專利名稱：一種混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，具體涉及ー種混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法。
背景技術：
功能性營養物質的開發是國內外食品領域最熱門的研究課題，具有深遠的生物學意義和重要的應用價 值，是二十一世紀食品エ業發展的重點。大豆蛋白是優良的植物蛋白源，其資源豐富、價格低廉，并在經過微生物發酵或酶水解后產生大量不同活性的生物活性肽。大豆活性肽的氨基酸組成與大豆蛋白完全相同，必需氨基酸平衡且含量豐富。由于大豆活性肽的分子量較小，在小腸內能以完整肽段的形式被人體或動物吸收，且具有降低血清膽固醇、降血壓和促進脂肪代謝等多種特殊的生理活性功能。因此，大豆活性肽可廣泛應用于食品和醫藥等行業，具有廣闊的市場應用前景。目前，制作大豆活性肽的方法主要是酶解法。主要是將大豆蛋白加水混合，然后加入復合蛋白酶進行酶解，再經過分離、濃縮和干燥，制成大豆活性肽產品。但是由于豆柏中抗營養因子不能完全去除，影響了蛋白酶的活性，因此水解程度不高；同時，利用酶解法生產大豆活性肽一直存在生產成本偏高的問題，主要原因包括(I)酶解法一般采用大豆分離蛋白作為生產原料，原料成本較普通脫脂豆柏増加5-10倍；(2)液體酶解使用的酶量大，且多為進ロ酶。同時，酶解法生產大豆活性肽的苦味明顯，ロ感較差，這些都是阻礙大豆活性肽產業化的主要因素。因此,需要一種新的生產エ藝來降低大豆活性肽生產成本。

發明內容
本發明目的是針對現有技術的不足，提供ー種以脫脂豆柏為原料，利用兩種微生物混合培養、固態發酵完成對脫脂豆柏中大豆蛋白質的水解，生產成本低的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法。本發明的技術方案如下一種混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于以脫脂豆柏為原料，進行預處理后加入芽孢桿菌與乳酸菌或釀酒酵母的發酵劑，進行固態發酵；再經提取分離、噴霧干燥而成。本發明具體エ藝步驟包括A、預處理豆柏；B、固態發酵向經過預處理的脫脂豆柏中加入芽孢桿菌與乳酸菌(或釀酒酵母)的混合發酵劑，進行固態發酵；C、加水提取固態發酵后的培養基，分離去除殘渣；D、脫色；E、精制將脫色處理后的酶水解液進行超濾處理；F、噴霧干燥。其中本發明所加入的混合發酵劑的乳酸菌或釀酒酵母與枯草芽孢桿菌的復配方法為配制無菌培養基；將活化后各微生物菌種用無菌培養基，按照乳酸菌(或釀酒酵母)與枯草芽孢桿菌的活菌數比例為I : I 10配制成混合發酵劑，按照固液質量比10 20 I加入混合發酵劑；發酵溫度是30-40°C ;發酵時間為24-48小吋。
本發明與現有的技術相比，反應條件溫和，能充分發揮微生物的水解蛋白質的作用井能降解豆柏中的抗營養因子，從而I)利用普通脫脂豆柏為原料，完成對脫脂豆柏中大豆蛋白質的水解；2)減少外加蛋白酶量，有效的降低生產成本。優點是克服了現有技術的不足，提供ー種利用脫脂豆柏作為原料，生產大豆活性肽的制作方法(I)直接以豆柏為原料固態發酵生產大豆肽；生產エ藝簡單，成本低，而且有利于環境友好保護(2)利用不同微生物混合發酵時產生蛋白酶和多種代謝產物，大大簡化了エ藝過程，節省了生物酶制劑的使用，降低了エ業化生產成本。經檢測，本發明方法所制備的大豆活性肽含量(以干基計)高達70. 12% ;肽分子量分布范圍為小于10000道爾頓的達到90%以上。本發明方法所制備得到的大豆活性肽主要是由2-10個氨基酸組成的多肽混合物，是ー種多功能營養型因子，具有免疫調節、降壓等功能。
具體實施例方式一種混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，具體エ藝步驟包括
