專利名稱：斜帶石斑魚補體c3基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種rC3B蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應用；還涉及一種補體C3蛋白及編碼該蛋白的基因、含有該基因的載體及其應用。
背景技術：
補體第三組分(C3)是補體系統(tǒng)的核心，它是1912年Ritg用蛇毒處理血清時發(fā)現(xiàn)的。在補體各成分中，補體C3的血清含量最高。補體C3蛋白具有特殊的結構，是一種β 2糖蛋白，由α、β兩條肽鏈組成，兩肽鏈間以二硫鍵相連，分子量為195KDa，其中α鏈為115KDa，由998個氨基酸殘基組成，N末端和C末端均為絲氨酸；β鏈為75KDa，由669個氨基酸組成，N末端為絲氨酸，C末端為丙氨酸。兩鏈間氫鍵、疏水鍵及二硫鍵相互連接，其 中二硫鍵散在于α鏈的92-93位氨基酸及β鏈的11-656位氨基酸之間。C3的激活與滅活酶的作用部位主要在α鏈，β鏈則與穩(wěn)定必要的分子構象有關。在α鏈的半胱氨酸和谷氨酸殘基之間有一個分子內硫酯鍵，此鍵不穩(wěn)定，尤其是對蛋白質和碳水化合物中的親核基團敏感，如羥基(一 0Η)和氨基(一順2)。C3當被C3轉化酶裂解為C3a和C3b時，C3b分子內硫酯鍵變得更加不穩(wěn)定，可被附近的羥基或氨基激活，斷裂為酰基和巰基。酰基具有較強的親電性，可與相應膜表面的親核基團形成酯鍵或酰氨鍵，由此C3b結合于相應的膜表面，此結合部位為C3b的不穩(wěn)定結合部位，借此部位，C3b除可結合于細胞膜表面外，還可結合于相應的免疫復合物、脂多糖、酵母多糖及多糖等。在功能上，C3亦居于中心地位，它既是3條激活途徑的交匯，又是C3b依賴性陽性反饋環(huán)路的基礎；同時C3裂解片段及其結合蛋白復雜而多樣。C3分子上存在著眾多與其他分子的結合位點，C3通過其上的系列受體位點與補體其它成分、病原體、血細胞等發(fā)生廣泛的作用，從而在機體的免疫防御和免疫病理中發(fā)揮重要作用。rC3B是C3上與單核細胞、巨噬細胞表面補體受體的結合位點，也就是補體III型受體(CR3，⑶Ilb /⑶18 )結合位。C3裂解片段通過該結合位點與大量存在于單核細胞、中性粒細胞等上的C R 3結合，從而促進機體對血液中病原體的吞噬和清除，提高魚類抗病性，增強魚類自身的免疫力。石斑魚類隸屬S盧形目iPerciformes),鯧科{Serranidae),石斑魚亞科(Bpinephelinae),石斑魚屬(Bpinephelus),為暖水性礁棲魚類,廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域。石斑魚是馳名世界的名貴海產魚類之一，其肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，為餐桌中的上等佳肴，被港澳地區(qū)推為我國的四大名魚之一，深受各地消費者的喜愛，經濟價值巨大。但是，當前氣候災害和環(huán)境污染導致的高致病率和高死亡率，一直是石斑魚人工養(yǎng)殖過程中難以解決的問題。市場上還沒有一種能夠有效增強石斑魚免疫力的飼料添加劑。酵母是最簡單的真核生物，以其作為宿主表達外源蛋白有很大的優(yōu)勢生長繁殖快，易培養(yǎng)，操作簡單；能對表達的外源蛋白進行翻譯后加工修飾，如糖基化、乙酰化等；安全性高，無致病性。巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為代謝的唯一碳源和能源。畢赤酵母表達系統(tǒng)有很多優(yōu)點在科研及生產中廣泛應用使用強的可誘導啟動子-AOXl基因啟動子；外源基因以單拷貝或多拷貝定點整合入基因組中，遺傳穩(wěn)定性好；重組蛋白以高水平分泌到幾乎無蛋白的培養(yǎng)基中，利用表達蛋白的純化；容易進行高密度發(fā)酵，適合于產業(yè)化生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目 的在于提供一種石斑魚rC3B蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚rC3B蛋白的基因。本發(fā)明的另一目的在于提供一種石斑魚rC3B蛋白的前體蛋白，即石斑魚補體C3蛋白。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述石斑魚補體C3蛋白的基因。本發(fā)明的另一目的在于提供含有石斑魚補體C3蛋白基因及功能片段rC3B的克隆載體。本發(fā)明的另一目的在于提供含有石斑魚補體C3蛋白基因及功能片段rC3B的表達載體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種石斑魚補體C3功能片段rC3B重組蛋白及其制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供石斑魚rC3B蛋白和/或C3蛋白在制備提高魚類免疫力制劑中的應用。本發(fā)明所采取的技術方案是
