專利名稱：萊茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能顯著抑制藻類中性脂合成的基因及其編碼蛋白與應用，特別涉 及一種能顯著抑制萊茵衣藻中性脂含量的油脂代謝基因及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
進入21世紀，經濟飛速發展，人類對石油等化石燃料的消耗日益増加，并且使用化石燃料帶來了嚴重環境污染問題，世界各國都在尋找安全的可再生能源。生物能源可以間接或者直接利用植物或微生物的光合作用，將太陽能固定為化學能，是可再生能源的首選。生物柴油和燃料こ醇是目前可以作為汽油添加劑進入市場的生物能源，其中生物柴油的成分更接近汽油，并且來源廣泛，成本低，是最有可能解決石油危機的可再生能源之一。生物柴油的制備主要是通過三酰甘油(TAG)與甲醇(こ醇)通過酯交換エ藝制成。近年來生物柴油的產量在不斷増加，2008年全球生物柴油總量達到1110萬噸，預計到2016年生物柴油總產量達到12100萬噸，但是生物柴油的價格至今仍是居高不下。原料成本占據了生物柴油總生產成本的60-70%。目前生物柴油的原料有餐飲廢棄油、動植物油脂和微藻。利用微藻生產生物柴油具有無可比擬的優勢，已成為制備生物柴油的主要途徑。利用微藻來生產生物柴油有很多エ藝步驟，其中優良藻種的選育是關鍵。最理想的生物柴油生產藻株要求生長迅速、含油量高且脂肪酸組成適宜制備生物柴油。目前的研究工作主要集中在藻種的分離，藻種含油量的測定，藻種脂肪酸成分的分析以及藻種的大規模培養上。與高等植物相比，微藻的TAG生物合成和積累的分子機制研究還很薄弱，關于TAG代謝網絡中相關基因功能研究報告更為稀少。萊茵衣藻是模式單細胞生物，基因組測序已經完成，在缺氮條件下油脂可以積累達到胞質的60%，是研究TAG代謝基因的理想藻株。PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是ー種細胞質酶，廣泛存在于光合生物中，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HC03-生成草酰こ酸(OAA)和無機磷酸的不可逆反應。在C4植物中PEPC主要起固定C02作用；而在C3植物和非光合作用組織中，PEPC主要起到回補損失的碳骨架作用。萊茵衣藻中存在兩種PEPC酶PEPCl和PEPC2。前期研究表明PEPC2對微藻的中性脂合成具有負調控作用。日本學者Sugimoto等也發現大豆籽粒中PEPC活性與蛋白質含量密切相關。我國科學家陳錦清等受此啟發而提出“底物競爭”假說大豆籽粒中的油脂和蛋白質之間存在著底物競爭，其共同底物為糖酵解的產物ー丙酮酸，PEPC催化和HC03-生成草酰こ酸(OAA)進入蛋白質合成途徑，而こ酰輔酶A羧化酶(ACCase)則催化丙酮酸生成こ酰輔酶A進入脂肪酸合成途徑，二者的相對活性決定了底物的流向，進而決定蛋白質和脂肪在大 桿粒中的比例。

發明內容
本發明的目的是提供ー種能抑制微藻中三酰甘油含量的基因及其編碼蛋白與應用。尤其是來自萊茵衣藻的基因。
本發明所提供的能提高藻類三酰甘油含量的基因名稱為CrPEPCl(uhlamydomonas reinhardti I Phosphoenolpyruvate carboxylase isoiorm I), 該基因在JGI萊茵衣藻基因數據庫的名稱為estExt_GenewiseW_l.C_280036，位于16號染色體3，641，705-3，648，177區域，含12個外顯子。蛋白ID 80312，編碼ー個名為PEPCl (Phosphoenolpyruvate carboxylase isoform I)的蛋白，是根據 JGI 萊茵衣藻基因數據庫上公布的CrPEPCl基因為模板設計特異性引物，擴增cDNA獲得全長序列，根據該堿基序列分析而推測編碼CrPEPCl蛋白的序列。對其研究發現該基因可以顯著降低萊茵衣藻中中性脂含量和生物量。本發明所述CrPEPCl基因，來源于萊茵衣藻，是下列核苷酸序列之I)序列表中 SEQ ID NO 1DNA 序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 2蛋白質序列的多核苷酸； 3)與序列表中SEQ ID NO 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。能降低微藻中性脂含量的基因CrPEPCl的編碼蛋白CrPEPCl，是具有序列表中SEQID NO :2氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。