專利名稱：一種耐表面活性劑的內切β-1,4-葡聚糖酶基因工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種耐表面活性劑的內切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌的構建方法，屬于基因工程和酶工程領域。
背景技術：
纖維素酶是指能降解纖維素的一類酶的總稱，主要包括三類，分別為內切β -1，4-葡聚糖酶(EC3. 2. I. 4)、纖維二糖水解酶(EC3. 2. I. 91)和β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. I. 21)。其中，內切β -1，4-葡聚糖酶是纖維素酶系中的重要組分，能隨機水解纖維 素的β-1，4-葡萄糖苷鍵，產生纖維低聚糖，廣泛用于紡織和洗滌等工業。內切β-1，4-葡聚糖酶的產生菌很多，主要有絲狀真菌、細菌等。目前研究最多的是木霉(Trichoderma)。附著在衣物表面的污垢易被傳統洗滌劑清洗，而在衣物間隙中的污垢與衣物粘黏在一起難以洗凈，反復洗滌以后，衣物便會發舊泛黃。將內切β-I，4-葡聚糖酶加入洗滌劑中，改變了傳統的去污機理，它使棉織物的纖維素結構膨松，利于洗滌劑成分進人纖維間隙與污垢充分接觸，從而大大提高了洗滌效果，并且用添加纖維素酶的洗滌劑洗過的衣物，色澤鮮艷、柔軟，對衣物損傷小。洗滌劑中通常含有大量的表面活性劑，易造成酶蛋白部分或者完全變性失活。因此要求添加到洗滌劑中的纖維素酶對表面活性劑具有一定的耐受力。Andre等從土壤中篩選到Streptomyces drozdowiczii并分離純化出其中的內切β-1,4_葡聚糖酶,研究了其在商品化洗滌劑環境中的穩定性，室溫放置一小時后酶活降低15%左右JinichiiO等從Staphylotrichum coccosporum中分離純化出內切β-1,4-葡聚糖酶STCE1,研究發現STCEl是45家族中對表面活性劑耐受力最好的內切酶。近年來，隨著洗滌工業的發展，洗滌用內切β-1，4_葡聚糖酶的需求量日益增大，因此篩選耐表面活性劑的內切β-1，4-葡聚糖酶，并且構建適合大規模發酵生產的基因工程菌顯得日趨重要。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種耐表面活性劑的內切β-1，4_葡聚糖酶基因工程菌，是以攜帶重組質粒表達耐表面活性劑的內切β_1，4-葡聚糖酶基因的大腸桿菌Ε. coli BL21(DE3)。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種構建所述基因工程菌的方法，通過克隆內切β-1，4-葡聚糖酶基因cel5A(NCBI編碼3579455)到pET_24a載體，以E. coliBL21(DE3)為表達宿主，實現了內切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的高效表達。所述重組質粒為pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種。本發明提供的重組酶在洗滌劑常用的表面活性劑中穩定性實驗，包括如下步驟重組酶中分別加入終濃度為ImM的幾種洗滌劑中常用的表面活性劑，25°C下，保溫一小時后測定殘留酶活。所述的表面活性劑為脂肪醇聚氧乙烯九醚、壬基酚聚氧乙烯醚和陰離子表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉中任一種。


圖I重組內切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A搖瓶發酵產酶曲線。圖2重組內切β-1，4_葡聚糖酶Cel5A蛋白SDS-PAGE圖。I、發酵液上清；2、破壁上清；3、包涵體；M、標準蛋白分子量。圖3重組內切β-1，4_葡聚糖酶Cel5A分批補料發酵產酶曲線。圖4重組內切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A分離純化SDS-PAGE圖。I、純化后樣品；2、發酵液;M、標準蛋白分子量。
具體實施例方式實施例I :基因工程菌的構建I、根據NCBI上登錄的cel5A的基因序列(Genbank號3579455)，以嗜熱子囊菌(Thermobifidafusca)總DNA為模板,采用聚合酶鏈式反應方法合成內切β_1,4_葡聚糖酶Cel5A的基因序列，連接到pMD18-Tsimple載體，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。經37°C培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8 IOh后提取質粒，命名為pMD18-T simple-ce15A，將此質粒進行序列測定。結果表明此基因全長1293個核苷酸，和NCBI上登錄的cel5A的基因序列完全相同。2、用于構建大腸桿菌表達載體的質粒是pET_24a，帶有T7啟動子。將pET_24a質粒和pMD18-Tsimple-cel5A分別進行Nco I和HindIII雙酶切，酶切產物割膠回收后，再用T4連接酶連接，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，經37°C培養8h，挑轉化子在含有30 μ g/mL卡那霉素的LB中振蕩培養，提取質粒，酶切驗證得到表達質粒pET-24a-cel5A。3、將重組質粒pET-24a_cel5A轉化Ε· coli BL21 (DE3)宿主菌，涂布含卡那霉素(30 μ g/mL)的LB平板上，37°C培養8h。