石斑魚rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,或者是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。編碼上述石斑魚rC3B蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。石斑魚補體C3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，或者是SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。編碼上述石斑魚補體C3蛋白的基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO : I所示。生產石斑魚rC3B蛋白或石斑魚補體C3蛋白的方法，包括將上述表達載體導入宿主細胞中，表達得到rC3B蛋白或C3蛋白。本發(fā)明的有益效果如下
1.本發(fā)明首次獲得了石斑魚的補體C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不僅豐富了石斑魚的基因庫，而且可應用于制備重組蛋白、魚類免疫制劑或飼料添加劑，為石斑魚的生理免疫研究提供了新的理論與實踐基礎；
2.將石斑魚rC3B核苷酸序列在畢赤酵母重組株表達，可以大量生產石斑魚rC3B重組蛋白，大大降低了生產成本，具有很高的經濟價值；
3.本發(fā)明所提供的石斑魚rC3B重組蛋白，經實驗證明具有提高石斑魚免疫力等功能，可以應用于制備魚類尤其是石斑魚免疫制劑或飼料添加劑，具有廣闊的應用前景。


圖I是斜帶石斑魚補體C3基因5’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析圖；圖2是斜帶石斑魚補體C3基因3’端片段合成的第二次PCR凝膠電泳分析 圖3是C3基因ORF的PCR擴增產物的電泳鑒定圖。圖4是斜帶石斑魚補體C3功能片段rC3B的PCR擴增產物的凝膠電泳分析 圖5是克隆載體pMD18-T-rC3B雙酶切(McoRI ,XbaI)驗證 圖6是表達載體pPICZaA-rC3B雙酶切(McoRUXbaD驗證 圖7是重組株pPICZaA-rC3B-X-33表達產物rC3B重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖； 圖8是重組株pPICZaA-rC3B-X-33表達產物rC3B重組蛋白的western_blot鑒定圖； 圖9是pPICZaA-rC3B畢赤酵母表達載體構建示意 圖10是石斑魚rC3B的氨基酸序列和人類rC3B氨基酸序列的對比圖；
圖11是rC3B抗原表位預測分析；
圖12是重組株pPICZaA-rC3B-X-33高密度發(fā)酵產物rC3B重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖(M :蛋白分子量標準；1 pPICZaA- rC3B -X-33發(fā)酵產物；NC :陰性對照pPICZ α Α-33發(fā)酵產物);
圖13是在低溫應激中的，Α，B, C三組魚血細胞數(shù)目隨應激時間的變化情況(*表示與對照組相比有顯著性差異，P <0.0 = 5)；
圖14是在低溫應激中A、B、C三組魚血細胞呼吸爆發(fā)水平隨應激時間的變化情況(*表示與對照組相比有顯著性差異，P < O. 05);
圖15是在低溫應激中A、B、C三組魚血細胞凋亡情況隨應激時間的變化情況(*表示與對照組相比有顯著性差異，P < O. 05)。
具體實施例方式通過抑制性消減雜交技術獲得斜帶石斑魚補體C3基因中間片段
通過抑制性消減雜交技術(SSH)構建了石斑魚低溫文庫，測序得到一些功能基因，其中包含與石斑魚補體C3高度同源的片段。該補體C3基因中間片段長度為396bp (SEQ IDNO. 5)。斜帶石斑魚補體C3基因5’端片段的合成