(I)預處理豆柏；將壓榨制油得到豆柏進行粉碎，獲得粉碎的大豆柏，而后加水調漿至原料濃度10-15%的溶液，在100-120°C溫度條件下滅菌處理，冷卻至30-40°C。(2)固態發酵向經過預處理的脫脂豆柏中加入芽孢桿菌與乳酸菌或釀酒酵母的混合發酵劑，進行固態發酵；按照固液質量比10 20 I加入發酵菌劑；發酵溫度是30-400C ;發酵時間為24-48小時。(3)加水提取加水提取固態發酵后的培養基，分離去除殘渣；分離去除殘渣的方法為過濾法或者離心處理，離心轉速4000-6000轉/分鐘，得到大豆活性肽的粗提液。(4)脫色將大豆活性肽粗提液加入粗提液重量I. 0-5. 0%的活性炭粉末或微粒，于30-50°C條件下進行脫色處理，I. 0-3. 0小時后過濾分離。(5)精制將大豆活性肽用超濾膜按分子量進行分級分離，操作壓カ0. 3-1. OMpa,得到不同分子量的不同功能大豆活性肽溶液；截留分子量分別為1000道爾頓，或3000道爾頓，或5000道爾頓，或10000道爾頓。精制是將脫色處理后的酶水解液進行超濾處理；(6)噴霧干燥。進ロ溫度150_180°C，干燥器內溫度100-110°C，出口溫度65-100°C。本發明對步驟(2)的混合發酵劑進行了菌種的篩選，篩選對象包括白地霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和地衣芽胞桿菌，具體篩選方法是先制備發酵菌劑活化后的菌種擴大培養后，用無菌水稀釋使菌體或者孢子濃度達到3X IO6個/ml ;然后將大豆柏粉碎為粒徑在80目左右，121°C下滅菌20min。在固態發酵罐內按照固液比10 I的比例加入發酵劑，發酵溫度為30°C，采用離心力IOOOOg高速離心去除雜質，得到大豆活性肽；比較不同菌種發酵后大豆柏的水解度、肽得率和微生物產蛋白酶活力及粗提液中大豆蛋白肽的分子量分布，得到芽孢桿菌、釀酒酵母和乳酸菌的發酵效果較好。本發明步驟⑵的混合發酵劑的制備方法如下A、枯草芽孢桿菌的制備斜面培養基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，自來水1000ml，pH 7. 2。種子培養基在斜面培養基的基礎上添加KCl 5g。從活化的菌種斜面培養基中，跳去枯草芽孢桿菌的種子接種于種子培養基，130r/min搖瓶培養48h，達到菌體濃度IO8個/ml。B、乳酸菌的制備斜面培養基酵母膏5g，蛋白胨10g, NaCl 5g，瓊脂20g,自來水1000ml, pH 7. 2。種子培養基酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，碳酸鈣20g，自來水1000ml，pH 7. 2。
從活化的菌種斜面培養基中，挑取乳酸菌的種子接種于種子培養基，靜置培養48h，達到菌體濃度IO8個/ml。C、酵母菌的制備斜面培養基馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖5g，自來水1000ml，pH 7. 2。種子培養基馬鈴薯浸出粉10g，葡萄糖5g，自來水1000ml，pH 7. 2。從活化的菌種斜面培養基中，挑取酵母菌的種子接種于種子培養基，搖瓶培養24h,達到菌體濃度IO7個/ml。D、混合發酵劑復配方法為配制無菌培養基，成分為葡萄糖10g，酵母膏5g，KH2PO4lg，無菌水1000ml，pH為6. 8 ;將活化后各微生物菌種用無菌培養基，按照乳酸菌(或釀酒酵母)與枯草芽孢桿菌的活菌數比例為I : I 10配制成混合發酵劑。