專利名稱：小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY79及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及小麥耐鹽、抗旱WRKY轉錄因子基因TaMKY79 的克隆及其應用。
背景技術：
近年來土壤鹽潰化及水資源短缺是制約農業生產的一個全球性問題。鹽害與干旱不僅嚴重影響植物的生長發育，造成作物減產，而且使生態環境日益惡化(Saibo et al.， Annals of Botany, 2009, 103 (4) :609-623)0因此，提高作物的抗旱和/或耐鹽能力已經成為現代作物育種工作急需解決的關鍵問題之一。分離克隆耐鹽基因，培育耐鹽新品種已成為全世界的研究熱點之一。小麥是重要的農作物，克隆耐鹽、抗旱基因，培育耐鹽、抗旱小麥新品種已成為當前一個十分迫切的任務。目前利用基因工程技術開展植物耐鹽、抗旱方面的研究已取得了較大的的進展。 一些實驗表明，將植物本身以及其他生物中與耐鹽相關的基因轉入植物中，可以使轉基因植物的抗鹽能力提高(Chinnusamy et al. , Crop science, 2005, 45:437-448·) 。轉錄因子在基因表達和環境脅迫響應中起著關鍵的調控作用。目前，已發現了一些能顯著提高植物耐鹽能力的轉錄因子。研究表明，將這些基因轉化到植物中，可以明顯提高植物的耐鹽能力(Nakashima K. , Plant Physiology, 2009, 149: 88 - 95·)。WRKY是一個轉錄因子家族，其成員廣泛參與植物的正常生長發育和對各種環境脅迫的響應過程。轉基因研究實驗表明過表達一些WRKY轉錄因子基因可提高轉基因植株的耐鹽和耐旱性。例過表達大 的GmWRKY54基因可使轉基因擬南介的耐鹽和耐旱性提聞 (Zhou et al. , Plant Biotechnology Journal, 2008, 6, 486-503.) 將大麥的//FfSXTJS 轉入牧草可提高轉基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al. , Molecular Breeding, 2010, 25: 419 - 432.)。AtWMY25、AtWRKY33過表達擬南芥也增加了對鹽脅迫的耐受性。 目前有關小麥WRKY轉錄因子在耐鹽方面的研究還非常有限，Niu et al研究表明過表達
和可提高轉基因擬南芥的耐鹽和耐旱性(Niu et al.，Plant cell and environment, 2012)。進一步克隆小麥耐鹽、旱相關基因，通過基因工程培育小麥耐鹽、耐旱新品種非常重要。
發明內容
本發明的目的在于，提供了一種首次從小麥中分離出一個耐鹽、抗旱的WRKY轉錄因子基因，命名為將該基因連接到過表達載體pCAMBIA super 1300上，利用農桿菌浸染法轉化擬南芥，獲得的轉基因擬南芥植株的生物量、耐鹽性、抗旱能力均比未轉基因對照植株提高。本發明的技術方案為一種小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY79，TaWRKY79基因的cDNA 序列如SEQ ID No. I所示,氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發明小麥耐鹽、抗旱基因TaWRKY79的制備方法首先根據小麥的基因芯片表達譜數據選出在小麥幼苗根中受鹽脅迫顯著上調表達的WRKY轉錄因子基因(探針)，然后根據探針序列設計基因特異性引物，進一步從小麥根的全長cDNA文庫中克隆其全長cDNA，最后構建過表達載體轉化到擬南芥中進行功能研究。I.引物設計
根據芯片探針序列設計基因特異性的下游引物Wrkyl-1:5丨-GCTGCATCCACTCTAGAATGT CG-3'，與文庫的5'端錨定引物NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’進行配對，以小麥幼苗根的全長cDNA文庫為模板擴增基因的全長cDNA。
2. PCR反應體系(50μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文庫 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至終體積50 μ I
94°C 預變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復性 lmin，72°C延伸 2min，循環 35 次；72°C 延伸5min。3. 1%瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測后發現在IOOObp處有一條目的條帶(圖I)。4.擴增片段的回收、與T載體的鏈接
對擴增條帶采用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進行。PCR產物與 pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為