操作按照 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech,CA, USA) Protocol來進行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已測序的補體C3中間片段的序列設計了兩條下游引物C351和C352以進行嵌套PCR。第一條下游引物C351為5’ - CTTTCGGCCTTGGCGGGTTTG(SEQ ID NO. 6)，第二條下游引物 C352 為5’ -ACGGAAACAACACGTCCTCTACG(SEQ ID NO. 7)。第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經降落PCR方法擴增原補體C3中間片段的序列第298位至5’端的核苷酸序列，反應條件為94°C預變性5分鐘；(I) 94°C變性30秒，72 0C退火30秒，共5循環(huán)，72 °C延伸2分鐘；(2 )94 V變性30秒，70 V退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第二次PCR以第一次PCR產物為模板，經PCR方法擴增原補體C3中間片段的序列第150位至5’端的核苷酸序列，反應條件為94°C預變性5分鐘；(I) 94°C變性30秒，72°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；(2) 94°C變性30秒，70°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第一次PCR在瓊脂糖凝膠上未能檢測出條帶，第二次PCR擴增產物的電泳鑒定圖見圖1，其中M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產物。將1804bp的擴增產物連接到pMD18-T載體上得到重組質粒pMD18-T-C3-5’-1804。將重組質粒pMD18-T-C3-5’-1804用pMD18_T的一對通用引物進行序列測定，其序列如SEQID NO. 14所示。測序結果與Genebank的序列進行比較,結果表明克隆的1804bp產物是斜帶石斑魚補體C3基因5’端基因。斜帶石斑魚補體C3基因3’端片段的合成
操作按 BD SMART RACE cDNA Ampli cation Kit (BD Bioscience Clontech,CA, USA) Protocol來進行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已測序的補體C3中間片 段的序列設計了兩條上游引物C331和C332以進行嵌套PCR。第一條上游引物C331 為5’ -GTGGAAATCAGCGTACGGCAGA(SEQ ID NO. 8)，第二條上游引物 C332 為5’ -ACCCGCTCAAGCGTCCGAAAG(SEQ ID NO. 9)。第一次PCR以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，引物為C331，經PCR方法擴增補體C3中間片段的序列第120位至3’poly A端的核苷酸序列，反應條件為94°C預變性5分鐘；(1)94°C變性30秒，72°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；(2)94°C變性30秒，70°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第二次PCR以第一次PCR產物為模板，經PCR方法擴增，反應條件為94°C預變性5分鐘；(I) 94°C變性30秒，72°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；(2) 94°C變性30秒，70°C退火30秒，共5循環(huán)，72°C延伸2分鐘；最后94°C變性30秒68°C退火30秒，共30循環(huán)，72°C延伸2分鐘。第一次PCR在瓊脂糖凝膠上未能檢測出條帶，第二次PCR擴增產物的電泳鑒定圖見圖2，其中M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產物。將3332bp的擴增產物連接到pMD18-T載體上得到重組質粒pMD18-T-C3-3’-3210。將重組質粒pMD18-T-C3-3’-3332用pMD18_T的一對通用引物進行序列測定，其序列如SEQID NO. 15所示。測序結果與Genebank的序列進行比較，結果表明克隆的3332bp產物是斜帶石斑魚補體C3的3’端基因。斜帶石斑魚補體C3基因全長序列的拼接
