專利名稱：一種生物拆分制備n-甲基-d-天門冬氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法。
背景技術(shù)：
N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)是D-天門冬氨酸的甲基化產(chǎn)物，白色，分子式為C5H9NO4,分子量為147，易溶于水，化學(xué)穩(wěn)定性良好，但吸濕性較強(qiáng)，易潮解。NMDA —般僅存在于動(dòng)物的神經(jīng)和內(nèi)分泌組織中，對(duì)神經(jīng)和內(nèi)分泌具有重要的調(diào)控作用。NMDA是神經(jīng)興奮性氨基酸遞質(zhì)天門冬氨酸和谷氨酸的強(qiáng)效激活劑，適量的NMDA能夠顯著促進(jìn)動(dòng)物腺垂體中生長(zhǎng)激素(GH)、黃體生長(zhǎng)素(LH)、促性腺激素釋放激素(CnRH)以及催乳素(PRL)的分泌。目前N-甲基-D-天門冬氨酸主要采用化學(xué)合成法生產(chǎn)。蔣光玉等在其論文《N-甲基-D-天門冬氨酸的合成》中提到在室溫條件下，以D-天門冬氨酸為主要原料，首先與甲醇和氯化亞砜發(fā)生酯化反應(yīng)，合成D-天門冬氨酸二甲酯鹽酸鹽(DDAH)。DDAH在DMF溶液中，以K2CO3S縛酸劑，然后向其中緩慢滴加CH3I,在室溫條件下反應(yīng)16h，生成N-甲基-D-天門冬氨二甲酯。然后在堿性條件下，向N-甲基-D-天門冬氨二甲酯溶液中加入乙酸乙酯、石油醚和純化水混合液，反應(yīng)30min后，用4mol/LHCl調(diào)節(jié)pH值5. 00-6. 00，減壓過(guò)濾獲得白色晶體，然后用純化水和石油醚1:1的混合液洗滌三次，干燥后獲得N-甲基-D-天門冬氨酸晶體。采用以上制備方法存在原材料成本高、反應(yīng)步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品不易分離及廢液中含有毒物質(zhì)等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，其原材料成本低廉、反應(yīng)步驟少，反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短，產(chǎn)品容易分離、純度高,適合大生產(chǎn)的需要。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，包括以下步驟
(1)以10-25g/L的谷氨酸或谷氨酸鈉作為碳源，15-25g/L蛋白胨、15-25g/L酵母膏、15-25g/L酵母浸粉和10-20g/L玉米漿干粉至少一種原料作為氮源在培養(yǎng)基上培養(yǎng)假單胞菌1154(Pseud0m0nas 1154)菌株，生成高活力的N-甲基-L-天門冬氨酸-β -脫羧酶； (2)將上述培養(yǎng)液和N-甲基-DL-天門冬氨酸鹽溶液混合進(jìn)行酶不對(duì)稱催化反應(yīng)；
(3)然后分離反應(yīng)生成物，最后得到N-甲基-D-天門冬氨酸。所述步驟(I)培養(yǎng)假單胞菌1154 (Pseudomonas 1154)菌株時(shí)，培養(yǎng)溫度為300C -40°C，時(shí)間 15h-30h。所述步驟(2)中N-甲基-DL-天門冬氨酸鹽為N-甲基_DL_天門冬氨酸的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。所述步驟(2)酶不對(duì)稱催化反應(yīng)時(shí)，pH值為4. 00-8. 00，溫度為25°C -58°C。
所述步驟(3)分離提取N-甲基-D-天門冬氨酸的方法為等電點(diǎn)結(jié)晶法，pH值調(diào)整為 2. 00-3. 00。本發(fā)明的有益效果是通過(guò)培養(yǎng)微生物假單胞菌得到高活力的N-甲基-L-天門冬氨酸-β -脫羧酶，該酶具有高專一性，能夠得到光學(xué)純度接近100%的N-甲基-D-天門冬氨酸；酶反應(yīng)的底物為N-甲基-DL-天門冬氨酸的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽，原材料單一、易得；酶反應(yīng)時(shí)pH值為4. 00-8. 00，溫度為25°C _58°C，時(shí)間為24h_72h，反應(yīng)條件溫和，時(shí)間短，適合大生產(chǎn)的需要；本發(fā)明采用游離細(xì)胞一步酶法拆分N-甲基-DL-天門冬氨酸得到N-甲基-D-天門冬氨酸,反應(yīng)步驟少,操作簡(jiǎn)單。
具體實(shí)施例方式N-甲基-L-天門冬氨酸-β -脫羧酶可以催化N-甲基-L-天門冬氨酸脫羧反應(yīng)生成N-甲基-L-丙氨酸，而對(duì)其光學(xué)異構(gòu)體N-甲基-D-天門冬氨酸則完全不發(fā)生作用，產(chǎn)生該酶的菌種有假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌屬、無(wú)色桿菌屬、諾卡氏菌屬等。培養(yǎng)這些微生物，利用其產(chǎn)生的N-甲基-L-天門冬氨酸-β -脫羧酶作用N-甲基-DL-天門冬氨酸溶液，可以不對(duì)稱催化其中的N-甲基-L-天門冬氨酸生成N-甲基-L-丙氨酸，而其光學(xué)異構(gòu)體N-甲基-D-天門冬氨酸則完全不參加反應(yīng)。利用N-甲基-D-天門冬氨酸在酸性條件下溶解性小的特性，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH值2. 00-3. 00，則其從反應(yīng)體系中結(jié)晶出來(lái)，而N-甲基-L-丙氨酸則溶解在溶液中，從而達(dá)到分離的目的。以下是實(shí)施例，將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但對(duì)本說(shuō)明沒(méi)有限制。實(shí)施例I
