專利名稱：一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于食品檢測領域，具體涉及ー種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒，同時還涉及ー種食品中副溶血弧菌活菌的檢測方法。適用于動物性水產品、動物性水產品干制品、腌醉制生食動物性水產品、即食藻類食品、魚糜制品等水產食品和水產調味品，及其他加工食品。本發明適用于水產品養殖企業、水產品加工企業、超市、農貿市場、水產品批發市場的快速檢測及國家相關職能檢測機構實驗室檢測。
背景技術：
副溶血性弧菌(Vibio parahemolyticus)廣泛分布于江河、海洋及熱帶和溫帶沿海地區，主要寄生于浮游生物、魚、蝦蟹、貝類等水產品中，給水產養殖業造成巨大的經濟損失。直接或間接食用被該菌污染的食品會引發腸胃功能紊亂、急性胃腸炎、淺表創傷感染、敗血病等疾病，是引起食物中毒的重要病原體之一。在細菌性食物中毒的構成中，以副溶血弧菌引起的急性腸炎占首位。副溶血弧菌產生的毒素有溶血素和尿素酶。其致病因子主要有耐熱直接溶血毒素、耐熱直接相關溶血毒素、不耐熱溶血毒素。因此，快速靈敏的檢測手段是預防控制副溶血弧菌傳播的關鍵。通常傳統鑒定方法是分離培養、鏡檢觀察、生化鑒定及嗜鹽性試驗等，這些檢測手段不僅耗時而且操作復雜、靈敏度較低。近年來，有大量研究是基于PCR檢測方法，PCR檢測方法在操作時間，檢測的特異性和靈敏度方面較常規方法均有較大提高，但PCR檢測方法需要精密的PCR儀，它的檢測時間也較長(2 4h)，并且反應過程很容易受污染物的影響，從而使得這種方法不能滿足實地快速檢測的需求。另外還有一些檢測方法，比如免疫色譜法、DNA雜交法，雖然檢測靈敏度高，但是所需設備和操作過程比較復雜，也不能滿足實地快速檢測的需求。環介導等溫擴增法(LAMP)是2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計2對特異性引物，利用ー種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63°C左右)保溫30 60min，即可完成核酸擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是ー種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技木，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。現有技術中已經有副溶血弧菌檢測試劑盒和檢測方法，但在實際使用過程中存在著無法區分副溶血弧菌活體菌與死菌，對檢測結果準確性影響很大，常出現假陽性結果。

發明內容
本發明的目的是在于提供了ー種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒，能快速檢測食品中副溶血弧菌活菌，與PCR檢測方法相比較，EMA-LAMP檢測方法提高了檢測特異性、靈敏度和準確性。與傳統LAMP檢測方法相比較，EMA-LAMP檢測方法可以區分試樣中的活菌和死菌，只檢測樣本中存在的副溶血弧菌活菌，檢測結果更加準確，極大的降低了假陽性結果產生。同時傳統LAMP檢測方法其特點是針對靶基因的6個區域設計2對特異性引物，而本發明對傳統LAMP檢測方法進行了創新，其特點是針對靶基因的6個區域設計3對特異性引物，使得檢測特異性、靈敏度和準確性均有較大的提高。本發明的另ー個目的是在于提供了ー種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒的檢測方法，方法易行，操作簡便，快速、靈敏的檢測食品中副溶血弧菌活體菌，該方法在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技木，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施ー種副溶血弧菌LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒它包括以下成分10X反應緩沖液；Bst DNA聚合酶；dNTPs ；MgS04 ；DNase/RNase-Free ddH20 ;引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R ;疊氮溴化こ錠；1000XSYBR Green I熒光染料。 