將已經測序的補體C3中間片段、5’RACE片段和3’RACE片段進行拼接，得到斜帶石斑魚補體C3基因的ORF全長，即補石斑魚補體C3 cDNA全序列(SEQ ID NO. I)的第I一4974bp,總長為4974bp，并推測出其氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)。根據(jù)拼接得到的C3基因ORF全長設計引物C3qF5’-CTTCAGGGTTTAGGACGATGTG(SEQ ID NO. 10)，C3qA5’ -CCAGTGGGTCTTCTGGTGAGTG(SEQ ID NO. 11)。擴增的長度為5120bpo 以 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經PCR方法擴增石斑魚的補體C3功能片段rC3B序列，PCR反應條件為94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸5分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產物的電泳鑒定圖見圖3，其中M為分子量標準；NC為陰性對照；1為PCR擴增產物。PCR產物送去華大基因公司測序，測序結果和拼接結果一致。
生物信息學方法分析斜帶石斑魚活性區(qū)段C3補體受體III結合區(qū)rC3B序列 經文獻調研，得到了人類補體C3功能片段的序列。使用clustalx和GeneDoc兩個序
列分析軟件，將石斑魚補體C3基因氨基酸序列和人類補體C3氨基酸序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)人類的補體C3功能片段rC3B序列和石斑魚的補體C3功能片段rC3B同源性較高(圖10)。另外。通過DNAstar軟件分析了石斑魚的補體C3基因的抗原表位(圖11)。進一步的確定了包含最多結合位點的活性區(qū)段石斑魚C3補體受體III結合區(qū)rC3B(C3蛋的1331—1430 AA)。最后,使用RNAstructure 4. 6軟件分析了該功能片段的RNA 二級機構,發(fā)現(xiàn)沒有復雜的二級結構。斜帶石斑魚功能片段rC3B序列基因的合成
根據(jù)分析好的斜帶石斑魚功能片段rC3B的cDNA序列(SEQ ID NO. 3)，設計合成兩段引物，上游引物是在該片段第I位堿基起的19個堿基前加上現(xiàn)的限制酶切位點以及保護堿基5’- CCGGAATTCATGGAAGCAACGGTGAAAA(SEQ ID NO. 12)，共 28bp ;下游引物是在該 片段第284位堿基起的前17個堿基加上油a/的限制酶切位點、保護堿基、6Xhis終止密碼子 5’ -TGCAGATCTTTAATGATTGAGATAGATGATGTCTTTCTGACAGGACTG-3’ (SEQ ID NO. 13)，共48bp。以 M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反轉錄得到的斜帶石斑魚肝臟cDNA為模板，經PCR方法擴增石斑魚的補體C3功能片段rC3B序列，PCR反應條件為94°C預變性3分鐘；下邊為40個循環(huán)94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30分鐘；最后72°C延伸10分鐘。PCR擴增產物的電泳鑒定圖見圖4，其中M: marker,NC為陰性對照，I : PCR擴增產物。從圖4可見PCR擴增了一段長約350bp的序列。含斜帶石斑魚功能片段rC3B序列的克隆載體
將實施例6所獲得目的基因片段分離純化，然后與pMDlS-T (TAKARA)載體按照該試劑盒提供的體系4°C連接過夜(約16h)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，經Amp+抗性和藍白斑篩選出陽性克隆，通過質粒提取試劑盒提取質粒，質粒經過雙酶切驗證以及測序驗證，證明斜帶石斑魚功能片段rC3B序列克隆到載體中，命名為pMD18-T-rC3B，克隆載體轉化大腸桿菌DH5 α所得到的重組菌株命名為pMD18-T-rC3B_DH5 α。使用EcoRI、XbaI對克隆載體pMD18-T-rC3B進行雙酶切，酶切圖譜見圖5，其中M: marker, NC為pMD18_T_rC3B，I pMD18-T-rC3B 的及、XbaI 雙酶切產物。含斜帶石斑魚功能片段rC3B序列的表達載體pPICZaA- rC3B的構建
克隆載體pMD18-T-rC3B用限制性內切酶EcoRI和XbaI雙酶切后，酶切產物用
E.Z. N. A. Gel Extraction Kit回收,進行瓊脂糖凝膠電泳,分離純化約350bp的斜帶石斑魚功能片段rC3B序列；