序列表中序列2氨基酸殘基是由484個氨基酸殘基組成的蛋白質。含有本發明基因的表達載體、細胞系及至少有15個核苷酸與由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列或其互補鏈組成的DNA互補的DNA均屬本發明的保護范圍。該CrPEPCl基因應用于顯著改變萊茵衣藻的中性脂含量和生物量及應用于新型高油脂含量藻株的培育。采用任何一種引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明的CrPEPCl基因轉入藻類導致中性脂含量減少，在微藻中將此基因敲除(或沉默)后中性脂含量升高。如通過電轉化法轉化萊茵衣藻，得到純合的CrPEPCl轉化子(即為CrPEPCl過量表達的單拷貝純合萊茵衣藻)。為了便于對轉基因細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加エ，如加入了植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。用于轉化的生物可以是細菌細胞，動物細胞和植物。一旦獲得ー種轉化植物，其中已將本發明的DNA導入了基因組，就可能通過無性或有性繁殖獲得后代，或者從該植株及其后代通過克隆獲得繁殖材料來生產植物。用本發明DNA轉化的植物細胞，包含這些細胞的植物體，該植物后代和克隆后代，以及所有從該植物獲得的繁殖材料都屬于本發明中。本發明的基因可以用于制備該基因的重組蛋白。重組蛋白常如下制備將編碼本發明蛋白的DNA插入適當的表達載體，將該載體導入適當的細胞，培養轉化的細胞，為使這些細胞表達所述重組蛋白和純化所表達的蛋白。重組蛋白可表達為與便于純化的其他蛋白融合的蛋白，如與谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合的蛋白。對宿主細胞沒有限制，只要該細胞適于表達所述重組蛋白。所得重組蛋白可用于制備與該蛋白結合的抗體。例如用本發明的純化重組蛋白或一部分免疫動物(如免)，一段時間后采血，從而制備多克隆抗體。得到的抗體可用于檢測或純化本發明的蛋白和能與本發明蛋白互作的蛋白。相應的本發明包括能結合本發明蛋白的抗體。


圖I為CrPEPCl的RT-PCR擴增結果M :DL2000DNA分子量標準；3 =CrPEPCl擴增結果;圖2為CrPEPCl過量表達轉化子生物量的變化情況；圖3為CrPEPCl過量表達轉化子中性脂含量的變化情況；圖4為pAMBIA1302空載體組、pCAMBIA1302_CrPEPCl轉化組第六天時尼羅紅染色后熒光觀察圖； 圖5為pAMBIA1302空載體組、pCAMBIA1302_CrPEPCl轉化組RNA表達分析圖；圖6為pAMBIA1302空載體組、pCAMBI A1302_CrPEPCl轉化組酶活性分析圖；圖7為干涉藻株的生物量含量變化圖；圖8為干涉藻株的油脂含量變化圖；圖9為Maa7/XIR空載體轉化子和CrPEPCl干涉藻株尼羅紅染色后熒光觀察圖；圖10為Maa7/XIR空載體轉化子和CrPEPCl干涉藻株酶活性分析圖；圖11為CrPEPCl基因在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位；圖12為CrPEPCl基因在萊茵衣藻CC425中的亞細胞定位；
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。Marker均購自大連寶生物公司。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例ICrPEPCl的克隆I)萊茵衣藻總RNA的提取萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)藻株 CC425,培養于 24°C光照培養箱，100 μ mo I IrT2SecT1白光,全光照條件下,待生長至對數生長期,取藻液50mL, 10000r/min離Imin收集藻體，液氮速凍后碾磨成粉末，按照Trizol的方法提取總RNA ；2)引物設計根據DOE JGI Chlamydomonas database上公布的CrPEPCl基因為模板,設計如下特異性引物，進行PCR擴增CrPEPCl全長擴增引物引物序列(5’ 一 3’ )正向引物GATGGACGCGGTGACCAC反向引物CCGCCGCCACCGCCGCCG3) cDNA 的合成按照寶生物工程(大連)有限公司提供的Takara的試劑盒,使RNA反轉錄成cDNA。