專利名稱：綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒及制備、使用方法
技術領域：
本發明涉及一種基于Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒及制備、使用方法。
背景技術：
綿羊肺炎支原體iMycoplasma ovipneumoniae, Mo)為山羊傳染性胸膜肺炎{Contagious Caprine Plneuropneumonia, CCPP)主要病原之一，可感染綿羊及山羊，山羊感染Mo后臨床表現為呼吸障礙、消瘦、高熱、臥地不起等癥狀，病死率較高，給山羊養殖業 造成嚴重的經濟損失。目前，國內外對于Mo的檢測主要依靠病原分離鑒定、血清學試驗以及聚合酶鏈式反應技術。對比三種診斷方法，傳統的分離鑒定由于支原體生長條件要求較高、生長速度緩慢的特點，因此診斷成本高且難度大、耗時長，無法立即解決快速診斷問題；血清學試驗主要為間接血凝試驗、補體結合試驗與競爭ELISA，三者敏感性差或特異性差，且不能作為病原診斷方法；聚合酶鏈式反應技術具有快速、準確、靈敏、特異等優點，但是其試劑成本高、操作復雜、檢測設備要求高，不適宜基層獸醫單位使用。因此，本發明設計了針對Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因環介導等溫擴增試驗特異性內外引物,通過優化反應條件及體系，建立一種快速、靈敏、特異、簡易的Mo檢測方法并制備檢測試劑盒，為山羊源Mo防控提供了一定的技術支持。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于，提供一種綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒及制備、使用方法，能夠避免臨床對于綿羊肺炎支原體感染山羊疑似病例的病原檢測盲目性與繁瑣性，并降低以聚合酶鏈式反應技術進行綿羊肺炎支原體檢測的高成本、高設備要求，為山羊源綿羊肺炎支原體防治提供技術支持，以克服現有技術存在的診斷成本高且難度大、耗時長等諸多不足。本發明的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒原料配方為100(T2000 u L反應液，100 200 u L Bst DNA聚合酶，50 100 u L陽性對照，50 100 u L陰性對照，lmL-2 mL液體石臘，lmL-2 mL超純水。所述反應液包括內引物混合液、外引物混合液、LAMP反應緩沖液、Mg2+及dNTP，五種液體于反應液中體積比為2:2:2. 5:2: I。所述內引物與外引物為針對Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的環介導
等溫擴增試驗特異性內引物FIP與BIP、外引物F3與B3，內引物濃度為20 ii mol/ L，外引物
濃度為5 u mol/ L，引物序列見表I :
表I內外引物序列
引物I序列(5’ 一3’)—
權利要求
1.一種綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于其原料配方為1000 2000 u L反應液，100 200 u L Bst DNA聚合酶，50 100 u L陽性對照，50 100 u L陰性對照，lmL-2 mL液體石臘,lmL-2 mL超純水。
2.根據權利要求I所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于反應液包括內引物混合液、外引物混合液、LAMP反應緩沖液、Mg2+及dNTP,五種液體于反應液中體積比為2:2:2. 5:2:1。
3.根據權利要求2所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于內引物與外引物為針對Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的環介導等溫擴增試驗特異性內引物FIP與BIP、外引物F3與B3，內引物濃度為20iimol/ L，外引物濃度為5 V- mol/ L，引物序列見表I: 表I內外引物序列
4.根據權利要求2所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于LAMP 反應緩沖液為 IOXThermoPol Reaction Buffer，該 LAMP 反應緩沖液包括 200mmol/LTris-HClU00mmol/L (NH4) 2S04、100mmol/L KCl、20mmol/L MgSO4 和 l%Triton X-IOO0
5.根據權利要求2所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于Mg2+為MgCl2溶液，其濃度為25mmol/L。
6.根據權利要求2所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于dNTP為dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在內等量混合游離核苷酸，其濃度為IOmmol/ L。
7.根據權利要求I所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于Bst DNA聚合酶濃度為8. OU/ u L0
8.根據權利要求I所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于陽性對照為綿羊肺炎支原體16S rRNA基因部分序列克隆質粒,其濃度為I. OX IO5Copies/U L
