技術領域：
本發明涉及微生物檢測
技術領域：
，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定量檢測霍亂弧菌的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。
背景技術：
：弧菌屬(Vibrio)中霍亂弧菌(V.cholerae)可引起一種烈性腸道傳染病，發病急、傳染性強、病死率高，屬于國際檢疫傳染病。人類在自然情況下是霍亂弧菌的唯一易感者，主要通過污染的水源或飲食物經口傳染。在一定條件下，霍亂弧菌進入小腸后，依靠鞭毛的運動，穿過粘膜表面的粘液層，可能藉菌毛作用粘附于腸壁上皮細胞上，在腸粘膜表面迅速繁殖，經過短暫的潛伏期后便急驟發病。該菌不侵入腸上皮細胞和腸腺，也不侵入血流，僅在局部繁殖和產生霍亂腸毒素，此毒素作用于粘膜上皮細胞與腸腺使腸液過度分泌，從而患者出現上吐下瀉，瀉出物呈"米泔水樣"并含大量弧菌，此為本病典型的特征。居住擁擠，衛生狀況差，特別是公用水源是造成暴發流行的重要因素。人與人之間的直接傳播不常見。在正常胃酸條件下，如以水為載體，需飲入大于1010個細菌方能引起感染；如以食物作為載體，由于食物高強度的緩沖能力，感染劑量可減少到102~104個細菌。任何能降低胃中酸度的藥物或其他原因，都可使人對霍亂弧菌感染的敏感性增加。對霍亂弧菌進行快速檢測，有利于臨床上快速做出治療應對措施，對食品進行霍亂弧菌檢測，切除傳染源，對保障公共衛生安全有重大意義。目前，霍亂弧菌的檢測技術主要有常規方法和分子生物學方法。常規方法是通過對細菌的表型特征和生化指標進行鑒定。從樣品中分離病原菌需要耗費大量的時間和相對苛刻的操作環境條件，且分離率低。鑒定霍亂弧菌的生化指標主要包括：革蘭氏染色、氧化酶實驗、過氧化氧酶實驗、V-P反應(福格斯-普利斯考爾)產物實驗，生化試驗通常耗時24-72小時。目前也有PCR檢測方法報道。通常以霍亂腸毒素(choleraenterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。然而，一些非產毒株(如環境來源的菌株)有可能通過基因水平轉移獲得毒力基因成為產毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。此外，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協同調節菌毛A基因(tcpA)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達調控基因(toxR)等也被選用為PCR的靶基因。雖然PCR方法較常規方法快速準確，但需要復雜的儀器設備，成本較高，不適合基層和現場檢測，此外，在結果判定上需要先進行瓊脂糖凝膠電泳，再使用紫外透射儀照射進行判定，且通過肉眼判定具有人為主觀因素，還容易造成實驗室污染。技術實現要素：本發明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測霍亂弧菌的方法，公開一種快速、實時定量的定量檢測霍亂弧菌的環介導等溫擴增試劑盒。為實現本發明目的所使用的技術方案為：一種霍亂弧菌環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括LAMP引物、2×反應緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和霍亂弧菌DNA模板；所述的LAMP引物包括外引物F3與B3和內引物是FIP與BIP；其中引物的序列分別為：F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。以上所述的霍亂弧菌DNA模板是使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取的霍亂弧菌DNA。以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。以上所述的2×反應緩沖液包括Tris-HCL35-55mM、KCL18-32mM、MgSO415-25mM、(NH4)2SO422-28mM、Tween200.3-0.6℅、Betaine1.5-3M和dNTPs3-4.5mM，其配制方法在pH為9.0條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。一種霍亂弧菌環介導等溫擴增試劑盒的應用，用于快速檢測樣品中是否存在霍亂弧菌污染，以及對疑似霍亂弧菌進行鑒定，具體檢測步驟包括：（1）LAMP引物的設計與合成（2）霍亂弧菌DNA模板的提取（3）LAMP反應體系建立（4）LAMP檢測方法。以上所述的LAMP反應體系建立LAMP反應體系以25μl計，2×反應緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍亂弧菌DNA2μL超純水補足25μL。以上所述的LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測的方法。