回收的PCR產物7μ1
10 X Τ4連接酶緩沖液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ I) μ
T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) μ 于4 °C冰箱連接過夜。5.回收片段的克隆與測序
用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a (購自天為時代生物公司)感受態細胞，42°C水浴熱激法進行轉化。向轉化后培養Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混勻，用涂布器將其均勻涂到含有氨芐青霉素的平板上，37°C恒溫倒置培養過夜，待出現明顯單菌落時將平板拿出。根據所用pGEM-T載體克隆位點兩端的T7啟動子和SP6啟動子序列設計通用引物 T7，SP6對重組克隆進行PCR鑒定。PCR 程序94°C 預變性 IOmin ;94°C變性 lmin，58°C復性 lmin，72°C延伸 lmin，循環35次；72°C延伸5min ；
PCR擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進行測序。測序結果見 SEQ ID No. I。本發明還提供小麥耐鹽、抗旱基因在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。尤其是在普通小麥、玉米和水稻植物中的應用。
本發明的有益效果是本發明首次克隆得到了小麥WRKY轉錄因子基因TaWRKY79, 將該基因連接到過表達載體pCAMBIA super 1300上，利用農桿菌浸染法轉化擬南芥，獲得的轉基因擬南芥植株的生物量、耐鹽性、抗旱能力均比未轉基因對照植株明顯提高。
圖I 7 腸基因全長cDNA序列的擴增結果。M :DNA分子量marker。圖2不同處理條件下TaWRKY79基因在小麥山融3號幼苗根和葉中的RT-PCR表達分析。TaActin為內參；leaf :葉；root :根。圖3構建的植物表達載體pCAMBIA_superl300/TaWRKY79的酶切驗證結果。圖4轉基因擬南芥的PCR鑒定。1，2，6:不同的轉 基因擬南芥株系，Col-O野生型擬南芥。圖5轉基因擬南芥株系的表型鑒定。A、B :正常生長條件下對照和轉基因株系的表型。C :不同處理條件下植株的表型。D-H :不同處理條件下對照及轉基因株系植株根長統計結果。I :野生型擬南芥和TaWRKY79轉基因擬南芥不同株系干旱2周、復水3天后的表型。
具體實施例方式實施例I、TaWRKY79基因cDNA序列的克隆
I.引物設計
根據芯片探針序列設計基因特異性的下游引物Wrkyl-1:5丨-GCTGCATCCACTCTAGAATGT CG-3'，與文庫的5'端錨定引物NT3 :5’ -ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’進行配對，以小麥幼苗根的全長cDNA文庫為模板擴增基因的全長cDNA。2. PCR反應體系(50 μ L)及程序 2 X GC buffer I25 μ I 模板cDNA文庫 Iul dNTPs (IOmM each) I μ I Primerl (10 μ Μ) I μ I Primer2(10 μ Μ) I μ I
LA Taq (TaKaRa)O. 5ul
ddH20加至終體積50 μ I
94°C 預變性 3min ;94°C變性 45sec，58°C復性 lmin，72°C延伸 2min，循環 35 次；72°C 延伸5min。3. I %瓊脂糖凝膠電泳
PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測后發現在IOOObp處有一條目的條帶(圖I)。4.擴增片段的回收、與T載體的鏈接
對擴增條帶采用Tiangen公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進行。PCR產物與 pGEM-T (Promega)載體連接,連接體系為回收的PCR產物7μ1
10 X Τ4連接酶緩沖液 μ
pGEM-T 載體(50ng/ μ I) μ
T4DNA 連接酶(3U/ μ I) (Takara) μ 于4 °C冰箱連接過夜。5.回收片段的克隆與測序
用CaCl2法制備大腸桿菌DH5a (購自天為時代生物公司)感受態細胞，42°C水浴熱激法進行轉化。向轉化后培養Ih的菌液中加入X-gal和IPTG，混勻，用涂布器將其均勻涂到含有氨芐青霉素的平板上，37°C恒溫倒置培養過夜，待出現明顯單菌落時將平板拿出。根據所用pGEM-T載體克隆位點兩端的T7啟動子和SP6啟動子序列設計通用引物 T7，SP6對重組克隆進行PCR鑒定 。PCR 程序94°C 預變性 IOmin ;94°C變性 lmin，58°C復性 lmin，72°C延伸 lmin，循環35次；72°C延伸5min ；
