專利名稱：焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性的試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性的試劑盒及方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimi·er，s disease, AD)是一種常見的神經系統退行性疾病，是最常見的癡呆類型，發病隱匿，病情呈進行性。目前發病機制尚不清楚，可能與遺傳和環境因素有關。ApoE編碼膽固醇代謝的關鍵載脂蛋E，通過調控和加速AP蛋白代謝、以及直接通過ApoE受體調控腦部脂質代謝和突觸功能，在AD的發病中起到重要作用。根據ApoE表型提出ApoE基因模型，認為ApoE的合成是由位于一個基因位點上的三個等位基因所控制，即E2、E3和E4，每一個等位基因對應于一個主要異構體產生三種純合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子(E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交換決定了異構體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg ;E2都是Cys ;112位為Cys和158位是Arg者為ApoE3異構體。自然人群中，基因頻率e 3分布最高，ApoE3/3表型分布約70%。ApoE突變后，其與LDL-R的親和力發生改變。攜帶一個E4等位基因的個體其發展為AD的可能性高于無E4等位基因的個體約3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大約為15%，而在AD患者中的比例可達40%。ApoE4是AD的重要危險因素。通過檢測ApoE的基因型，可了解是否為AD易感人群，繼而從病因學延緩AD的發生、發展；并定期檢查，以便早診斷、早治療、最大程度的降低疾病造成的損害。綜上所述，ApoE基因多態性與AD發病顯著相關，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測ApoE基因多態性的試劑盒將為AD的預測起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術,該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容
ApoE基因多態性是與AD發病顯著相關，ApoE是AD發生的主要易感基因之一。本發明提供一種檢測AD易感基因ApoE基因多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測ApoE基因多肽性。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為
一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性的試劑盒，包括如下引物
(I)擴增引物
ApoE (rs429358)上游引物 Sr-AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C_3, (SEQ ID
NO. 3)；ApoE (rs7412)上游引物5、AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C -3^ (SEQ ID
NO. 3)；
ApoE (rs429358)下游引物:5,-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)； ApoE (rs7412)下游引物:5,- CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)； 其中，下游引物的5'進行生物素標記；
(2)測序引物
ApoE (rs429358)測序引物:5,- GAC ATG GAG GAC GTG -3, (SEQ ID NO. 5)；
ApoE (rs7412)測序引物:5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3, (S EQ ID NO. 6)； 試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。一種應用上述試劑盒檢測ApoE基因多態性的方法，包括如下步驟
(1)DNA 提取；
(2)聚合酶鏈反應
配制 50 ill PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Ou I,下游引物l.Oiil，1^&91.0111，水30.0111，模板4.0111 ;按照下面的循環參數設置擴增儀95 oC 5min預變性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 70°C 30S,進行36個循環；再在72°C保持5min，最終保持在4 °e，得擴增產物；
(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測序及結果分析。本發明的試劑盒對ApoE (rs429358) (SEQ ID NO. I)和 ApoE (rs7412)(SEQ ID NO. 2)目標序列進行分析和檢測；其中，rs429358目標序列包括野生型TGCGGCCGCCTGGTGC (SEQ ID NO. 7)和突變型 CGCGGCCGCCTGGTGC (SEQ ID NO. 8)，擴增出的片段長度為185bp ；rs7412目標序列包括野生型AGCGCCTGGCAGTGT (SEQ ID NO. 9)和突變型 AGTGCCTGGCAGTGT (SEQ ID NO. 10)，擴增出的片段長為 185bp。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒適用于對ApoE基因多態性進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上AD易感基因ApoE基因檢測。與現有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發明ApoE (rs429358) TT焦磷酸測序結果；
圖2為本發明ApoE (rs7412) CC焦磷酸測序結果。
具體實施例方式下面結合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I :
ApoE (rs429358)上游引物:5,-AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C_3, (SEQ ID NO. 3)；ApoE (rs7412)上游引物5r- AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C -3, (SEQ ID NO. 3)；ApoE (rs429358)下游引物:5,-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)；ApoE (rs7412)下游引物:5,- CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3, (SEQ ID NO. 4)；
ApoE (rs429358)測序引物:5,- GAC ATG GAG GAC GTG -3, (SEQ ID NO. 5)；
ApoE (rs7412)測序引物:5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3, (SEQ ID NO. 6)；
I. DNA提取
I. I實驗前試劑材料準備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質期以及確保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相應標識處打勾V ; (2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高壓滅菌有效期內的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。 I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應標本唯一性標識做好標記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管,振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管口棄去上清；