挑單菌落至液體LB中，37 °C培養過夜，獲得基因工程菌 E. coli BL21(DE3)/pET-24a-cel5A。實施例2 :重組內切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A的搖瓶發酵將所述的基因工程菌在LB培養基中37°C液體培養過夜，后接入TB (甘油5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，K2HPO412. 54g/L，KH2P042. 31g/L)發酵液體培養基，37°C培養至OD達2. O后，用終濃度為0. 4mM異丙基硫代- β -D-半乳糖苷誘導，降溫至25°C培養48小時后，離心菌體，收集上清液測定酶活力，重組內切β -1，4-葡聚糖酶Cel5A搖瓶發酵活力達到46.78U/mL。重組內切β _1，4-葡聚糖酶Cel5A產酶曲線見圖1，SDS-PAGE電泳圖見圖2。實施例3 :重組內切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A分批補料發酵將所述的基因工程菌在工業級LB培養基中37°C培養8小時后，按10%接種量接A NBS (New Brunswick Scientif ic) 3L全自動發酵罐，發酵罐初始裝入I. IL工業級復合培養基，35°C恒溫發酵，維持溶氧在30%左右，利用氨水控制pH 7. O左右。分批階段初始培養基中甘油耗盡后，溶氧以及PH快速上升，開始指數流加補料液，控制比生長速率μ =O.2h'當菌濃0D_達到50時，以2%的流速流加乳糖進行誘導，整個發酵過程由發酵罐控制系統軟件進行在線控制和數據采集。重組內切β_1，4-葡聚糖酶Cel5A分批補料發酵產酶曲線見圖3。實施例4 :重組內切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A的分離純化將發酵液于4°C, 12000rpm離心除去菌體，向上清液中加入70% (w/v)的固體硫酸銨鹽析過夜。然后于41，12000印111離心去掉上清液，用201111磷酸緩沖液六( !1 7. O)將蛋白沉淀溶解并在緩沖液A中透析過夜。DEAE-Sepharose FF柱事先用緩沖液A平衡，上樣后，再按順序分別用緩沖液A (至少2個柱體積)、含緩沖液A和緩沖液B (含20mM磷酸鉀、IM氯化鈉)的線性梯度混合液(5個柱體積)進行洗脫。全程流速為lmL/min，紫外檢測波長為280nm，在梯度洗脫過程中收集有吸收峰的洗脫液，測定酶活并進行蛋白電泳檢測，活力組分經20mM磷酸緩沖液(pH 5. 5)透析后上樣Superdex 200柱，收集有吸收峰的洗脫液，測定酶活并進行蛋白電泳檢測。 純化過程參數見下表，蛋白SDS-PAGE電泳圖見圖4。Table I. Summary of purification of the recombinant endoglucanase Cel5A
權利要求
1.一種耐表面活性劑的內切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌是以攜帶重組質粒表達耐表面活性劑內切β -I，4-葡聚糖酶基因的大腸桿菌。
2.構建權利要求I所述基因工程菌的方法，其特征在于克隆Cel5A編碼基因(Genbank登錄號3579455)到pET_24a載體，以E. coli BL21(DE3)為表達宿主，實現了耐表面活性劑的內切β-1，4-葡聚糖酶的高效表達。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述重組質粒為pUC系列，pET系列，PT7-7，或pGEX中的任意一種。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E. coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E. coli DH5 α 中任意一種。
5.權利要求I所述基因工程菌生產的內切β-1，4-葡聚糖酶在洗滌劑常用的表面活性劑中穩定性良好。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表面活性劑為脂肪醇聚氧乙烯九醚、壬基酚聚氧乙烯醚和陰離子表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉中任一種。
全文摘要
本發明涉及一種耐表面活性劑的內切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌的構建，屬于基因工程和酶工程領域。本發明由嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)總DNA為模板經過PCR的方法獲得內切β-1，4-葡聚糖酶基因cel5A(NCBI編碼3579455)，連接表達載體，轉化E.coli宿主菌，實現了內切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的高效表達。在工業級發酵培養基中培養，經過誘導重組內切β-1，4-葡聚糖酶發酵活力達到638.51U/mL。該重組酶在洗滌劑常用的表面活性劑中穩定性良好，非常適合在洗滌工業中的應用，是洗滌劑的理想添加劑。
文檔編號C12R1/19GK102676442SQ20121013586
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者吳敬, 宿玲恰, 閆鵬安, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學