專利名稱:利用細菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法
技術領域:
本發(fā)明涉及生物制氫技術,具體地是一種將細菌和萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法。
背景技術:
能源危機與環(huán)境污染都是當今世界面臨的突出問題,氫氣是一種清潔、燃燒值高、利用形式多樣的可再生生物能源[1]。光合生物制氫技術能直接轉化太陽能為氫能,特別是微藻光合制氫的底物是水,來源豐富,培養(yǎng)容易,不占用可耕地,是利用太陽能生產(chǎn)氫氣的理想模式,成為目前國際上生物制氫領域的研究熱點β]。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因為其氫化酶活性高、培養(yǎng)容易、生長速度快、遺傳學背景清晰和轉化容易等原因被選為微藻制氫研究的模式物種M。但是,衣藻的氫化酶活性很容易受氧氣的抑制而失去活性[3’4],而氧氣又是衣藻光合作用的主要產(chǎn)物,是導致了衣藻產(chǎn)氫效率低的主要原因。目前降低萊茵衣藻細胞內氧氣含量的方法主要是通過去除培養(yǎng)基中硫元素來抑制光合系統(tǒng)II活性、進而降低光解水產(chǎn)生的氧氣[5],但是該方法同時抑制了光解水所產(chǎn)生的電子產(chǎn)量,最終仍然導致產(chǎn)氫效率低[3_5]。因此,要提高萊茵衣藻的產(chǎn)氫效率就需要既降低細胞內的氧濃度又要保障電子的供應。目前最有效的萊茵衣藻產(chǎn)氫技術為兩步法培養(yǎng)技術,即第一步為在正常TAP培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)萊茵衣藻,以獲得最大生物量;然后收集萊茵衣藻在缺硫培養(yǎng)基中進行產(chǎn)氫培養(yǎng),最大限度獲得氫氣產(chǎn)量。萊茵衣藻在大規(guī)模培養(yǎng)時很容易污染其它細菌等微生物,在實驗室繼代培養(yǎng)過程中也很容易污染一些細菌,并且有些細菌能與萊茵衣藻長期共棲,不顯著影響萊茵衣藻的生長。本發(fā)明對在實驗室繼代培養(yǎng)過程中與萊茵衣藻藻株cc849(以下簡稱衣藻)共棲的細菌進行了分離純化,得到三株分離菌,命名為L2、L3和L4,經(jīng)16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學分析鑒定,分別與嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株776、微桿菌 (Microbacterium paraoxydans)菌株 591 禾口假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 A8 的 16S rRNA序列的相似性達到99 %,100 %和99 %。由于豆科植物根瘤中的固氮酶與萊茵衣藻氫化酶具有相似的特性,都對氧氣敏感,但是固氮酶在自然環(huán)境中具有高效固氮活性,是因為根瘤中有根瘤菌的緣故。因此本發(fā)明還選取了慢生大豆根瘤菌與萊茵衣藻共培養(yǎng),驗證其對萊茵衣藻生長和產(chǎn)氫的影響。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用細菌和萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法,使之更適合于萊茵衣藻及其它微藻兩步法產(chǎn)氫技術中的第二階段增加氧氣消耗和提高產(chǎn)氫量的方法。本發(fā)明將上述三株分離菌和一株慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(以下簡稱根瘤菌)分別與純凈的萊茵衣藻藻株cc849在兩步法產(chǎn)氫技術的第一階段和第二階段按一定體積比混合進行共培養(yǎng),結果表明在第一階段的營養(yǎng)生長時期,假單胞菌對衣藻的生長有抑制作用,其它三種細菌無顯著影響。在第二階段的產(chǎn)氫培養(yǎng)時期,上述四種細菌都能顯著提高衣藻的產(chǎn)氫量,其最大產(chǎn)氫量分別是純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的4. 0 倍、2. 9倍、4. 1倍和5. 5倍。對藻菌共培養(yǎng)體系內氧氣含量的檢測表明呼吸耗氧的增加是細菌-衣藻共培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量提高的主要原因。