專利名稱：一種功能性結核分枝桿菌抗原多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種功能性結核分枝桿菌抗原多肽及其應用。
背景技術：
據WHO統計，世界上近1/3的人口感染有結核分枝桿菌(M. tb)，且隨著耐藥結核病和結核病與艾滋病混合感染患者的增多，結核病已經嚴重危害人民健康，據統計近幾年在我國傳染病發病數和死亡數中肺結核的排名一直位居前兩位。結核病已是一種嚴重危害人民健康和國民經濟的傳染病，而中國是結核病的高負擔國，那么對于結核病防控策略的制定就成為了關系我國國計民生的重大問題。結核病的治療目前應用最多的當屬“化療”，化學藥物的治療對結核病有明顯的效果，但隨著“耐多藥結核”(MDR-TB)和“嚴重耐藥結核”(XDR-TB)發病率的升高，化療顯現出了局限性。那么，新的防治方法就成為了亟待解決的問題。一直以來，利用免疫學方法尋找新的有效預防和治療結核病的手段都是該領域研 究的熱點與重點。運用疫苗預防和治療結核病是最有效的結核病防控策略之一，但是現階段研究進展緩慢。目前，唯一可用于預防結核病的疫苗——卡介苗(BCG)僅對兒童播散性結核有一定的保護效果，但一般認為對成人結核保護效果比較弱。雖然一些新型的抗結核病疫苗相繼被開發，但大多仍處于探索階段，效果不甚理想。其中重要原因除了結核病免疫保護機理不清楚，就是在不同感染時期引起免疫保護反應的結核分枝桿菌有效抗原仍然不明確，這就成為了疫苗設計以及免疫策略制定的障礙。抗原關系到疫苗的成敗，那么篩選出與發病密切相關的功能性抗原以及更好地了解其免疫應答機制就可以為研制不同臨床需求的疫苗、制定免疫策略提供更多實際應用選擇。在腫瘤研究領域有研究表明，利用含有Hsp70、Gp96(腫瘤細胞表達的分子伴侶蛋白)等蛋白的疫苗免疫小鼠后可引起針對腫瘤抗原的特異性免疫反應，推測分子伴侶攜帶有腫瘤特異性抗原肽；在感染性疾病研究領域，有研究從乙肝病灶組織中提取的Gp96蛋白帶有一段HBV特異性抗原。對于肺結核病研究領域，目前還沒有直接從肺組織內篩選結核桿菌抗原的相關報道。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種具有促進淋巴細胞增殖功能的多肽。本發明所提供的多肽，名稱為Pep2，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。其中，序列表中的序列2由16個氨基酸殘基組成。編碼PeP2的基因、以及含有該基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范圍。P印2是本發明的發明人將Rotofor技術整合液相質譜聯用技術，直接從病人病變肺組織篩選出的結核分枝桿菌抗原多肽。實驗證明，P印2可以特異性刺激H37Rv感染小鼠脾臟淋巴細胞和淋巴結淋巴細胞顯著增殖，可以用于制備淋巴細胞增殖劑和研制結核病疫苗。


圖I為P印I和P印2刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖實驗結果。右上圖為小鼠脾臟細胞增殖實驗。右下圖為小鼠淋巴結細胞增殖實驗。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、功能性結核分枝桿菌抗原多肽刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖
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本實施例采用的功能性結核分枝桿菌抗原多肽是P印I (fadB5-l)和P印2 (fadB5-2),Pepl的氨基酸序列如序列表中序列I所示；P^)2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。UPepl和P印2的制備Pep I和Pep2采用固相多肽合成法(Fmoc法)由羧基端向氨基端方向合成。其中，所采用的樹脂是取代度為O. 5的2-CL-Trt。合成的多肽采用高效液相色譜進行純化得到純度為98%的P印I和P印2。純化的P印I和P印2經質譜鑒定，Pepl的氨基酸序列如序列表中序列I所示；Pep2的氨基酸序列如序列表中序列2所示。2、刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖實驗實驗流程如圖I所示，包括以下步驟2. I結核分枝桿菌H37Rv感染小鼠模型的制備結核分枝桿菌H37Rv (結核分枝桿菌實驗株，ATCC，25618)解凍后在7H9液體培養基復蘇一周后檢測液體培養基OD值，當細菌增長處于對數增長期時OD58tl = O. 5-0. 8 (10. D=IO8CFU),用無菌O. 9%生理鹽水(含O. 05% Tween-80)稀釋細菌菌體制備成5 X IO5CFU/mL的接種液。每只小鼠(C57Black/B6，購自中國醫學科學院實驗動物研究所)尾靜脈注射細菌I X 105CFU。小鼠感染H37Rv 8周后處死，分離組織細胞進行實驗。2. 2刺激小鼠脾臟和淋巴結細胞增殖實驗處死的小鼠(同齡的健康C57Black/B6對照小鼠和感染H37Rv的C57Black/B6小鼠)75%乙醇浸泡消毒后用眼科剪剪開腹腔和胸腔無菌分離脾臟和淋巴結，浸泡在IOml預冷的無血清RPMI-1640培養基中，取出組織用注射器的活塞研磨組織，尼龍網過濾掉脂肪組織和結締組織制備成單細胞勻衆，該操作在低溫下完成。單細胞懸液4°C 1500rpm, 5min離心，棄上清，無菌I XPBS重懸細胞后再次離心。加入500 μ L體積的紅細胞裂解液裂解紅細胞后加入IOml預冷的無菌IXPBS終止反應，再次離心，得到小鼠脾臟淋巴細胞和淋巴結淋巴細胞。棄上清后加入2mL含10% FBS的RPMI-1640培養液重懸細胞，用臺盼藍染料對細胞進行細胞計數，同時觀察細胞的存活率。共設以下四個實驗組和培養基本底對照組健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞組，健康C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞組，H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞組，H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞組。