4)制備 PCR Master 混合物試劑每管加入量(AL )cDNA第一鏈I10 X PCR緩沖液5dNTP Mix (IOmM)I正向引物I反向引物IPCR 級水40.5LA Taq 酶O. 55)進行PCR擴增940C 5min ；35 個循環94で lmin, 55°C lmin,72°C Imin ；72°C IOmin0取8 μ L進行I %瓊脂糖凝膠電泳分析結果如圖I，-20 V保存。6) PCR產物的純化和膠回收按照上海華舜生物工程有限公司的小量膠回收試劑盒回收DNA片斷，PCR產物連接到pGEM-T Vector (promega公司)，轉化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克隆測序。7) CrPEPCl基因生物信息學分析來源于萊茵衣藻的CrPEPCl推測的蛋白質含有484個氨基酸，經ExPASy數據庫中蛋白質軟件(http://expasy. org/tools/)分析其分子量為51. 8kD,等電點為5· 81。 實施例2過量表達CrPEPCl基因的轉化子獲得I)植物雙元表達載體的構建設計帶有Bgl II和Spe I酶切位點的引物(正向5’ -TAGTAGATCTGATGGACGCGGTGACCAC-3’；反向5’ -AAATACTAGTCCGCCGCCACCGCCG CCG-3’)，PCR 擴增 CrPEPCl 基因全長。Bfl II和Spe I雙酶切修飾后的CrPEPCl產物和pCAMBIA1302的BglII和Spe I雙酶切載體大片段進行連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5 a，PCR鑒定陽性克隆，提取質粒進行雙酶切鑒定。提取正確的重組表達質粒pCAMBIA1302-CrPEPCl，用于轉化。2)過量表達CrPEPCl萊茵衣藻轉化子的獲得(電轉化法)萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學院水生生物研究所)，培養于24°C光照培養箱，lOOymol m^sec-1白光，全光照條件下，待生長至藻細胞數為2 X IO7個/mL ;2000rpm離心5min，收集藻細胞；無菌去離子水洗滌沉淀并重復3次，用含60mM蔗糖的TAP液體培養基(2. 42g/L Tris-base+lml/L 冰醋酸+119mg/L K2HP04+61mg/LKH2P04+0. 4g/L NH4C 1+0. lg/LMgSO4 7H20+50mg/LCaCl2 2H20+lml/LTrace)重懸沉淀 JKMlOmin ;取藻液加入重組質粒， 混勻后轉移至電擊杯中，室溫靜置5min ; I. 5kV，10 μ F，200 Ω，6msec條件下電擊，室溫靜置IOmin,加入5mL TAP液體培養基，22°C, IOOrpm,昏暗光線復蘇8h ；2000rpm,離心5min,收集藻細胞，調節藻細胞數目到I X IO6個/mL ;轉移藻液至含I. 5mM L-色氨酸、5 μ g/mLL-paromomycin的TAP固體選擇培養基上,緩慢傾斜旋轉，使藻液分布均勻；關閉光源，吹干，24°C光照培養箱，lOOymol m^sec-1白光，全光照條件下培養至形成單個藻落。實時熒光定量PCR確定CrPEPCl基因的過量表達RNA提取參照實例一，實時熒光定量 PCR 參照 TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex Taq試劑操作說明進行。結果見圖5。3)對照萊茵衣藻的獲得用pCMBIA1302代替pCMBIA1302-CrPEPCl，用電轉化法轉化萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學院水生研究所)，方法同步驟2，得到轉空載體的藻株。實施例3CrPEPCl過量表達藻株的生理表型觀察 轉pCMBIA1302空載體組、CrPEPCl過量表達組、原始藻株CC425，各選100個藻株，培養于24°C光照培養箱，100 μ mol n^sec—1白光，全光照條件下，待生長至對數生長期，2000rpm,離心5min，雙蒸水重懸，按10 %接種量接種到不含抗生素的HSM-N液體培養基(2g/LNaAc 3H20+1. 44g/L K2HP04+0. 72g/L KH2P04+0 . 