本發(fā)明的方法為衣藻兩步法產(chǎn)氫技術中進一步提高產(chǎn)氫量提供新方法,隨著生物制氫技術的發(fā)展,本發(fā)明將顯現(xiàn)出越來越大的實用性和重要性。本發(fā)明方法的要點是本發(fā)明提供了一種在萊茵衣藻兩步法制氫技術中的第二階段,向衣藻培養(yǎng)體系中加入一定量的某種細菌以增加培養(yǎng)體系內呼吸耗氧和提高產(chǎn)氫量的方法及具體實施辦法。本發(fā)明所使用的某種細菌是這樣選取的在與萊茵衣藻藻株CC849共棲的細菌中分離并純化出了三株細菌L2、L3和L4,經(jīng)16S rRNA序列進行系統(tǒng)進化學分析,分別鑒定為嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株 776、微桿菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591和假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8。它們都是能與萊茵衣藻共棲的好氧細菌。慢生大豆根瘤菌的選擇是由于豆科植物根瘤中的固氮酶與萊茵衣藻氫化酶具有相似的特性,都對氧氣敏感,但是固氮酶在自然環(huán)境中具有高效固氮活性,是因為根瘤中有根瘤菌的緣故。本發(fā)明在將上述四種細菌分別在兩步法萊茵衣藻產(chǎn)氫技術中的第一階段和第二階段與純凈的萊茵衣藻cc849按照一定比例混合后共培養(yǎng),證明了在第一階段的營養(yǎng)生長時期,除了假單胞菌菌株A8抑制衣藻的生長,其它三種細菌對衣藻生物量積累沒有顯著影響;在第二階段的產(chǎn)氫培養(yǎng)時期,在一定的藻菌體積比范圍內,上述四種細菌均能顯著促進衣藻的產(chǎn)氫量,尤其以根瘤菌的促進作用最大,最大可提高產(chǎn)氫量4. 5倍。這種結果及其用途是人們在微藻生物制氫領域一直尋求的。通過檢測藻菌共培養(yǎng)體系的光合速率和呼吸速率,發(fā)現(xiàn)在衣藻培養(yǎng)液中弓丨入一定量的細菌顯著增加了藻菌共培養(yǎng)體系的呼吸耗氧速率,尤其以根瘤菌的作用最為顯著,是引起培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量增加的重要原因,這種結果及其用途是人們在微藻生物制氫領域一直尋求和希望實現(xiàn)的。按照本發(fā)明,所用的細菌是能與萊茵衣藻共棲的好氧細菌——嗜麥芽寡食單胞菌菌株776、微桿菌菌株591和假單胞菌菌株A8以及慢生大豆根瘤菌,但不局限于這四種細菌,凡是對萊茵衣藻無毒性、并且能顯著增加藻菌共培養(yǎng)體系呼吸耗氧作用的細菌和其它微生物都適用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選的細菌是慢生大豆根瘤菌、假單胞菌菌株A8和嗜麥芽寡食單胞菌菌株776。按照本發(fā)明,所用的萊茵衣藻為細胞壁缺欠型藻株cc849,是為了實驗研究的方便,但不局限于該藻株,其它萊茵衣藻藻株和其它具有相似代謝特征的產(chǎn)氫微藻都適用于本發(fā)明的方法,特別是產(chǎn)氫量高的藻株品種更適合于本發(fā)明方法和更具有實際應用價值。在本發(fā)明中,對從萊茵衣藻cc849培養(yǎng)液中分離純化出來的三株細菌進行16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)生學分析的物種分類鑒定,其中16S rDNA基因的克隆所用的通用引物為 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3 ‘),是本領域的技術人員所熟知和在生物信息數(shù)據(jù)庫中能檢索得到的信息。本發(fā)明的具體實例中該對引物是合成于上海生工公司。可選擇的,合成于其它生物公司。在本發(fā)明中,用于16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學分析的軟件——BLAST軟件、ClustalX V2. 0軟件和MEGA5. 05軟件都是本領域技術人員所熟知和在生物信息數(shù)據(jù)庫中能檢索得到的信息。在本發(fā)明中,所用的進行PCR擴增的Taq酶和保存16Sr DNA基因的載體以及相關的分子生物學操作都是本領域技術人員所熟悉和公知的。在本發(fā)明的具體實例中,LA Taq 酶和PMD-19T vector購自于寶生物公司(Takara)。可選擇的,購自于其它生物公司。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、首次將能與萊茵衣藻共棲的細菌以及慢生大豆根瘤菌用于萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫技術中。2、顯著提高了產(chǎn)氫量。3、除了具有在生物能源生產(chǎn)方面具有重要應用意義,在(X)2減排、緩解溫室效應等環(huán)境保護方面也具有重要生態(tài)意義。