下面通過幾個實施例具體說明混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法及其產品性倉泛實施例II)預處理脫脂豆柏取脫脂豆柏原料150公斤，將大豆柏粉碎至顆徑大小為80目，加水調降至原料濃度10%的溶液，在110°C條件下滅菌15分鐘，并冷卻到35°C ；2)發酵按固液比10 : I (質量比)的比例加入乳酸菌與枯草芽孢桿菌混合發酵齊U，發酵溫度為40°c，發酵時間為48小時；3)加水提取加水提取固態發酵后的培養基，低速離心處理(3000g)去除發酵液中的固體雜質，從而得到大豆活性肽粗提液；4)脫色將大豆活性肽粗提液加入粗提液重量I. 0%的活性炭粉末，于35°C條件下進行脫色處理，I小時后通過板框過濾機去除活性炭粉末；5)精制將大豆活性肽用超濾膜按分子量進行分級分離，得到不同分子量和不同功能的大豆肽活性溶液；截留分子量為1000道爾頓；6)噴霧干燥進ロ溫度150°C，干燥器內溫度100°C，出ロ溫度75°C。得到的大豆活性妝蛋白質含量為85. I %，分子量在IOOOODa以下的妝含量為90. 2%,大ii中的抗原蛋白含量基本清除。實施例2 (I)取脫脂豆柏200公斤，將脫脂豆柏加水調降至原料濃度12%的溶液，在100°C下滅菌35分鐘，并冷卻到40°C ；(2)發酵按固液比15 I (質量比)的比例加入乳酸菌與枯草芽孢桿菌混合發酵劑，發酵溫度為30°C ;發酵時間為24小時；(3)離心離心轉速6000轉/分鐘；去除發酵液中的固體雜質，從而得到大豆活性妝粗提液；(4)脫色將大豆活性肽粗提液加入粗提液重量3. 0%的活性炭粉末，于40°C條件下進行脫色處理，2小時后通過板框過濾機去除活性炭粉末；
(5)精制用超濾膜按分子量進行分級分離，截留分子量為5000道爾頓。(6)噴霧干燥進ロ溫度180°C，干燥器內溫度11 (TC，出ロ溫度100°C。得到的大豆活性肽蛋白質含量為80. 1%，分子量在IOOOODa以下的肽含量為91. 2%，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。實施例3 (I)取脫脂豆柏100公斤，將脫脂豆柏 加水調降至原料濃度14%的溶液，在120°C下滅菌30分鐘，并冷卻到35 °C ；(2)發酵按固液比20 I (質量比)的比例加入乳酸菌與枯草芽孢桿菌混合發酵劑；發酵溫度為35°C ;發酵時間為36小時；(3)離心離心轉速5000轉/分鐘；去除發酵液中的固體雜質，從而得到大豆活性妝粗提液；(4)脫色將大豆活性肽粗提液加入粗提液重量5. 0%的活性炭粉末，于45°C條件下進行脫色處理，3小時后通過板框過濾機去除活性炭粉末；(5)精制用超濾膜按分子量進行分級分離，截留分子量為5000道爾頓；10000道爾頓。(6)噴霧干燥進風溫度160°C，干燥器內溫度104°C，出ロ溫度95°C。得到的大豆活性肽蛋白質含量為73. 1%，分子量在IOOOODa以下的肽含量為95. 1%，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。實施例4 (I)取脫脂豆柏200公斤，將脫脂豆柏加水調降至原料濃度15%的溶液，在115°C下滅菌40分鐘，并冷卻到35 °C ；(2)發酵按固液比20 I (質量比)的比例加入酵母菌與枯草芽孢桿菌混合發酵劑，發酵溫度為40°C ;發酵時間為36小時；(3)離心離心轉速5000轉/分鐘；去除發酵液中的固體雜質，從而得到大豆活性妝粗提液；(4)脫色將大豆活性肽粗提液加入粗提液重量I. 0%的活性炭粉末，于40°C條件下進行脫色處理，I小時后通過板框過濾機去除活性炭粉末；(5)精制用超濾膜按分子量進行分級分離，截留分子量為3000道爾頓；5000道爾頓。(6)噴霧干燥進風溫度180°C,干燥器內溫度110°C,出ロ溫度100°C。得到的大豆活性肽蛋白質含量為83. 1%，分子量在IOOOODa以下的肽含量為95. 1%，大豆中的抗原蛋白含量基本清除。
權利要求