54 6 7g/L NaCl+20mg/LMgS047H20+10mg/LCaCl2 2H20+lml/L Trace-N)，連續震蕩培養6天。每24h測量以下生理值。I)生物量統計按照Harris于1989年描述的方法使用血球計數板計數，并計算出生物量。結果顯示過量表達CrPEPCl基因的藻株比非轉基因藻株CrCC425和轉空載體藻株生物量有所增カロ。在第6天時增加最多，相對于轉空載體藻株生物量増加了 70.99% (圖2)。2)中性脂含量測定使用酸水解法測定中性脂含量藻液低溫冷凍干燥成藻粉，各取0. Ig藻粉，加入無菌蒸懼水，混勻后加入IOml鹽酸，80°C水浴25min,加入IOml 95%こ醇,混勻。冷卻后加入IOmlこ醚,加蓋振搖lmin,之后開蓋放出氣體。4000rpm離心3min,取上清液移至恒重的錐形瓶中，重復洗滌離心管中的殘渣，然后將上清液轉移至原先的錐形瓶中。將錐形瓶置于水浴上蒸干，再轉移至100°C烘箱中干燥2h，取出冷卻后稱重(圖3)。另取藻液，經終濃度為10 μ g/mL尼羅紅染色IOmin后，使用突光顯微鏡在激發光為480nm,發散光為560nm-600nm下進行觀察及拍照，也可見過量表達CrPEPCl基因中性脂含量明顯下降(圖4)。實施例4干涉表達CrPEPCl基因的轉化子的獲得I)植物干渉表達載體的構建設計特異性引物(正向5’-GTGACTGTGCAGGGCGAGAT-3’ ；反向5’-TGCTGAGTCCAGGCGAAGAT-3’)擴增CrPEPCl基因486bp片段用于干涉研究。正義片段分別在正向和反向引物引入Hindi 11和XbaI位點，擴增的PCR產物和RNAi中間載體T2251載體分別經Hindlll/Xbal雙酶切后，連接，轉化，鑒定，測序確定正確的陽性克隆。反義片段在正向和反向引物中分別引入BamHI與Sal I位點，經過BamHI和Sal I雙酶切后，與同樣經BamHI/Sall雙酶切修飾已連接正義片段的T2251載體連接，轉化，鑒定獲得CrPEPCl反向重復序列插入的中間載體T2251-CrPEPCl。EcoRI酶切Maa7/XIR載體并去磷酸化與同樣經EcoRI酶切的T2251-CrPEPCl載體連接，轉化，鑒定得到用于RNA干涉的最終載體Maa7/XIR-CrPEPClo2)干涉表達CrPEPCl萊茵衣藻的獲得采用電轉化法轉化萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學院水生研究所)，具體步驟參見實例2中步驟2。3)對照萊茵衣藻的獲得用Maa7/XIR代替Maa7/XIR_CrPEPCl用電轉化法轉化萊茵衣藻(藻株CC425，購自中國科學院水生研究所)，方法同步驟2，得到轉空載體的藻株。實施例5CrPEP Cl干涉表達藻株的生理表型觀察CrPEPCl干涉表達組，待長出單個藻落后，接種到含I. 5mM L-色氨酸、5μΜ 5_FI的TAP固體選擇培養基上，轉Maa7/XIR空載體組直接接種到含I. 5mM L-色氨酸、5 μ g/mL paromomycin的TAP固體選擇培養基上，培養于24°C光照培養箱，100 μ mol m 2sec 1白光，全光照條件下，待第三次長出單個藻落，挑取陽性轉化子，接種到HSM液體培養基(2g/LNaAc 3H20+1. 44g/L K2HP04+0. 72g/L KH2P04+0. 5g/L NH4Cl+20mg/LMgS04 7H20+10mg/LCaCl2 2H20+lml/L Trace)中，連續震蕩培養9天。每24h測量以下生理值。生物量和中性脂含量的測定參照實例3。結果CrPEPCl干涉表達的藻株生物量略有下降但是改變不是很明顯(圖7);中性脂含量呈升高趨勢，在第6天時升高最多，升高了37. 52% (圖8) ,CrPEPCl干渉表達組的中性脂含量上升也可以通過尼羅紅染色后照相明顯可見(圖9)。其mRNA表達水平參照實例ニ，CrPEPCl基因的RNA表達明顯被抑制。實例6CrPEPCl重組蛋白的獲得DCrPEPCl蛋白表達載體的構建設計CrPEPCl 全長擴增引物(正向5’ -AATCGGATCCATGGCCTCTTA CTTCCCC-3，)和(反向5’ -ATAAGTCGACTCATTGCACGATGGCCAGCGG-3’ )，分別引入 BamHI 和 SalI 酶切位點，進行PCR擴增。PCR產物和pGEX-6P-l載體均經BamHI和SalI雙酶切后，回收，連接，轉化大腸桿菌BL21。鑒定，挑取正確的陽性克隆。