圖1三種分離菌的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。M 分子標記;L2 分離菌L2 ; L3 分離菌L3 ;L4 分離菌L4。圖2基于16S rRNA序列的萊茵衣藻藻株cc849的共棲細菌L2、L3和L4的系統(tǒng)發(fā)生學分析。圖3萊茵衣藻cc849與分離菌L2、L3和L4以及根瘤菌共培養(yǎng)的生長狀況。圖4分離菌和根瘤菌對萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的影響。圖5正常培養(yǎng)條件下萊茵衣藻cc849及其與分離菌和根瘤菌共培養(yǎng)的呼吸速率。圖6缺硫產(chǎn)氫條件下萊茵衣藻cc849及其與分離菌和根瘤菌共培養(yǎng)的呼吸速率。圖7最佳產(chǎn)氫條件下純凈萊茵衣藻cc849及其與分離菌和根瘤菌共培養(yǎng)體系上方的氧氣(A)和氫氣(B)含量變化。
具體實施例方式一、萊茵衣藻培養(yǎng)A、選取細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849,購自美國Duke大學衣藻藻種庫;B、培養(yǎng)萊茵衣藻藻種(a)萊茵衣藻培養(yǎng)條件溫度25 士 1°C ;日光燈光照強度100 200微摩爾光量子 /平方米 秒;50 IOOml三羥甲基氨基甲烷-乙酸-磷酸鹽(TAP)培養(yǎng)基液體培養(yǎng),初始 PH7. 2,水平搖床轉速100 130rpm,每5 6天接種繼代培養(yǎng)m ;(b)固體平板TAP培養(yǎng)基瓊脂粉1. 5% ;挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種,每2至3周繼代一次;C、萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件使用氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅制備缺硫TAP培養(yǎng)基(簡稱TAP-S)[5];將生長至對數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min,收集藻細胞并用缺硫培養(yǎng)基洗3次,懸浮在缺硫培養(yǎng)基內,分別裝入培養(yǎng)管,培養(yǎng)瓶上方留IOml的空CN 間,用翻口橡皮塞密閉;黑暗條件下培養(yǎng)M小時;然后放在光照強度60微摩爾光量子/平方米·秒連續(xù)光照件下培養(yǎng),溫度25士 1°C ;每M小時進行氣體成分和含量檢測一次;用氣相色譜儀測定氫氣和氧氣含量分子篩型號5X1/8,柱長2m,內徑3mm,熱導檢測器TCD,以氬氣作為載氣,柱溫50°C,進樣溫度200°C,熱導檢測溫度300°C;測氣體的組成和含量;二、細菌的分離、純化、鑒定和培養(yǎng)A、衣藻共棲細菌的分離、純化和培養(yǎng)取不同生長時期染菌的衣藻培養(yǎng)液lmL,用無菌雙蒸水稀釋10人10_2、10_3三個濃度梯度,依次涂布于TAP培養(yǎng)基、TAP+大腸桿菌培養(yǎng)基LB (TAP培養(yǎng)基[7]和LB培養(yǎng)基[8]按照1 1的體積比混合)和YEM培養(yǎng)基M的固體平板上,分別置于25°C、28-30°C和37°C 的溫度下培養(yǎng),待有菌落長出來后,挑取單菌落于相應的液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。B、細菌的分子鑒定(a)、細菌基因組的制備取對數(shù)生長期菌液2mL,加入無菌離心管中,12,OOOr/ min離心5min。棄上清,向裝有細菌沉淀的離心管中加入300 μ L10mg/mL溶菌酶,溫育2小時。然后依次加入 15 μ L 10mg/mLRNAase,30y L 20mg/mL 的蛋白酶 K,100 μ L 10%SDS,混勻,65°C保溫45分鐘至澄清。再加入125 μ L 5Μ NaCl和100 μ L 10% CTAB,65°C溫育30分鐘,充分裂解細胞和去除多糖。然后按照提取DNA常規(guī)步驟用苯酚抽提、無水乙醇沉淀DNA, 最后將DNA溶解于純水中備用。