以上所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監控，反應溫度為63℃、反應在35-40分鐘出現擴增。本發明的實質性特點和顯著進步是：1）特異性強所檢測的陰性對照細菌和水對照均無陽性結果出來，與PCR檢測結果一致。且操作簡便、快速獲得檢測結果、無需昂貴復雜的儀器。2）靈敏度高普通的PCR檢測方法的靈敏度為2.05×10-1ng/μL數量級，而使用本發明檢測方法，檢測限約為2.05×10-2ng/μL，是普通PCR的10倍左右。3）迅速得出結果普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，目前多數建立的LAMP反應方法在反應結束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結果，從細菌基因組DNA提取到獲取試驗結果，需要4-5小時左右。本發明提供的LAMP檢測方法反應在35-40分鐘間出現擴增，60分鐘內即可完成擴增，且結果判定方式簡便—擴增結束即可判斷結果，不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析，從基因組DNA提取到獲得最終結果可在2-3小時內完成。4）不造成污染目前LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應后加入，但顯色法只能是反應結束后開蓋加入熒光染料進行顯色反應，觀察是否有顯色來判讀試驗結果，或者通過跑電泳的方法進行結果判定，無法區分特異性擴增與非特異性擴增，因此增加了假陽性診斷結果的幾率；而且對于弱陽性反應，通過人為肉眼判讀的方式很可能誤判為陰性；通過電泳的方法來判讀結果的方式，增加了試驗成本、耗時間且容易造成實驗室污染。而本發明的LAMP熒光檢測方法，熒光染料是在反應前加入，不需要開蓋，能有效避免氣溶膠污染。此外，本發明的LAMP檢測方法在結果判定上，可以直接通過濁度儀檢測反應管的濁度值來判定結果，可不進行熒光染料法檢測結果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。5）可實時定量本發明利用Tubidimeterreal-timeLA-320濁度儀來實時分析LAMP反應的結果，不同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代人標準曲線方程，即可進行定量檢測。附圖說明圖1是本發明LAMP方法特異性檢測結果，其中A1、霍亂弧菌1；A2、霍亂弧菌2；A3、嗜水氣單胞菌；A4、維氏氣單胞菌；A5、鮰愛德華氏單胞菌；A6、哈氏孤菌；A7、創傷孤菌；A8、水對照；結果顯示2株霍亂弧菌反應管出現濁度的上升曲線，為陽性結果，5株陰性對照菌反應管和水對照反應均無擴增。圖2和圖3分別是本發明LAMP方法及傳統PCR方法的敏感性檢測結果；其中1：2.05×101ng/Μl；2：2.05×100ng/μL；3：2.05×10-1ng/μL；4：2.05×10-2ng/μL；5：2.05×10-3ng/μL；6：2.05×10-4ng/μL；7：2.05×10-5ng/μL；8：2.05×10-6ng/μL；9：2.05×10-7ng/μL。霍亂弧菌模板DNA的起始濃度為2.05×101ng/μL，經10倍倍比稀釋后進行LAMP和PCR擴增，結果顯示LAMP法檢測限約為2.05×10-2ng/μL，而PCR法檢測限為2.05×10-1ng/μL。圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結果：右管為以霍亂弧菌基因組DNA為模板的反應情況，為陽性結果，左管為陰性對照的反應情況，為陰性結果。圖5是本發明定量檢測霍亂弧菌LAMP方法的標準曲線：利用不同的標準樣品的濃度對應的濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可進行定量檢測。具體實施方式1、材料的準備霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏單胞菌、哈氏孤菌、創傷孤菌，為廣西壯族自治區獸醫所分離鑒定和保存。LAMP法DNA擴增試劑盒購自北京藍譜生物科技有限公司，貨號SLP204，細菌基因組提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0522。2、LAMP引物的設計與合成根據GenBank中的霍亂弧菌Mdh序列，利用LAMP法引物輔助設計軟件PrimerExplorerV4軟件設計一套LAMP引物，其中F3、B3為外引物，FIP、BIP為內引物，其中F3、B3為霍亂弧菌PCR檢測引物，其中F3CTGAAACCTTTGTTGCCGCB3GCCCATAGAAAGAGTCGCTGFIPGGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCGBIPTTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT；3、細菌基因組DNA提取使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取受試細菌的基因組DNA。