2) GST-CrPEPCl融合重組蛋白的誘導轉化質粒pGEX-6P-l-CrPEPCl的BL21菌，在37 °C搖床培養至對數生長期，加入終濃度ImM的IPTG，220rpm，37°C誘導4小時，離心菌體，進行SDS-PAGE電泳，誘導的GST-CrPEPCl融合重組蛋白大小為84kD，CrPEPCl蛋白與預期的52kD —致。實例7CrPEPCl基因的亞細胞定位取pCAMBIA1302-CrPEPCl過量表達的藻株和pCAMBIA1302空載體轉化組及空白CC425藻株在熒光顯微鏡下觀察，發現CrPEPCl在細胞質中表達強烈(圖12)，將pCAMBIA1302-CrPEPCl質粒采用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞后觀察也發現CrPEPCl基因定位于細胞質(圖11)。實例8轉基因藻細胞PEPCl酶活測定取對數生長期的轉基因藻株IOml轉入50ml離心管,3000rpm離心5min,取上清收集細胞，并以PH 7. 9的磷酸緩沖溶液洗滌2次。將藻細胞置于冰上，加入3ml PBS進行超聲波破碎，破碎持續10s，每次間隔5s，共進行四次，破碎完畢后，4°C離心5min，收集上清液定容至6ml，在大量透析液(即提取緩沖液)中4°C透析過夜，即得PEPC酶液。酶活性測定參考Hirai的方法，略有改動1ml反應體系(40mmoI/LTris-HCL緩沖液(pH8. 5)、2mmol/LMgC12、10mmol/L KHC03、2mmol/LPEP、0. 5mmol/L GSH、0. 15mmol/LNADH、過量蘋果酸脫氫酶和適量酶液)，加入反應底物后立即用普析紫外分光光度計測定吸光值，15s為單位掃描3分鐘，記錄吸光度變化，重復3次；以每分鐘吸光度變化O. 01為一個酶單位，酶活性以單位/藻粉/分鐘表示。過量表達的pCAMBIA-PEPCl藻株與轉空載體組相比，酶活明顯增高，增高了145. 52% -193. 79% (圖6);干涉表達的Maa7_PEPCl藻株與轉空載體組相比酶活下降了34. 29% -53. 18% (圖 10)。 以上所揭露的僅為本發明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發明之權利范圍，因此依本發明權利要求所作的等同變化，仍屬于本發明所涵蓋的范圍。
權利要求
1.一種萊茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPCl，其特征在于該基因是來源于萊茵衣藻，是下列核苷酸序列之一 1)序列表中SEQID NO : IDNA序列； 2)編碼序列表中SEQID NO 2蛋白質序列的多核苷酸； 3)與序列表中SEQID NO :1限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2.—種權利要求I所述的基因的編碼蛋白，其特征在于是具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質，蛋白ID為80312，由484個氨基酸殘基組成的蛋白質。
3.—種權利要求2所述的編碼蛋白的衍生蛋白質，其特征是將SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO :2衍生的蛋白質。
4.根據權利要求I所述的萊茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPCl，其特征在于該CrPEPCl基因應用于顯著改變萊茵衣藻的中性脂含量和生物量及應用于新型高油脂含量藻株的培育。
全文摘要
本發明公開了一種萊茵衣藻三酰甘油合成限制基因CrPEPC1及其編碼蛋白與應用，該基因是來源于萊茵衣藻，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。該基因的編碼蛋白是具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質，蛋白ID為80312，由484個氨基酸殘基組成的蛋白質。該CrPEPC1基因可應用于顯著改變萊茵衣藻的中性脂含量和生物量，還可以應用于新型高油脂含量藻株的培育。并且本發明對于微藻的油脂代謝機理研究具有重要意義。
文檔編號C12N1/13GK102660566SQ20121014323
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者羅秋蘭, 蔡佳佳, 費小雯, 鄧曉東 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所