(b)、引物設計根據(jù)文獻選取細菌16S rDNA基因擴增的通用引物 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGAC TT-3 ‘)(合成于上海生物工程公司)進行PCR擴增[14]。(c)、PCR反應體系與條件PCR采用50 μ L體系,LATaq酶(Takara),反應條件為 94°C預變性 5min ;94°C變性 60s,55°C退火 lmin,72°C延伸 Imin 30s, 30 個循環(huán);72°C延伸 15min。PCR產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化。(d)、PCR產(chǎn)物測序和克隆純化后的PCR產(chǎn)物送華大基因生物科技有限公司進行測序。同時,純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T Vector(Takara)連接,然后轉化到大腸桿菌 DH5 α細胞保存,并提取重組質粒進行目的片段測序的驗證。(e)、16S rRNA系統(tǒng)發(fā)生學分析上述測序得到的16S rDNA基因序列提交 GenBanK,用 BLAST 軟件(http//www. ncbi. nlm. nih. gov)與已知序列進行對比,用 ClustalX V2. 0軟件進行排列,利用MEGA5. 05軟件采用Maximum-Likehood方法繪制系統(tǒng)進化樹并確定它們的系統(tǒng)發(fā)生學地位。三、慢生大豆根瘤菌的培養(yǎng)慢生大豆根瘤菌(B. japonicum)購于中國農(nóng)業(yè)科學院,正常培養(yǎng)條件是^°C,黑暗培養(yǎng),水平搖床轉速200r/min,培養(yǎng)基是YEM(pH 7. 2)[15],固體培養(yǎng)基含2%瓊脂,每3周繼代一次保種。四、細菌和萊茵衣藻cc849共培養(yǎng)方法A、正常條件下的共培養(yǎng)方法純凈的萊茵衣藻cc849在正常TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期中后期,將藻細胞密度調整為lX107cells/mL。每一種細菌培養(yǎng)至對數(shù)后期,分別4000g離心5分鐘,用TAP培養(yǎng)
6基洗三遍去除YEM培養(yǎng)基,然后重懸于TAP培養(yǎng)基中。分別將每種細菌的濃度調整至0D_ 為1. 0。然后將30mL藻液與2mL細菌分別在IOOmL的三角瓶中混合,培養(yǎng)條件為溫度25°C, 光照強度60 μ πιοΙπΓ、-1。以純凈的萊茵衣藻cc849作為對照,培每天取ImL藻液,顯微鏡下觀察衣藻7天內的生長情況。B、產(chǎn)氫條件下的共培養(yǎng)方法取對數(shù)生長中后期的衣藻培養(yǎng)液,5000r/min離心5min,收集細胞。收集后的藻細胞用全缺硫的培養(yǎng)基(TAP-幻洗三次,然后懸浮在TAP-S中,測定其葉綠素濃度,按照每管 0. 5mg葉綠素的量分裝在50mL的培養(yǎng)瓶內,同時將每種細菌的濃度調整為0D_為1,分別按照藻液菌液(體積比)為8 1 20 1 80 1 200 1、400 1的比例加入每管藻液中,最后用TAP-S補充至40mL,密封,黑暗M小時呼吸耗氧以誘導氫酶的表達。然后放在連續(xù)光照(eOymol.n^.s—1)的條件下培養(yǎng),每隔M小時用微量進樣器抽取瓶中氣體,用高壓氣相色譜儀(GC)測定氫氣和氧氣的含量。從而得出最佳產(chǎn)氫量的菌液和藻液的體積比例。五、衣藻的生長情況以及光合和呼吸速率檢測A、生長情況檢測每天取ImL藻液,用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下數(shù)藻細胞數(shù)。B、光合和呼吸速率的檢測在衣藻培養(yǎng)過程中,每天取樣上下充分混勻后取2ml的藻液加入Hanstech Dff/1 型氧電極儀的反應杯中,暗適應5分鐘,記錄反應杯中溶解氧下降的速率,即為呼吸耗氧速率;然后在不同光照條件下,記錄反應杯中溶解氧上升的速率,即為光合放氧速率。數(shù)據(jù)分析后按照下列公式計算,即為呼吸速率V = S · K · 60 · 1000/P其中v為吸氧活性,單位是ymolA -mg^Chl化―1,S為曲線的斜率,單位是mirT1, K為常數(shù),表示25°C下水中的溶氧量,單位是ymol02/ml,P為樣品的葉綠素濃度,單位是 mgChl/ml,60表示60min,1000表示記錄紙的滿量程為1000。實施例1萊茵衣藻培養(yǎng)萊茵衣藻生長速度快、培養(yǎng)成本低、氫化酶活性高,是微藻光合制氫的代表物種。 