配制含蛋白胨20g/L，谷氨酸鈉15g/L，玉米漿干粉18g/L，甘油5g/L，硫酸鎂O. 2g/L，磷酸二氫鉀lg/L的培養(yǎng)基10L，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整pH值到7. 00-7. 20，分裝入IOOOml三角燒瓶中，每瓶250ml。將上述培養(yǎng)基于121°C滅菌30min，冷卻備用。將保存在斜面上的假單胞菌1154菌株用Φ Imm接種環(huán)按每瓶一環(huán)的量接入上述培養(yǎng)基中。溫度33°C，濕度45%，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)20h。合并上述細(xì)胞培養(yǎng)液，加入到IOL含有20%N_甲基-DL-天門冬氨酸鈉的溶液中，維持pH值5. 00-7. 00，溫度40 0C，反應(yīng)48h。轉(zhuǎn)化液于3000rpm，離心30min，收集上清液；活性炭O. 8%，溫度70°C，脫色45min，減壓過(guò)濾；脫色液用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值為2. 00，析出白色晶體；減壓過(guò)濾獲得白色晶體，然后用無(wú)水乙醇洗滌三次，置于干燥箱中干燥后得到N-甲基-D-天門冬氨酸晶體。實(shí)施例2
配制含蛋白胨20g/L，酵母浸粉20g/L，谷氨酸20g/L，氯化鈉15g/L，玉米漿干粉15g/L，硫酸鎂O. 2g/L，磷酸二氫鉀lg/L的發(fā)酵液7L，調(diào)整pH值7. 00-7. 20，將上述培養(yǎng)基加到IOL發(fā)酵罐中，121°C滅菌30min，冷卻。按10%接種量接入假單胞菌1154菌株，溫度33°C，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通風(fēng)比I :0. 2，培養(yǎng)22h。向上述細(xì)胞培養(yǎng)液加入N-甲基-DL-天門冬氨酸銨700g，維持pH值4. 00-8. 00，溫度40°C，反應(yīng)48h。轉(zhuǎn)化液于3000rpm，離心30min，收集上清液；活性炭O. 8%，溫度70°C，脫色45min，減壓過(guò)濾；脫色液用濃硫酸調(diào)節(jié)PH值為2. 60，析出白色晶體；減壓過(guò)濾獲得白色晶體，然后用無(wú)水乙醇洗滌三次，置于干燥箱中干燥后得到N-甲基-D-天門冬氨酸晶體。實(shí)施例3
同實(shí)施例2培養(yǎng)基配方，在IOT罐中配制培養(yǎng)基7T，按O. 5接種量接入假單胞菌1154菌株，溫度33°C，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比I :0. 2，培養(yǎng)22h。在轉(zhuǎn)化罐中，將上述細(xì)胞培養(yǎng)液升溫至40°C，維持pH4. 00-8. 00，不斷流加30%濃度的N-甲基-DL-天門冬氨酸鈉溶液進(jìn)行酶促反應(yīng)；轉(zhuǎn)化結(jié)束后，活性炭I. 0%，80°C，脫色 60min，板框過(guò)濾；脫色液用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值為3. 00，析出白色晶體；離心洗滌后，采用沸騰式干燥機(jī)干燥得到N-甲基-D-天門冬氨酸晶體。
權(quán)利要求
1.一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)以10-25g/L的谷氨酸或谷氨酸鈉作為碳源，15-25g/L蛋白胨、15-25g/L酵母膏、.15-25g/L酵母浸粉和10-20g/L玉米漿干粉至少一種原料作為氮源在培養(yǎng)基上培養(yǎng)假單胞菌1154 (Pseudomonas 1154)菌株,生成N-甲基-L-天門冬氨酸-β -脫羧酶； (2)將上述培養(yǎng)液和N-甲基-DL-天門冬氨酸鹽溶液混合進(jìn)行酶不對(duì)稱催化反應(yīng)； (3)然后分離反應(yīng)生成物，最后得到N-甲基-D-天門冬氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，其特征在于所述步驟(I)培養(yǎng)假單胞菌1154(Pseudomonas 1154)菌株時(shí)，培養(yǎng)溫度為30°C -40°C,時(shí)間 15h-30h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，其特征在于所述步驟(2)中N-甲基-DL-天門冬氨酸鹽為N-甲基-DL-天門冬氨酸的鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，其特征在于所述步驟(2)酶不對(duì)稱催化反應(yīng)時(shí)，pH值為4. 00-8. 00，溫度為25°C -58°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，其特征在于所述步驟(3)分離提取N-甲基-D-天門冬氨酸的方法為等電點(diǎn)結(jié)晶法，pH值調(diào)整為.2.00_3· OO0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生物拆分制備N-甲基-D-天門冬氨酸的方法，以谷氨酸或谷氨酸鈉作為碳源，蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉和玉米漿干粉至少一種原料作為氮源在培養(yǎng)基上培養(yǎng)假單胞菌1154(Pseudomonas1154)菌株，生成高活力的N-甲基-L-天門冬氨酸-β-脫羧酶；然后和N-甲基-DL-天門冬氨酸鹽溶液混合進(jìn)行酶不對(duì)稱催化反應(yīng)；最后分離反應(yīng)生成物，得到N-甲基-D-天門冬氨酸。本發(fā)明原材料成本低廉、反應(yīng)步驟少，反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短，產(chǎn)品容易分離、純度高，適合大生產(chǎn)的需要。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102660626SQ20121013020
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者劉煥書(shū), 孟凡會(huì), 徐龍, 朱傳厚, 苗位云, 郭志遠(yuǎn), 韓秀麗, 黃建坡 申請(qǐng)人:淮北新旗氨基酸有限公司