載體質粒pPICZaA經限制性內切酶及和油a/雙酶切后分離純化3. 6kb的大片段，與約350bp的斜帶石斑魚功能片段rC3B的基因片段按1:3混合，用T4連接酶16°C連接16小時后用標準氯化鈣轉化法轉入大腸桿菌DH5a中，用低鹽LB平板篩選具Zeocin抗性的轉化子，以標準方法提取質粒，篩選大小約4. O kb的重組質粒，用限制性內切酶及和油a/雙酶切重組質粒，得到約350bp和3. 6kb的兩個片段，大小分別與斜帶石斑魚功能片段rC3B的基因片段和表達載體pPICZaA大小相同，證明斜帶石斑魚功能片段rC3B的基因片段已克隆入畢赤酵母表達載體PPICZaA中，重組質粒命名為pPICZaA-rC3B。質粒構建流程圖見圖9。使用EcoRI、XbaI對表達載體PPICZaA_rC3B進行雙酶切，酶切分析圖見圖6，其中M:marker, NC為pPICZ a A雙酶切產物，I pPICZaA-rC3B雙酶切產物。能高效表達斜帶石斑魚功能片段rC3B蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- rC3B-X-33構建
按照 Invitrogen 公司的 The Easyselect Pichia Expression Kit 說明書制備畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，重組質粒pPICZaA- rC3B用fee/線形化后凝膠回收，用標準方法電擊轉化畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，在含Zeocin 400 μ g/ml的YPDS平板上28°C進行培養(yǎng)。約3d后長出單克隆，挑取單克隆經誘導培養(yǎng)與鑒定篩選出能高效表達斜帶石斑魚功能片段rC3B重組蛋白的畢赤酵母重組株pPICZaA- rC3B _X_33。利用畢赤酵母基因工程菌pPICZaA- rC3B _X_33生產重組斜帶石斑魚功能片段rC3B蛋白
分別挑取各種工程菌的單克隆，接種于BMGY中，28°C，200rpm培養(yǎng)0D600至2_6，換培養(yǎng)基BMMY稀釋0D600至I. 0，每24h向培養(yǎng)基中補加O. 5%甲醇，培養(yǎng)48h_72h后2000rpm， 4°C收集上清。取Iml上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5X電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標準方法跑TriCine-SDS-PAGE凝膠電泳，同時取陰性對照按同樣方法處理后電泳。陰性對照為空載質粒PPICZaA轉化X-33后長出的單克隆培養(yǎng)后的上清蛋白。結果見圖7，其中:M :蛋白分子量標準；1、2、3、4、5、6、7、8 :重組株pPICZaA- rC3B -X-33表達產物；NC為陰性對照，顯示pPICZaA- rC3B _X_33在12Kd和17Kd之間出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，而陰性對照不出現(xiàn)此帶。從圖中看出，第四個菌株的表達量最高。石斑魚rC3B蛋白抗原活性鑒定實驗
將重組斜帶石斑魚功能片段rC3B蛋白采用免疫印跡(Western blot)方法進行免疫活性鑒定。一抗為鼠源his單克隆抗體(Novagen), 二抗為羊抗鼠IgG-HRP(鼎國公司)。結果見圖8，其中:M :蛋白分子量標準；1、2、3、4、5、6、7、8 :重組株pPICZaA- rC3B -X-33表達產物Western blot鑒定圖譜；NC為陰性對照，顯示鼠源his單克隆抗體能識別我們用畢赤酵母表達的重組斜帶石斑魚功能片段rC3B蛋白，證明得到的蛋白是重組斜帶石斑魚功能片段rC3B蛋白。動物實驗
一、畢赤酵母基因工程菌PPICZaA- rC3B _X_33的高密度發(fā)酵
發(fā)酵過程參照 invitrogen 公司的 Pichia Fermentation Process Guidelines,具體步驟如下
I.分別挑取篩選好的單克隆菌株pPICZ a A-rC3B-X-33與pPICZ α Α_33，pPICZ α Α-33菌株作為空載對照。加入200ml MGY液體培養(yǎng)基到IL的錐形瓶中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至 0D600=2-6 (約 16-24hours)。2. 組裝好發(fā)酵罐，加入3L含有4%甘油的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(配方見PichiaFermentation Process Guidelines),然后121°C,15min滅菌，待冷卻后，用流加瓶加入氨水，調pH到5。3.