前四組每組均設如下四個處理反應體系中加入鼠抗人CD3⑶28抗體至終濃度為lug/ml，反應體系中分別將P印I和P印2加入10% FBS的RPMI-1640培養液至終濃度為10ug/ml。同時，反應體系中僅含10% FBS的RPMI-1640培養液的細胞作為陰性對照。用無抗體及多肽的含10% FBS的RPMI-1640培養液調整細胞濃度到I X IO6細胞/ml，上述四個實驗組中每組細胞懸液各分4份加入平底96孔板中，每孔細胞總數為2 X IO5個。其中一份加入10 μ L鼠抗人⑶30)28抗體溶液(mouse anti-human Q)3:BD, Cat.No. 555336 ；mouse ant i-human CD28 :BD，Cat. No. 555725))至鼠抗人 CD3CD28 抗體終濃度為I μ g/ml (表I中陽性對照)，一份加入10 μ L Pepl溶液至P印I終濃度為10ug/ml (表I中Pepl), 一份加入10 μ L Pep2溶液至Pep2終濃度為10ug/ml (表I中Pep2), 一份加入10 μ L的無抗體及多肽的含10% FBS的RPMI-1640培養液(表I中陰性對照)。上述四個實驗組的每個處理各設3個復孔。37°C 5% CO2溫箱孵育72小時；向培養板每孔中加入IOyL CCK-8 (Cell Counting Kit-8)溶液，37°C 5% CO2溫箱孵育4小時；用酶標儀測定在450nm處的吸光度。計算刺激指數Stimulation Index =(刺激孔OD值-培養基本底OD值)/ (未刺激孔OD值-培養基本底OD值)。其中，刺激孔OD值是指加入鼠抗人CD3CD28抗體、P印I或P印2刺激細胞讀取的OD值；未刺激孔OD值是指加入無抗體及多肽的含10%FBS的RPMI-1640培養液細胞讀取的OD值。 實驗設三次重復，結果如表I所示，鼠抗人⑶3⑶28抗體對健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數是I. 21，鼠抗人⑶3⑶28抗體對H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數是6. 43 ；Pepl對健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數是0. 94，Pep I對H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數是2. 71 ；Pep2對健康C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數是0. 90，P印2對H37Rv感染C57Black/B6小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數是3. 24。鼠抗人⑶3⑶28抗體對健康C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞的刺激指數是I. 75，鼠抗人⑶3⑶28抗體對H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞的刺激指數是3. 74 ；Pepl對健康C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞的刺激指數是0. 13,Pepl對H37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞的刺激指數是I. 04 ；P印2對健康C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞的刺激指數是0. 73，P印2對H37RvH37Rv感染C57Black/B6小鼠淋巴結淋巴細胞的刺激指數是I. 34(圖I)。說明P印I和P印2可以特異性刺激H37Rv感染小鼠脾臟淋巴細胞和淋巴結淋巴細胞，兩組多肽刺激的細胞顯著增殖。其中，P印I溶液和P印2溶液的溶劑均為溶劑為PBS(TAKARA公司，貨號T900。)表I.各處理復孔的450nm平均吸光度
權利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.權利要求I所述多肽的編碼基因。
3.含有權利要求2所述編碼基因的表達盒、重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
4.權利要求I所述的多肽在制備淋巴細胞增殖劑中的應用。
5.權利要求2所述的編碼基因在制備淋巴細胞增殖劑中的應用。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特征在于所述淋巴細胞為被H37Rv結核分枝桿菌感染的小鼠脾臟淋巴細胞。
7.權利要求I所述的多肽或權利要求2所述的編碼基因在制備抗結核病疫苗中的應用。
8.一種抗結核病疫苗，其活性成分為權利要求I所述的多肽或/和權利要求2所述的編碼基因。
9.一種淋巴細胞增殖劑，其活性成分為權利要求I所述的多肽或/和權利要求2所述的編碼基因。
全文摘要
本發明公開了功能性結核分枝桿菌抗原多肽及其應用。本發明所提供的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。該多肽可刺激H37Rv感染小鼠脾臟細胞和淋巴細胞顯著增殖，并可以與感染小鼠血清發生抗原-抗體反應，說明此多肽具有抗原性，可用于開發新型結核病預防性和治療性疫苗。
文檔編號C12N5/078GK102675425SQ20121011486
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月18日 優先權日2011年4月22日
發明者于楊, 劉海鷹, 張艷, 金奇 申請人:中國醫學科學院病原生物學研究所