9.根據權利要求I所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于陰性對照為不含綿羊肺炎支原體16S rRNA基因的pMD18_T空載體質粒。
10.根據權利要求I所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于液體石臘為分析純石臘油。
11.一種綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒的制備方法，其特征在于它包括以下內容第一，最佳反應溫度與時間的確定；第二，特異性檢測、敏感性檢測和臨床應用性檢測；第三，試劑盒包裝。
12.根據權利要求11所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒的制備方法，其特征在于最佳反應溫度的確定過程如下首先取6支PCR反應管，每管中均加入反應液9. 5 u UBst DNA聚合酶l.OuL,陽性對照l.OuL,超純水13. 5u L ;然后每管加入20. 0 u L液體石蠟覆于液面上，于60°C 65°C (以1°C間隔遞增)反應60min，80°C滅活5min，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測效果以確定最佳反應溫度； 最佳反應時間的確定過程如下首先取4支PCR反應管，每管中均加入反應液9. 5 y L，Bst DNA聚合酶I. O ii L，陽性對照I. O ii L，超純水13. 5 y L ;然后每管加入20. O y L液體石臘覆于液面上，于60°C分別反應30min、60min、90min、120min, 80°C滅活5min, I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析以確定最佳反應時間。
13.根據權利要求11所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒的制備方法，其特征在于特異性檢測過程如下取8支PCR反應管，每管中均加入反應液9. 5 y L與Bst DNA聚合酶I. Oy L后，從第I管至第8管依次加入綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、大腸桿菌、鏈球菌、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及山羊痘病毒的基因組DNA各LOuL進行環介導等溫擴增反應，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測試劑盒特異性； 敏感性檢測過程如下取7支PCR反應管，每管中均加入反應液9.5 ii L與DNA聚合BI I. 0 u L后，從第I管至第7管依次加入濃度為I. OX IO6Copies/ U L I. OX 10。copies/U L的陽性對照I. 0 U L進行環介導等溫擴增反應，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析以檢測試劑盒敏感性； 臨床應用性檢測過程如下以所建綿羊肺炎支原體基因檢測環介導等溫擴增方法分別對不同疑似綿羊肺炎支原體感染山羊病變肺組織、胸腔積液及鼻腔分泌物進行檢測，并與傳統支原體分離及生化鑒定結果進行比較，以驗證方法的臨床應用性。
14.根據權利要求11所述的綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒的制備方法，其特征在于試劑盒包裝過程如下首先將試劑原料按類別分別裝入平底聚丙烯管內，貼標簽后以全封閉式焊頭封閉各管管口；其次將已裝原料各管正面放置于泡沫試劑托盤上并裝入試劑盒內；然后于試劑盒內放入使用說明書后膠封試劑盒；最后將包裝好的試劑盒置_20°C保存。
15.一種綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒的使用方法，其特征在于它包括以下過程①取出試劑盒內所裝試劑置冰上徹底溶解取無菌PCR反應管，向內依次加入所述試劑；③上述試劑于PCR反應管混勻瞬時離心后，加入20. Oy L滅菌液體石蠟覆于液面上，并置PCR反應管于金屬恒溫儀或水浴鍋中，以60°C保溫反應60min后80°C滅活5min ；④取8yL擴增產物以I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，結果判定陽性對照應出現清晰的“瀑布狀”條帶，主要于IOObp — 500bp間出現6條較亮條帶，陰性對照無任何條帶出現；若待檢擴增模板出現與陽性對照相同“瀑布狀”條帶，則判定待檢樣本綿羊肺炎支原體感染陽性，若無任何條帶出現則判定待檢樣本綿羊肺炎支原體感染陰性。
全文摘要
本發明公開了一種綿羊肺炎支原體環介導等溫擴增檢測試劑盒的原料配方及制備、使用方法。其原料配方為1000~2000μL反應液，100~200μLBstDNA聚合酶，50~100μL陽性對照，50~100μL陰性對照，1mL-2mL液體石蠟，1mL-2mL超純水；反應液包括內引物混合液、外引物混合液、LAMP反應緩沖液、Mg2+及dNTP，五種液體于反應液中體積比為2:2:2.5:2:1。制備方法包括以下內容第一，最佳反應溫度與時間的確定；第二，特異性檢測、敏感性檢測和臨床應用性檢測；第三，試劑盒包裝。本發明對山羊養殖場綿羊肺炎支原體感染山羊疑似病例病原檢測具有快速、簡易、準確的特點。
文檔編號C12Q1/68GK102634602SQ20121014247
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者周碧君, 張雙翔, 文明, 王開功, 程振濤 申請人:貴州大學