IOX 反應緩沖液配方200mM Tris-HClUOOmM KClUOmM(NH4)2SO4U. 0% (質量體積比)Tritonx-IOO0引物F3 :5，AGCTACTCGAAAGATGATCC 3 ’引物B3 :5 ’ GGTTGTATGAGAAGCGATTG 3，引物FIP : 5，ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT 3，引物BIP :5，ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 3，引物Loop-F 5 ’ ACCAGTAGCCGTCAATG 3 ’引物Loop-R 5 ’ TTAGATTTGGCGAACGAGA 3 ’副溶血弧菌的環介導等溫擴增，具體步驟在裝有23 μ L的LAMP反應試的200 μ LPCR管中加入2 μ L待檢樣品DNA模板，于63°C恒溫水浴箱放置60min ;擴增結果的檢測方法主要有以下3種，方法I : 2% (質量體積比)的瓊脂糖電泳檢測是否產生連續的DNA擴增；方法2 :采用濁度儀檢測管內濁度變化，可進行實時定量檢測；方法3 :反應產物中加入SYBR Green I熒光染料，肉眼觀察顏色反應，呈綠色為陽性反應，橙紅色為陰性反應。本發明采用方法I和方法3進行檢測結果的判定。ー種食品中副溶血弧菌活菌的檢測方法，其步驟是(I)動物性水產品干制品、腌醉制生食動物性水產品、即食藻類食品、魚糜制品等水產食品和水產調味品及其他加工食品均應經過前增菌。以無菌操作取25g(25mL)樣品，加入裝有225mL 3.5% (質量體積比)滅菌鹽水，用均質器打碎，取IOmL接種于IOOmL 3%(質量體積比)氯化鈉堿性蛋白胨水增菌培養基內，于37°C培養8h 16h。(2)取ImL過夜培養菌液，加入疊氮溴化こ錠(EMA)至終濃度為150 μ g/mL,暗處放置10-15min，隨后將整個EP管暴露在500W鹵素燈下4_6min，鹵素燈離樣品約15cm。整個光激發過程在冰上進行，以防止溫度的升高。(3)采取DNA快速提取法提取樣品中的DNA，即將疊氮溴化こ錠(EMA)處理過的菌液煮沸8-12min，短暫離心，取離心后的上清液為環介導等溫擴增法(LAMP)反應的模板DNA。此方法提取DNA較簡單，適用于現場采樣檢測，無需特殊設備。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果本發明解決了現有技術檢測副溶血弧菌所需周期長、檢測成本高、現有副溶血弧菌檢測試劑盒無法區分檢測樣本中副溶血弧菌是否是活菌的不足，本專利提供ー套快速檢測食品中副溶血弧菌活體菌的EMA-LAMP法檢測試劑盒，具有快速、高效、準確性高、靈敏度高、現場應用方便等特點，可廣泛適用于食品，衛生，出入境等檢測領域。實驗室EMA-LAMP檢測副溶血弧菌的最低檢測限為IX 10CFU/mL，在現場采樣檢測中EMA-LAMP檢測副溶血弧菌的最低檢測限一般可達1X10 lX102CFU/mL，現場檢測可在I. 5h內完成整個檢測過程，與中華人民共和國國家標準GB/T4789. 7-2008的檢測方法進行對比，其檢測結果準確性一致。


圖I為ー種副溶血弧菌PCR和LAMP檢測結果示意圖。PCR與LAMP擴增在2%瓊脂糖電泳結果。泳道I 9分別以I X 109、I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X 104、I X 103、I X IO2、I X 10CFU/mL 菌懸液為模板的 PCR 擴增產物；泳道 10 為 marker (DNA 片段大小依次為 100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000,1500bp);泳道 11 19 分別以 I X 109、I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X 104、I X 103、
IX 102、I X 10CFU/mL菌懸液為模板的LAMP擴增產物。圖2為ー種EMA-LAMP特異性檢測結果示意圖。EMA-LAMP擴增在2%瓊脂糖電泳結果。泳道I為marker (DNA片段大小依次為100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp);泳道 2 7 分別以 6 株副溶血弧菌菌懸液(I X 103CFU/mL)為模板的LAMP擴增產物；泳道8 12分別以5株非副溶血弧菌的菌懸液(IX 103CFU/mL)為模板的LAMP擴增產物；泳道13為陰性對照。圖3為ー種熱致死細胞、活細胞的EMA-LAMP擴增示意圖。EMA-LAMP擴增在2 %瓊脂糖電泳結果。圖3A (左)泳道I為marker (DNA片段大小依次為 100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp);泳道 2 5 分別為未經過EMA處理的死菌菌懸液(I X 105、I X 104、I X IO3,1 X 102CFU/mL)為模板的LAMP擴增產物。泳道6 9分別為經EMA處理的死菌菌懸液(I X 105、I X 104、I X IO3,1 X 102CFU/mL)為模板的LAMP擴增產物。圖3B (右)泳道I為marker (DNA片段大小依次為100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp);泳道2 5分別為未經EMA處理的活菌菌懸液(I X 105、I X IO4、I X 103、I X 102CFU/mL)為模板的LAMP擴增產物。泳道6 9分別為經EMA處理的活菌菌懸液(I X 105、I X 104、I X IO3,1 X 102CFU/mL)為模板的LAMP擴增產物。