在火焰圈保護下，將步驟I中搖好的菌種接種于自動控制發(fā)酵罐中。調節(jié)通氣量，灌壓，轉速來維持溶氧高于20%。設定發(fā)酵溫度為29°C，自動流加氨水控制pH 5±0.05。4.當發(fā)酵罐中的甘油耗盡后(約接種后20個小時)，用流加瓶流加每升含12mlPTMl (配方見 Pichia Fermentation Process Guideline),設置流加速度為 54.45ml/h，直到細胞濕重為200 g/liter結束(流加大約4個小時)。5.甘油消耗盡后，開始添加每升含12mlPTMl的甲醇，設定流加速度為10.8 ml/h，兩個小時，設定流加速度為21.9 ml/h，兩個小時后，設定流加速度為32.7 ml/h，保持這個速度直到發(fā)酵結束。這個階段需要60個小時，總共添加約I. 2L的甲醇。此時的細胞濕重約為 290 g/liter ο6.分別取pPICZ a A-rC3B_X_33與pPICZ α Α-33發(fā)酵的菌液各Iml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法濃縮后，加5Χ電泳上樣緩沖液，煮沸10分鐘后按標準方法跑Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳，pPICZ α Α-33發(fā)酵的菌液做為陰性對照組，結果見圖12。顯示pPICZaA- rC3B _X_33在12Kd和17Kd之間出現(xiàn)一條新的蛋白條帶，而陰性對照不出現(xiàn)此帶。結果說明，pPICZaA- rC3B _X_33菌種發(fā)酵產生了高濃度的重組蛋白。7.把發(fā)酵液用噴霧干燥器處理，得到粉末，pPICZaA- rC3B -X-33菌種的發(fā)酵液粉末做為飼料添加劑，PPICZ αΑ-33菌種的發(fā)酵液粉末做為對照，用于下面的飼養(yǎng)實驗。二、飼養(yǎng)實驗 I實驗條件
選取同一批次、體質健康、規(guī)格相近的斜帶石斑魚放養(yǎng)在養(yǎng)殖桶中。水溫25 30°C,水體鹽度28 32%。，pH值8. I 8. 3，溶解氧值大于5. O mg/L,并且水體持續(xù)循環(huán)。2飼料配置
飼料共分為3種，A為商品料，B為商品料+ lwt% pPICZ α Α-33菌種的發(fā)酵液粉末，C為商品料+ lwt%pPICZaA- rC3B _X_33菌種的發(fā)酵液粉末。分別將各組粉料攪拌均勻，每天投喂前準確稱量，用水稀釋后制備成濕顆粒飼料投喂。 3實驗魚飼養(yǎng)
本試驗設3個實驗組，每組30條魚。分別投喂A、B、C組飼料。試驗魚平均體重O. 95±0. Olg，長度為3±0. 5cm。養(yǎng)殖水不斷充氣，水溫29土 2°C，水體pH值8. 1-8. 3，鹽度28 32%。。上午和下午按照魚體重的8%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及時清理殘餌，觀察記錄，飼養(yǎng)時間7周。實驗前禁食一天。4應激實驗 4. I實驗設計
取用飼喂的斜帶石斑魚做溫度應激實驗，應激溫度為14土 0.5°C。實驗準備I.OmXO. 5 mX 0.5 m的儲物箱3個，在每個儲物箱先裝滿40L的海水，并將裝有海水的儲物箱置于氣候箱中并放入水溫計來測定水溫，待水溫穩(wěn)定在14±0. 5°C，然后每個儲物箱分別放A，B，C三組魚各30條魚，將做低溫應激實驗的儲物箱置于氣候箱中并放入水溫計來測定水溫。應激12小時，分別在O小時、3小時、6小時、12小時取樣，每組取6尾。4. 2血細胞計數(shù)及滲透壓的測定
用I mL—次性無菌注射器臀鰭下方尾靜脈或尾動脈抽血，取完血后，拔下針頭，將血液注入玻璃采血管中，4°C下靜置，取血清。血細胞計數(shù)板的計數(shù)血細胞方法按照WHO手冊進行計數(shù)，分別計數(shù)血細胞3次，取3次結果的平均值為計數(shù)結果。4. 2. I血細胞計數(shù)的測定原理
血細胞的計數(shù)一般使用血球計數(shù)板。每塊計數(shù)板由H形凹槽分為2個同樣的計數(shù)池，計數(shù)池高O. 1mm。計數(shù)池分為9個大方格，每個大格面積為I. Omm.容積為O. Imm3 ( μ I),其中，中央大方格分成25個中方格，位于正中及四角5個中方格是紅細胞計數(shù)區(qū)域。四角的4個大方格是白細胞計數(shù)區(qū)域。在計數(shù)血細胞時，要計算位于中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數(shù)目，再根據(jù)公式細胞數(shù)/ml=五個中方格內的細胞個數(shù)/5X25X 10000X 稀釋倍數(shù)。4. 2. 2血細胞計數(shù)的測定方法