1.一種混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在干以脫脂豆柏為原料，進行預處理后加入芽孢桿菌與乳酸菌或釀酒酵母的發酵劑，進行固態發酵；再經提取分離、噴霧干燥而成。
2.根據權利要求I所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在干，以壓榨制油得到豆柏為原料，其エ藝步驟包括A、預處理豆柏；B、固態發酵向經過預處理的脫脂豆柏中加入芽孢桿菌與乳酸菌或釀酒酵母的混合發酵劑，進行固態發酵；C、加水提取固態發酵后的培養基，分離去除殘渣；D、脫色；E、精制將脫色處理后的酶水解液進行超濾處理；F、噴霧干燥。
3.根據權利要求2所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于步驟A中所述的預處理為將壓榨制油得到豆柏進行粉碎，獲得粉碎的大豆柏，而后加水調漿至原料濃度10-15%的溶液，在100-120°C溫度條件下滅菌處理，冷卻至30-40°C。
4.根據權利要求2所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于步驟B中所述發酵步驟中，所加入的混合發酵劑的乳酸菌或釀酒酵母與枯草芽孢桿菌的復配方法為配制無菌培養基；將活化后各微生物菌種用無菌培養基，按照乳酸菌或釀酒酵母與枯草芽孢桿菌的活菌數比例為I : I 10配制成混合發酵劑，按照固液質量比10 20 I加入混合發酵劑；發酵溫度是30-40°C ;發酵時間為24-48小吋。
5.根據權利要求2所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在干，步驟C中所述的加水提取步驟中，分離去除殘渣的方法為過濾法或者離心處理，離心轉速4000-6000轉/分鐘，得到大豆活性肽的粗提液。
6.根據權利要求2所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于，步驟D中所述的脫色處理在以下條件下進行將大豆活性肽粗提液加入粗提液重量I. 0-5. 0%的活性炭粉末或微粒，于30-50°C條件下進行脫色處理，I. 0-3. 0小時后過濾分離。
7.根據權利要求2所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于，步驟E中所述的精制是將大豆活性肽用超濾膜按分子量進行分級分離，操作壓カ0. 3-1. OMpa，得到不同分子量的不同功能大豆活性肽溶液。
8.根據權利要求2所述的混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于，步驟F中所述的噴霧干燥在以下條件下進行進ロ溫度150-180°C，干燥器內溫度100-110°C，出口溫度 65-100°C。
全文摘要
本發明屬于微生物類，具體是一種混菌固態發酵制備大豆活性肽的方法，其特征在于，以脫脂豆粕為原料，進行預處理后加入芽孢桿菌與乳酸菌或釀酒酵母的混合發酵劑，進行固態發酵，混合發酵劑的乳酸菌或釀酒酵母與枯草芽孢桿菌的活菌數比例為1∶1～10；再經提取分離、噴霧干燥而成，本發明克服了現有技術的不足，提供一種利用脫脂豆粕作為原料，生產大豆活性肽的制作方法直接以豆粕為原料固態發酵生產大豆肽；生產工藝簡單，成本低，而且有利于環境友好保護；利用不同微生物混合發酵時產生蛋白酶和多種代謝產物，大大簡化了工藝過程，節省了生物酶制劑的使用，降低了工業化生產成本。
文檔編號C12R1/07GK102660622SQ20121013290
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者馮杰, 周源, 唐群霞, 孫宏, 張秋法, 施偉領, 沈建軍, 許廣銓 申請人:浙江大飛龍動物保健品有限公司