具體實施例方式實施例I :EMA_LAMP檢測試劑盒ー種副溶血弧菌EMA-LAMP檢測試劑盒，該試劑盒它包括以下成分10X反應緩沖液(200mM Tris-HCl、IOOmM KClUOmM(NH4)2SO4U. O % (質量體積比)Tritonx-100，pH8· 8)、Bst DNA 聚合酶(New England Biolabs LTD) > IOmM dNTPs (New England BiolabsLTD) UOOmM MgSO4 (New England Biolabs LTD)、去離子水、引物(引物 F3、引物 B3、引物FIP、引物 BIP、引物 Loop-F、引物 Loop-R)、1.5mg/mL EMA (Sigma 公司)，1000 X SYBR GreenI熒光染料。表I引物序列表
權利要求
1.一種副溶血弧菌LAMP檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下成分10X反應緩沖液 'Bst DNA 聚合酶；dNTPs ；MgS04 ；DNase/RNase-Free ddH20 ;引物 F3、引物 B3、引物卩1 、引物81 、引物1^0 4、引物1^0 -1 ;疊氮溴化乙錠；1000\5￥81 Green I熒光染料； 所述的 IOX 反應緩沖液配方200 mM Tris-HClUOO mM KClUO mM (NH4)2S04、I. 0% 質量體積比Tritonx-IOO ； 所述的引物 F3 :5’AGCTACTCGAAAGATGATCC 3’ ；所述的引物 B3 5' GGTTGTATGAGAAGCGATTG 3’ ；所述的引物 FIP :5’ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT 3’ ；所述的引物 BIP :5’ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 3’ ； 所述的引物 Loop-F :5’ACCAGTAGCCGTCAATG 3’ ； 所述的引物 Loop-R 5'TTAGATTTGGCGAACGAGA 3’。
2.權利要求I所述的一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測方法，其步驟是 (1)動物性水產品干制品、腌醉制生食動物性水產品、食藻類食品、魚糜制品水產食品和水產調味品及加工食品經過前增菌，即以無菌操作取25 g樣品，加入裝有225 mL 3. 5%質量體積比滅菌鹽水中，用均質器打碎，取10 mL接種于100 mL 3%質量體積比氯化鈉堿性蛋白胨水增菌培養基內，于37°C培養8h 16h ； (2)取ImL過夜培養菌液，加入疊氮溴化乙錠至終濃度為150 μ g/mL,暗處放置10-15min，隨后將整個EP管暴露在500 W鹵素燈下4_6 min，鹵素燈離樣品15 cm，整個光激發過程在冰上進行； (3)采取DNA快速提取法提取樣品中的DNA，將疊氮溴化乙錠處理過的菌液煮沸8_12min,離心，取離心后的上清液為環介導等溫擴增反應的模板DNA，提取的模板DNA適用于現場采樣檢測及實驗室檢測。
全文摘要
本發明公開了一種食品中副溶血弧菌活菌的檢測試劑盒及檢測方法，試劑盒包括10×反應緩沖液；BstDNA聚合酶；dNTPs；MgSO4；DNase/RNase-FreeddH2O；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；疊氮溴化乙錠；1000×SYBRGreenI熒光染料。檢測步驟(1)動物性水產品及其制品，經樣品前處理后接種于氯化鈉堿性蛋白胨水過夜培養；(2)取過夜培養菌液，加入疊氮溴化乙錠，暗處放置，整個光激發過程在冰上進行；(3)采取DNA快速提取法提取樣品DNA，即將疊氮溴化乙錠處理過的菌懸液煮沸，離心，取離心后上清液作為環介導等溫擴增反應的DNA模板，對其進行環介導等溫擴增反應。本發明具有快速、高效、準確性高、靈敏度高、現場應用方便，可廣泛適用于食品，衛生，出入境等檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102643919SQ20121013317
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月3日 優先權日2012年5月3日
發明者張毅 申請人:湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所