視待測血細胞的濃度，加抗凝劑適當稀釋(一般稀釋100倍)，然后取潔凈的血球計數(shù)板一塊，并在計數(shù)區(qū)內蓋上一塊蓋玻片。將血細胞輕輕吹打混勻，用移液槍吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產生。靜置片刻后，把血球計數(shù)板放在顯微鏡的載物臺上然后觀察并計數(shù)中央的大方格中，其正中及四角5個中方格的總細胞數(shù)目。在計數(shù)時，要遵循原則數(shù)上 線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線。測數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈。每個血樣分別計數(shù)血細胞3次，取3次結果的平均值為計數(shù)結果。結果顯示應激過程中，在14±0. 5°C應激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的魚血細胞數(shù)目并沒有明顯差異，C組略高。應激3小時后，A，B，C三組的血細胞數(shù)目均有下降，但是C組的血細胞數(shù)目高于A、B組,并且差異顯著。應激6小時后，A, B, C三組的血細胞數(shù)目進一步下降，但是C組的血細胞數(shù)目下降較A、B組少，數(shù)目明顯高于A、B組，并且差異顯著。應激12小時后，A，B，C三組的血細胞數(shù)目均有上升，C組的血細胞數(shù)目略高于A，B組，沒有明顯差異(見圖13)。4.3呼吸爆發(fā)的測定
4.3. I細胞呼吸爆發(fā)的測定原理
活性氧(Reactive oxygen species, R0S)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。2, 7-二氯氫化突光素二脂(2，7-dichlorof luorescein diacetate, DCFH-DA)是迄今為止最常用、最靈敏的細胞內活性氧檢探針。本身沒有熒光的DCFH-DA可穿過細胞膜進入細胞，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質DCF，綠色熒光強度與細胞內活性氧水平成正比。在激發(fā)波長502nm，發(fā)射波長530nm附近，使用流式細胞儀的FLl通道檢測DCF熒光，從而測定細胞內活性氧水平。4. 3. 2血細胞呼吸爆發(fā)的測定方法
取200 μ I的血細胞懸液，加入200 μ I PBS緩沖液(MAS抗凝劑進行稀釋)，混勻，調整細胞的濃度為I X IO6個/ml左右，使用熒光染料2，7- 二氯氫化熒光素二脂(DCFH-DA)(終濃度10 μ Μ) 25°C下避光染色30min。然后使用200目的篩網(wǎng)過濾將細胞懸液轉移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測，并用Cellquest軟件分析DCF平均熒光強度的變化。結果顯示A，B, C三組魚受到低溫14±0. 5°C應激后，應激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的魚血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))并沒有明顯差異。隨著應激時間的延長，血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))水平不斷升高，A，B組血細胞的活性氧含量上升明顯比C組多，在6小時達到最大值，并且A，B組的活性氧含量明顯高于C組。應激12小時后，A，B, C三組的血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))均有下降，但是C組的血細胞的活性氧(呼吸爆發(fā))明顯低于A，B組(見圖14)。
細胞凋亡測定
4. 4. I血細胞凋亡的測定原理