PCR擴增產物用1%瓊脂糖電泳檢測，取陽性克隆的菌液送公司進行測序。測序結果見 SEQ ID No. I。實施例2、不同處理條件下TaWRKY79基因的表達分析 I.材料處理
小麥山融3號的種子室溫萌發，I周后去掉胚乳，用Hangload液體培養基繼續培養I周進行脅迫處理。鹽脅迫在Hangload液體培養基中添加NaCl至終濃度為200mM ；
滲透脅迫培養基中添加PEG至終濃度為18% ；
ABA處理培養基中添加ABA至終濃度為100 μ M ;
4°C冷處理將液體培養的小麥幼苗移至4°C光照培養箱培養；
不同條件下處理0、0. 5、3、12、24，48小時后分別取幼苗的葉片和根系，提取各種材料的總RNA。2.小麥總RNA提取
Trizol法提取RNA。PMgrose凝膠電泳檢測提取的RNA質量，紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度。3.第一鏈cDNA的合成
采用PrimeScript RT-PCR KU，反應步驟按操作手冊進行。4. RT-PCR反應及電泳
1.以cDNA為模板，進行PCR反應。引物如下 TaAct-S: 5' - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3/
TaAct-A: 5' - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3/
WRKYrt-I: 5' -AAGGCTCTGGCGGCAGGAAG-3,
WRKYrt-2: 5' -GCTGCATCCACTCTAGAATGTCG-3'
2.PCR體系
ddH204. 7 μ I
IOX buffer2 μ IPrimerl (2 μ Μ)I μ I
Primer2 (2 μ Μ)I μ I
dNTP (IOmM each)O. 2 μ I
rTaq polymerase (5U/μ I) O. I μ I 逆轉錄cDNA模板I μ I
Total Volume10 μ I 3.PCR程序
94°C 5min ;根據基因表達量不同設置 25 30 cycles, 94°C 20s, 57 °C 60s, 72 °C 45s ；72°C 5min。4. I %瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖2。實施例3、TaWRKY79過表達植物表達載體的構建
植物表達載體pCAMBIA-superl300是含有35S啟動子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位點上含有限制性內切酶油al位點。根據基因TaWRKY79的cDNA序列，設計包含完整 ORF 的基因特異性引物 Wrkyo5: 5' -GCTCTAGAATGGACGAGCAGTGGATGATC-3' (XbaI) 和 Wrkyo3:5' -GCTCTAGACGCTCGCTTGATCAACTATCG-3' (XbaI)。用該對弓 I物擴增 TaWRKY79 的cDNA序列。然后用限制性內切酶油<31酶切載體pCAMBIA-Superl300和擴增的目的基因 TaWRKY79序列。完全酶切的載體和目的基因經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，連結，轉化大腸桿菌DH5ci，PCR檢測陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，酶切驗證插入方向的正確性，構建獲得植物表達載體pCAMBIA-superl300/TaWRKY79。步驟如下
(I)質粒pCAMBIA-superl300空載體和目的基因片斷油al單酶切酶切體系如下
Xbal2 μ I
pCAMBIA-super 1300 載體 (或目的基因片段)10 μ I
IOXBuffer M2 μ I
ddH20 To40 μ I
于37°C恒溫水浴鍋酶切3小時以上。(2)酶切產物的電泳與回收
酶切完成后，以I X TAE為電泳緩沖液，將酶切產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下經酶切的pCAMBIA-SUper1300載體大片段和目的基因片段，瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。(3)連接
經酶切的pCAMBIA-SUper1300載體片段和目的基因片段以摩爾比1:4的比例進行4°C 連接過夜。(4)轉化
連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，轉化菌在含Kan 50 μ g/ml的LB固體平板上37°C培養16小時左右。(5)重組子的鑒定
PCR檢測陽性克隆，提取質粒，選擇基因內的BamHI單酶切位點和載體上的BamHI酶切位點對質粒進行單酶切鑒定目標片段插入方向。酶切產物經I %的瓊脂糖凝膠電泳后，根據切下的目的條帶的大小判斷目的基因插入載體中的方向，選取正向插入克隆的質粒，完成載體構建(圖3)。將構建好的載體pCAMBIA-superl300/TaWRKY79轉化農桿菌菌株GV3101， 轉化擬南芥進行基因功能分析。實施例4、基因的功能分析一擬南芥轉化、篩選及表型分析 (O擬南芥的種植