4、LAMP反應體系建立按照試劑盒說明書，按25μl體系配置：2×反應緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLFIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmol霍亂弧菌DNA2μL超純水補足25μL。LAMP反應在以實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進行密閉全程監控的形式監測本方法的檢出情況，濁度儀實時監控擴增情況，可繪制標準曲線，通過獲得未知樣品達到0.1濁度值對應的時間值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數，反應溫度以試劑盒推薦的63℃做為反應溫度。5、LAMP檢測方法1）特異性檢測分別提取霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鮰愛德華氏單胞菌、哈氏孤菌、創傷孤菌的基因組DNA作為LAMP反應的模板，檢驗LAMP方法的特異性。2）敏感性檢測以提取的霍亂弧菌基因組DNA為模板，測定其濃度，用RNA-FreeWater連續10倍倍比稀釋成8個稀釋度，取各稀釋度2μL作為模板進行LAMP擴增和PCR擴增，對比兩種檢測方法的敏感性。3）熒光可視化檢測根據濁度儀監控優化的條件，加入熒光染料，熒光染料在反應前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63℃下反應60分鐘后，在紫外燈下觀察，不采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠污染。實施例1LAMP檢測方法的特異性結果對2株霍亂弧菌、5株陰性對照菌和水對照進行LAMP擴增，結果如圖1所示，霍亂弧菌反應管在33分鐘左右出現濁度的上升曲線，為陽性結果，5株陰性對照菌反應管和水對照反應管曲線均無擴增情況出現，為陰性結果。實施例2LAMP檢測方法的敏感性結果霍亂弧菌DNA模板起始濃度為2.05×101ng/μL，經10倍倍比稀釋后進行LAMP和PCR擴增，結果如圖2和圖3所示，結果顯示LAMP法檢測限約為2.05×10-2ng/μL，而PCR法檢測限為2.05×10-1ng/μL。實施例3LAMP檢測方法的熒光可視化檢測結果根據濁度儀監控優化的條件，反應器加入熒光染料，63℃反應60分鐘后，在紫外燈下觀察，圖4為觀察結果，左管為陰性對照，右管為以霍亂弧菌為模板的反應情況，表明建立的方法可以方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設計的LAMP引物，加入樣品后，用低廉的水浴鍋來保持63℃60分鐘，即可快速觀察結果，且無需開蓋，避免了污染。實施例4霍亂弧菌定量標準曲線的繪制設置對照：濃度為2.05×101ng/μL、2:2.05×100ng/μL、2.05×10-1ng/μL、4:2.05×10-2ng/μL的標準樣品各一個，因為標準樣品濃度的負對數值與其擴增濁度值為0.1的時間值成線性關系，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時間（如表1）做成標準曲線，獲得標準曲線方程，y=0.1772x-6.9253，如圖5所示。從標準曲線方程來看相關系數R2=0.9924，呈良好的線性關系。以時間為X值，可求出Y值即濃度的負次方數，則濃度為10-y，再乘以基數2.05，即為2.05×10-yng/μL。如某試驗樣品達到濁度值為0.1的時間為35分鐘時，帶入所建立的標準曲線方程，求出Y等于-0.7233，則濃度為100.7233，再乘以基數2.05，即為該樣品的濃度2.05×100.7233ng/μL，從而達到定量的效果。表1時間(min)33.938.943.950.9標準值（-LOG）-1012<110>廣西壯族自治區獸醫研究所<120>一種霍亂弧菌環介導等溫擴增試劑盒及其應用<160>4<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1CTGAAACCTTTGTTGCCGC<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2GCCCATAGAAAGAGTCGCTG<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>3GGCAGGATGGTAACCCCTGAGTAAAGATCCAGGCCAAGTTCG<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>4TTACCGATGAAGAAGTCGCCGCTTGGCTTCAACCACTTCAGT當前第1頁1 2 3