細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液 用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。血淋巴細胞凋亡的測定原理在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由膜脂內側翻向外側。Annexin V是一種依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。用標記了 FITC的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。碘化丙唳(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠細胞膜與細胞核結合呈現(xiàn)紅色。將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。在雙參數(shù)流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FIT C— / PI—)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC + / PI +);而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)(FIT C + / PI —)。4. 4. 2血淋巴細胞凋亡的測定方法
使用Annexin V/PI apoptosis kit,購自聯(lián)科生物。具體步驟
收集血細胞，用MAS抗凝劑進行稀釋，調整血細胞濃度大約為1-5X106 cells/ml，取200 μ I稀釋的血細胞，在細胞懸浮液中加入5 μ I Annexin V-FITC和10 μ I PI后輕輕混勻，在黑暗環(huán)境下靜置5分鐘，然后使用200目的篩網(wǎng)過濾將細胞懸液轉移到上樣管中，使用流式細胞儀進行檢測。結果表明Α，B, C三組魚受到低溫14±0. 5°C應激后，應激O小時，三種飼料喂養(yǎng)的魚血細胞的細胞凋亡數(shù)目并沒有明顯差異。隨著應激時間的延長,血細胞的細胞凋亡數(shù)目不斷增加，A、B組血細胞的細胞凋亡數(shù)目增加比C組多，在6小時達到最大值，并且A、B組的細胞凋亡數(shù)目明顯高于C組。應激12小時后，A、B、C三組的血細胞的細胞凋亡數(shù)目均有下降，但是C組的血細胞的細胞凋亡數(shù)目明顯少于A、B組，并且差異顯著(見圖15)。以上實驗表明實驗組C組，食用了含有重組蛋白rC3B的飼料后，在低溫應激過程中，其抗應激能力明顯優(yōu)于對照組A、B。由此可見，重組蛋白rC3B可用于制備魚類免疫制劑或飼料添加劑，提高魚類尤其是石斑魚的免疫力。
權利要求
1.石斑魚rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO: 4所示,或者是SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
2.編碼權利要求I所述石斑魚rC3B蛋白的基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。
4.石斑魚補體C3蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO :2所示,或者是SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。
5.編碼權利要求4所述石斑魚補體C3蛋白的基因。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
7.一種克隆載體，含有權利要求2、3、5或6所述的基因。
8.—種表達載體,含有權利要求2、3、5或6所述的基因。
9.生產石斑魚rC3B蛋白或石斑魚補體C3蛋白的方法，包括將權利要求8所述表達載體導入宿主細胞中，表達得到rC3B蛋白或C3蛋白。
10.權利要求I或4所述的蛋白在制備提高魚類免疫力制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了斜帶石斑魚補體C3基因、載體、重組菌株和蛋白及其應用。石斑魚rC3B蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，或者是SEQIDNO:4所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸和/或末端修飾且具有同等或更高活性的蛋白。本發(fā)明首次獲得了石斑魚的補體C3基因序列以及C3序列上的功能片段rC3B核苷酸序列，不僅豐富了石斑魚的基因庫，而且可應用于制備重組蛋白、魚類免疫制劑或飼料添加劑，為石斑魚的生理免疫研究提供了新的理論與實踐基礎。
文檔編號C12N15/12GK102702339SQ20121013612
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權日2011年5月24日
發(fā)明者劉玉鳳, 王維娜, 祁增華 申請人:華南師范大學