯的綠色熒光，且陰性對照無綠色熒光(圖4)。實施例2抗p27蛋白的多克隆抗體的制備I、多克隆抗體的制備選4只約2kg的健康雌性新西蘭大白兔，用PBS稀釋純化后的重組p27蛋白(按照實施例I所述的方法制備得到)，加入等體積CFA充分乳化后，按每只兔O. 5mg重組蛋白劑量皮下多點接種；以后每隔2周用等量IFA乳化，加強免疫2次，三免后7天耳緣靜脈采血O. 5ml，分離血清。2、間接免疫熒光試驗檢測多抗免疫原性將DF-I細胞鋪于24孔板，每孔加入lOOulALV-A，ALV-B, ALV-J病毒，并設正常細胞為陰性對照，37°C溫箱繼續培養5d后，棄上清液，用無水乙醇固定細胞，三免后收集的血清用3% BSA做200倍稀釋作為一抗，室溫孵育Ih，PBST洗3遍，熒光二抗用3% BSA做200倍稀釋，避光反應lh，PBST洗3遍，靜置5min。每孔加入少量PBS，熒光顯微鏡觀察結果。3、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測多抗效價將純化的ALVp27抗原蛋白以4ug/ml濃度包被聚苯乙烯板，4°C過夜，然后每孔加入洗滌液(含 O. 05% Tween-20,0. 01mol/L pH 7. 4PBS,PBST)洗滌 3 次。加入封閉液(5%脫脂奶粉)，37°C孵育2h，甩干，洗板。加入倍比稀釋的三免后兔血清，對照組加入正常大白兔血清作為陰性對照，兔抗自然P27蛋白陽性血清作為陽性對照，37°C孵育lh，洗滌同前。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，37°C孵育lh，洗板同上。加底物液TMB顯色。加入終止液(2mol/L硫酸)。于Bio-Rad酶標儀450nm下測定光密度值(OD)。4、結果4. I間接免疫熒光實驗通過間接免疫熒光實驗，獲得的兔多抗能很好地與不同亞群的ALV病毒反應產生 熒光，而陰性對照沒有熒光(見圖5)。2. 4酶聯免疫吸附試驗檢測多抗效價結果將獲得的抗原按4ug/ml稀釋進行包被。進行ELISA檢測后，結果見表1，在血清1 1000稀釋所得到的值約為I. 500，與陰性對照組相比較差異極顯著，且P/N值遠遠大于2，因此可以鑒定為陽性，同時可以判斷血清具有很高的抗體效價(見表I)。表I多克隆抗體ELISA檢測結果
權利要求
1.檢測禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于包括包被抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的酶標板； 所述的單克隆抗體由雜交瘤細胞株分泌產生，所述的雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5961。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的單克隆抗體的包被量為2μ g/ML。
3.如權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于還包括抗禽白血病病毒p27蛋白的多杭、酶標抗兔ニ抗、封閉液以及稀釋液，所述的封閉液優選為含有50g/L的脫脂奶粉的IOmMPH 7. 2的磷酸緩沖液；所述的稀釋液優選為IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液。
4.權利要求1-3任一項所述的試劑盒在制備檢測禽白血病群特異性抗原試劑中的應用。
5.利用權利要求1-3所述的試劑盒檢測禽白血病病毒群特異性抗原的方法，其特征在于按照雙抗體夾心ELISA檢測方法進行檢測，具體的包括以下步驟 (1)包被抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的酶標板4°C過夜后用含O.5%吐溫20的磷酸緩沖液洗滌，37°C封閉液封閉4h，洗板； (2)加入待檢樣品，室溫孵育，洗板； (3)加入純化的多抗，室溫孵育，洗板； (4)加入酶標抗兔ニ抗,室溫孵育,洗板； (5)加入TMB顯色液，室溫顯色，最后加2mol/L硫酸終止反應，測定0D450nm值。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述的單克隆抗體的包被量為2μ g/ML,待檢樣品原倍，多抗的濃度為4 μ g/ML，酶標抗兔ニ抗的稀釋度為I : 3000，待檢樣品、多抗、酶標抗兔ニ抗及TMB的作用時間分別為lh，lh, Ih和20min，封閉液為含有50g/L的脫脂奶粉的IOmM pH 7. 2的磷酸緩沖液。
7.ー種分泌權利要求I所述的抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株2E5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號為CGMCC No. 5961。
8.由權利要求7所述的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體。
9.權利要求7所述的雜交瘤細胞株在制備檢測或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。
10.權利要求8所述的單克隆抗體在制備檢測或診斷禽白血病病毒感染試劑中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種檢測禽白血病群特異性抗原的雙抗體夾心ELISA試劑盒。所述試劑盒中包括由保藏編號為CGMCC No.5961的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體包被的酶標板。本發明還公開了利用所述單克隆抗體建立的一種快速有效的檢測ALV的雙抗體夾心ELISA方法，其以原核表達的HLJ09MDJ-1p27蛋白制備的單克隆抗體作為包被抗體，p27蛋白制備的多抗作為檢測抗體。該方法對p27的最小檢出量為1.25ng/ml，且與禽類常見的病毒不反應，特異性好。利用該方法檢測蛋清和肛拭子樣品，與PCR方法符合率分別為96.5％和88.9％。結果表明，該方法具有方便、快速、特異、敏感等優點，可用于ALV的檢測與種群凈化。
文檔編號C12N5/20GK102636644SQ20121011367
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者王永強, 王笑梅, 祁小樂, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龍 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所