I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管口棄去上清；
I.20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側放風干；
I.21目測沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；
1.24保存核酸標本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應2.I在試劑準備區配制50 Ul PCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
10 <PCR buffer10_0ul
dNTP3 JDui
LOul
上游引物‘
(毎種引物加C.50)
LOul
下游引物'
(每種引物加
rTaqLOul
水30..0jil
注上游引物和下游引物各有兩種，這里的I. Oiil是指每種上游引物各加0. 5iU，以及每種下游引物各加0.5U1。2. 2在標本制備區對盛有gDNA模板短暫離心后添加4. 0 U I至擴增體系中，在PCR管壁上標記標本唯一丨丨生標識，管蓋上標記檢測項目代號。PCR管震蕩混勻,桌面離心機上短暫離心；
2.3在擴增區進行PCR擴增反應，按照下面的循環參數設置擴增儀
UIPJUiI處禪時間IWWfi
195—C丨 5mill 5
295 TI 30s I
352T30s1
4701'30s 丨for
I丨Mcyde
amiw i
372 C丨I
618.C丨 iioitiiiig 丨
__I_；_
2.4設置程序后在隨后的下拉菜單中選擇“tube”；
2.5點擊“ start ”開始儀器運行。3.焦磷酸測序單鏈樣本純化
3.I純化前試劑和儀器準備
進行樣本純化前，確保所有溶液都達到室溫；打開精密控溫加熱爐，使溫度達到80°C。3. 2單鏈樣本純化操作
3.2. I 在 PSQ 96 板中先加 40 u IAnnealing Buffer 和 2 3 U I 測序引物(IOuM)；
3.2. 2在振蕩器上充分混勻Sepharose Beads ；
3.2. 3將所需Sepharose Beads量(每樣本3 U I計算)轉移到I. 5mL Eppendorf管；3. 2. 4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer,使得平均每個樣品約有和PCR體系一樣的體積，在振蕩器上將混合物充分混勻；
3. 2. 5將Sepharose Beads混合物加至約40 U I PCR產物中，每樣本加40 U I ；
3. 2. 6常溫下、在振蕩器上將PCR板混勻10分鐘；
3. 2. 7在Vacuum prep workstation中，四個液體槽中依次加入180ml純水、120ml70% 乙醇、Denaturation Buffer 和 Washing Buffer ；
3. 2. 8倒掉與真空泵相連的廢液收集桶中的廢液；
3. 2. 9 打開 Vacuum Prep Workstation 的真空泵和閥門，將 Vacuum Prep Tool 在純水中清洗30秒；
3. 2. 10將Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取結合了生物素標記核酸的·Sepharose Beads ；
3. 2. 11拿起PCR板,檢查Beads是否都被吸附在了 Vacuum Prep Tool上；
3. 2. 12 將 Vacuum Prep Tool 放入 70% 乙醇中 5 秒；
3. 2. 13 將 Vacuum Prep Tool 移到 Denatureation Buffer 中 5 秒；
3. 2. 14 再將 Vacuum Prep Tool 移到 Washing Buffer 中清洗 10 秒；
3. 2. 15把Tool懸放在Pyro反應板；
3. 2. 16 Vacuum Prep Tool放入含有測序引物的反應板中，旋轉搖動，以釋放Sepharose Beads ；
3. 2. 17放有純化樣本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80°C加熱爐中加熱2min,取出后自然冷卻到室溫,進行下游Pyrosequencing反應。3. 3純化完畢后清洗
3. 3. I不開真空泵和閥門，使用少量純水清洗Vacuum Prep Tool,使少量未脫落的Beads洗脫下來；
3. 3. 2更換純水后再打開真空泵和閥門，用約300mL純水清洗Tool ；
3.3. 3關掉真空泵和閥門，將Vacuum Prep Tool側放,室溫晾干；
3.3. 4清洗所有盛裝試劑溶液的塑料槽，自然晾干；
3.3. 5用濕布擦拭純化設備表面。4.焦磷酸測序
4.I調入前述設定的運行程序文件，點擊“View”的下拉鍵，選擇“Run”，按照軟件自動計算本次實驗的各試劑使用量，添加各試劑成分至試劑倉；
4.2把準備好的樣本和試劑艙放入儀器相應的位置，點擊屏幕右下端的“Run”開始焦磷酸測序；
4.3檢測完成后，首先點擊軟件進程狀態窗口的“close”鍵以保存測序結果。5.焦磷酸測序結果分析
在“SNP Runs”文件夾中雙擊鼠標，打開上述運行文件，選擇“SNP mode”，點擊“AnalyzeAll”鍵，對所有檢測標本進行基因型分析；選擇“AQ mode”，點擊“Analyze All”鍵，對所有檢測標本進行等位基因頻率分析。對樣本檢測ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態性，焦磷酸檢測結果如圖f 2。可以看出，采用本發明的試劑盒及方法，能夠簡捷、直觀、準確的對ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態性進行檢測和判讀。圖I提示ApoE(rs429358)為野生型純合子，圖2提示ApoE (rs7412)為野生型純合子。臨床醫生可根據ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態性，判斷出不同基因型患者使用AD發生的風險。綜上，本發明所選取的靶序列，以及應用本發明的試劑盒能夠實現快速、簡便、準確、高效、實·用、經濟的檢測ApoE (rs429358)和ApoE (rs7412)基因多態性，能夠滿足臨床檢驗實際工作的要求，利于AD發生風險的預測。
權利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物 (1)擴增引物上游引物5 ^AGA ACT GGA GGA ACA ACT GAC C-3^ ；下游引物5'-CCC CGG CCT GGT ACA CTG-3'；其中，下游引物的5'進行生物素標記； (2)測序引物:5,-GACATG GAG GAC GTG-3,； 5,- CCG ATG ACC TGC AGA -3,。
2.一種應用權利要求I所述的試劑盒檢測ApoE基因多態性的方法，包括如下步驟 (1)DNA 提取； (2)聚合酶鏈反應 配制 50 ill PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 10. Ou I, dNTP 3. Oyl，上游引物l.Oul,下游引物 l.Oul, rTaql. OiU，水 30. OiU，模板 4. OiU ;循環程序為95 oC 5min預變性；依次在95°C 30S,52°C 30S,70°C 30S，進行36個循環;72°C保持5min，最終保持在4 °e，得擴增產物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結果分析。
全文摘要
本發明公開了一種焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性試劑盒及方法。具體是指ApoE(rs429358)和ApoE(rs7412)單核苷酸多態性。試劑盒包含如SEQ ID NO.3—6所示的引物。本發明的試劑盒，可以實現準確、快捷、高通量ApoE(rs429358)和ApoE(rs7412)的檢測，從而達到對AD發生風險的預測。
文檔編號C12Q1/68GK102676669SQ20121013538
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者周宏灝 申請人:周宏灝