將野生型擬南芥種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無菌水漂洗5-6次，點播于MS平板上，于4° C春化2_3天。 然后移植到營養缽中 (營養土與蛭石按等比例混合)，23° C培養,16/8 h光周期,光強 30-40 μ mol*m-2 · s_l ;待植株開花后,到去其主枝頂端,促進側枝發展。在到枝后的4_6 天內，進行農桿菌轉化。(2)擬南芥轉化
把200 ml菌液倒入淺盤中。將修剪好的擬南芥倒扣并使所有花序浸入懸浮菌液中，輕輕攪動沾花30 sec-1 min0取出花盆側放于托盤中，用保鮮袋包裹以保濕。將托盤置暗處培養24 ho然后取出營養缽并直立放置，恢復光照，繼續培養植株至成熟。(3)陽性植株的篩選T0代種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和 O. 01% Triton-XlOO)消毒后，點播在MS選擇培養板(30 mg/L潮霉素)上。于4°C下春化 2-3天。移入培養室中培養。大約10天左右，挑選潮霉素抗性植株(長出真葉1-2對，根伸長至培養基中)并移栽到營養缽中。培養直至種子成熟。同樣方法篩選Tl代種子得到T2 代植株。并在T2代植物中挑選抗性比為3:1的單拷貝插入獨立株系，并獲得純合T3代株系進行轉基因擬南芥的分子檢測和表型鑒定。(4)轉基因擬南芥的PCR鑒定擬南介基因組DNA的提取
CTAB法提取野生型和轉基因擬南芥株系的基因組DNA。擴增
以上面提取的擬南芥基因組DNA為模板，用基因特異性引物Wrkyo5，Wrkyo3 (序列同實施例3)進行PCR擴增。PCR體系及程序同實施例I。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后檢測到在轉基因擬南芥植株中擴增出一條IOOObp左右的目的條帶，在未轉基因對照植株中未見擴增條帶 (圖 4)。(5)轉基因擬南芥的表型鑒定 ①擬南芥的種植
T3代單拷貝純合擬南芥株系的種子用7. 5%次氯酸鈉溶液(包括7. 5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無菌水漂洗5-6次，點播于MS平板上，于4° C春化 2-3天，然后移植到營養缽中(營養土與蛭石按等比例混合)，23° C培養，16/8 h光周期， 光強 30-40 μ mol*m-2 · s_l。②脅迫處理
將萌發5天的擬南芥幼苗(對照及轉基因株系)小心移栽到營養土中，或轉移到分別含有 IOOmM NaClUOOmM甘露醇、IOmM LiCl、2yM ΑΒΑ、O. 75 μ M NAA和對照MS培養基平板上，豎直培養一周觀察表型。結果表明正常培養條件下轉基因擬南芥比未轉基因對照具有較好的生長勢，生物量增加(圖5A，B)。在不同處理條件下，轉基因的擬南芥植株的根系明顯長于未轉基因對照株系(圖5C-H)。干旱處理將萌發一周的擬南芥幼苗(對照及轉基因株系)移載至培養土中，培養I 周后開始控水(不澆水)干旱處理。干旱處理2周后觀察表型。結果表明干旱處理2周后，未轉基因的對照擬南芥植株開始萎蔫，而轉化外源基因的擬南芥植株長勢旺盛 (圖 5 I)。復水處理3天后再次觀察表型，發現轉化基因的擬南芥植株長勢良好，抽薹開花，生長明顯好于未轉基因對照植株(圖5 I)。
權利要求
1.一種小麥耐鹽、抗旱基因TamKY79，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No. I 所示。
2.如權利要求I所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因其特征在于所述轉錄因子基因編碼的蛋白質，其氣基酸序列為SEQ ID No. 2所不。
3.如權利要求I所述一種小麥耐鹽、抗旱基因在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。
4.如權利要求3所述的一種小麥耐鹽、抗旱基因TaMKY79的應用，其特征在于所述植物是普通小麥、玉米和水稻。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，涉及小麥耐鹽、抗旱WRKY轉錄因子基因TaWRKY79的克隆及其應用。本發明公開了一種小麥耐鹽、抗旱WRKY轉錄因子基因TaWRKY79及其在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。實驗證明，本發明所述轉基因植株的耐鹽、抗旱能力明顯提高。本發明的基因在培育耐鹽、抗旱植物(特別是作物)中具有重要作用。
文檔編號C12N15/29GK102703465SQ201210135540
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者秦余香 申請人:濟南大學