專利名稱：一種用于基于焦磷酸原理的454高通量測序的emPCR方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種PCR技術。更具體的說，本發明涉及一種用于基于焦磷酸原理的454高通量測序的emPCR方法。
背景技術：
焦磷酸測序技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須進行熒光標記，操作極為簡便。焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并通過光學系統生成一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成 正比，然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。焦磷酸測序中所使用的模板需要通過一種稱為emPCR的方法制備得到。目前基于焦磷酸測序原理的454高通量測序中的emPCR方法屬于常規技術，并且市場上也有開發相
對成熟的商品可以直接應用。例如采用羅氏公司推出的試劑盒-RocheGS Titanium LV
emPCR Kit (Lib-L) v2，按其說明書記載的步驟操作，即可制得測序所需的emPCR產物。利用RocheGSTitanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2試劑盒制備測序所用的emPCR產物的步驟如下I)乳化油、emPCR擴增混合液和試劑準備，其中emPCR擴增混合液包括下列各組分
4 SV Emulsion--
__體積百分比(v/v) 體積(μ ν)
_超純水____240
emPCRAdditive__38.4%__360
_5 X 擴增液__22.4%__210
_] _擴增引物__8 %__75_
emPCR 酶混合液__53%__50_
_PPiase__02%__2_
總計100%937
I-1-1-1 I2) DNA文庫捕獲；3)乳化；
4)擴增，擴增反應的程序如下所示①94°C,4min;②94。。，30s;③60°C,10min;步驟②至③共50個循環； ④10 O 保存；5)磁珠回收；6) DNA文庫磁珠富集；7)測序引物退火，即制得測序所用的emPCR產物。現有的這種基于焦磷酸原理的454高通量測序中emPCR的方法對于所構建的文庫中片段大小的要求比較苛刻，如果片段大小差別過大，就會導致emPCR擴增出的磁珠上序列信號強度差異很大，進而影響后續測序時信號的讀取效率及準確性，產生較多的冗余數據，使有效數據降低30%以上，同時造成試劑和實驗時間的浪費，增加實驗成本。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是為了克服上述基于焦磷酸原理的454高通量測序中的技術缺陷，提供一種新的用于基于焦磷酸原理的454高通量測序的emPCR方法。本發明解決上述技術問題所采取的技術方案之一是一種用于基于焦磷酸原理的454高通量測序中emPCR的方法，其包括如下步驟 I)乳化油、emPCR擴增混合液和試劑準備；2) DNA文庫捕獲；3)乳化；4)擴增；5)磁珠回收；6) DNA文庫磁珠富集；7)測序引物退火，即制得測序所用的emPCR產物；其中，步驟I)所述的emPCR擴增混合液包括下列各組分emPCRAdditive,
30.6% 43. 0% (v/v) ;5X 擴增液，18. 4% 21. 5% (v/v);擴增引物，2. 0% 7. 5% (v/V) ; emPCR 酶混合液,2. 6% 5. 9% (v/v) ;PPiase, O. I % O. 3% (v/v)。上述各組分均為RocheGS Titanium LV emPCR Kit (Lib-L) v2 試劑盒自帶產品。較佳的，emPCR擴增混合液包括下列各組分emPCR Additive, 38. 4% (v/v) ；5X擴增液，20. 3% (v/v);擴增引物，4. 8% (v/v) ;emPCR 酶混合液，5. 3% (v/v) ；PPiase,0.2% (v/v);余量為水。本發明中，所述的水是本領域常規的用于測序的水，優選超純水。 本發明中，所述的emPCR擴增混合液的總體積是本領域基于焦磷酸原理的454高通量測序中所采用的常規總體積，一般為930μ I 980 μ 1，本發明最佳的是937 μ L。本發明的一較佳實例為，步驟I)所述的emPCR擴增混合液的總體積為937 μ L，包括下列各組分360 μ LemPCRAdditive ；180 200μ L5X擴增液；35 55 μ L擴增引物；50 μ LemPCR酶混合液；2 μ LPPiase ;其余為水。各組分含量如下表所示
權利要求
1.一種用于基于焦磷酸原理的454高通量測序中emPCR的方法，其包括步驟 1)乳化油、emPCR擴增混合液和試劑準備； 2)DNA文庫捕獲； 3)乳化； 4)擴增； 5)磁珠回收； 6)DNA文庫磁珠富集； 7)測序引物退火，即制得測序所用的emPCR產物； 其特征在于，步驟I)所述的emPCR擴增混合液包括下列各組分emPCRAdditive,30. 6% 43. 0% (v/v) ;5X 擴增液，18. 4% 21. 5% (v/v);擴增引物，2. 0% 7. 5% (v/V) ;emPCR 酶混合液，2. 6% 5. 9% (v/v) ;PPiase，0. 1% O. 3% (v/v);余量為水。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的emPCR擴增混合液包括下列各組分emPCR Additive, 38. 4 % (v/v) ;5X 擴增液，20. 3 % (v/v);擴增引物，4.8% (v/V) ;emPCR 酶混合液,5. 3% (v/v) ；PPiase,0. 2% (v/v);余量為水。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR擴增混合液的總體積為930 μ L 980 μ L。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR擴增混合液的總體積為937 μ L，包括下列各組分:360 μ L emPCRAdditive ; 180 200 μ L 5 X 擴增液；35 55 μ L擴增引物；50 μ L emPCR酶混合液;2 μ L PPiase ;余量為水。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的emPCR擴增混合液的總體積為937 μ L，包括下列各組分290 μ L 超純水；360 μ L emPCRAdditive ； 190 μ L5X 擴增液；45 μ L 擴增引物；50 μ LemPCR 酶混合液；2μ L PPiase。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟4)所述擴增的反應程序為①90-95°C,3-6min ；②93-95。。，28-32s ；③57-59°C,4-5min ；④66-70。。，28-32s ； 步驟②至④共45-55個循環； ⑤4-10°C保存。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述擴增的反應程序中步驟②至④為②94-95。。，28-32s ；③57-58°C,4-5min ；④67-69。。，28-32s。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述擴增的反應程序中步驟①為94°C，4min ;步驟⑤為10°C保存。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述擴增的反應程序為①94°C,4min ；②94。。，30s ；③58°C,4. 5min ；④68。。，30s ； 步驟②至④共50個循環； ⑤10°C保存。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的高通量測序為基于焦磷酸原理的454高通量轉錄組測序。
全文摘要
本發明公開了一種用于基于焦磷酸原理的454高通量測序的emPCR方法，其是在配制emPCR擴增混合液的過程中，將超純水、5×擴增液、擴增引物、emPCR擴增混合液和PPiase的體積做了調整；在進行擴增反應時將擴增條件由一步擴增改為兩步擴增。采用本發明所述emPCR的方法能夠有效降低非特異性擴增信號，減少冗余的數據，使有效數據的產量提高30％，同時提高了實驗效率，節約了實驗成本。
文檔編號C12Q1/68GK102719528SQ20121013026
公開日2012年10月10日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者孫子奎, 孟和, 陳永燦 申請人:上海派森諾生物科技有限公司