為了使實驗因容易操作,本發(fā)明優(yōu)選細胞壁缺欠型的萊茵衣藻藻種cc849。①萊茵衣藻正常培養(yǎng)條件按照Harris主編的《The Chlamydomonas Sourcebook :a comprehensive guide to biology and laboratory use. New York Academic Press. 1989》,優(yōu)選條件 25 士 1 °C,日光燈光照強度(100 200ymol photons HT2S4);液體培養(yǎng)是在 50 lOOmlTris-Acetate-Phosphate (TAP)培養(yǎng)基,初始 pH7. 2,水平搖床轉速100 130rpm,每5 6天接種繼代培養(yǎng);固體TAP平板培養(yǎng)基含1. 5%的瓊脂粉,藻種的保存和純化是挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上,每3 周繼代一次。②萊茵衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)條件按照Melis等(Plant Physiology. 2000,122 127-136)的方法,萊茵衣藻的產(chǎn)氫培養(yǎng)是在缺硫培養(yǎng)基(TAP-S)中進行。缺硫培養(yǎng)基 (TAP-S)是把正常的TAP培養(yǎng)基的硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鋅分別換為等摩爾濃度的氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅。本發(fā)明為了將來在工業(yè)化生產(chǎn)中應用,有目的的簡化了其產(chǎn)氫培養(yǎng)的操作步驟即將生長至對數(shù)期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min,收集藻細胞并用TAP-S培養(yǎng)基洗3次,然后懸浮在TAP-S或者含有不同濃度硫酸鹽的TAP-S 培養(yǎng)基內,分別裝在50ml的培養(yǎng)瓶內,培養(yǎng)瓶上方留IOml的空間,用翻口橡皮塞塞緊培養(yǎng)瓶密閉培養(yǎng)。放在黑暗條件下培養(yǎng)M小時,然后放在連續(xù)光照件下培養(yǎng),光照強度50 IOOymol photons IrT2iT1,溫度25 士 1°C。每M小時用微量氣密進樣器抽取瓶中氣體,進行氣體成分和含量檢測。③按照冉春秋等(高等學校化學學報,2006,27 :62-66.)的方法用GC測定氫氣和氧氣含量。氣相色譜儀為Agilent Technologies GC 7890A,USA,分子篩5 X 1/8 (OD),柱長2m,內徑3mm,熱導檢測器TCD,以氬氣作為載氣。進樣體積0. 5ml,柱溫50°C,進樣溫度 200°C,熱導檢測溫度300°C。用本領域技術人員公知的外標法計算氫氣和氧氣體積。實施例2衣藻共棲細菌的分離和鑒定①衣藻共棲細菌的分離、純化和培養(yǎng)取不同生長時期染菌的衣藻培養(yǎng)液lmL,用無菌雙蒸水稀釋10人10_2、10_3三個濃度梯度,依次涂布于TAP培養(yǎng)基、TAP+大腸桿菌培養(yǎng)基LB (TAP培養(yǎng)基[7]和大腸桿菌LB培養(yǎng)基M按照1 1的體積比混合)和YEM培養(yǎng)基M的固體平板上,分別置于25°C、28-30°C 和37°C的溫度下培養(yǎng),待有菌落長出來后,挑取單菌落于相應的液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。利用TAP+LB、YEM和TAP三種培養(yǎng)基平板,初步對與萊茵衣藻cc849共棲的細菌進行分離,結果在TAP+LB混合培養(yǎng)基上分離得到兩種不同特征的單菌落,分別命名為L2和 L3 ;在YEM培養(yǎng)基上分離得到一種單菌落,命名為L4。②細菌的分子鑒定分別提取三種細菌基因組DNA作為底物,分別用通用引物27F和1492R進行PCR 擴增,所得PCR產(chǎn)物分別為單一條帶(如圖1所示),經(jīng)電泳、回收純化后測序,分別對每株細菌的16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物測序,發(fā)現(xiàn)L2、L3和L4的16S rRNA基因序列在GeneBank 中分別與嗜麥芽寡食單胞菌菌株776、微桿菌菌株591和假單胞菌菌株A8的16S rRNA基因序列具有較高的相似性,相似度分別達99%、100%和99% (如圖2所示)。實施例3細菌與萊茵衣藻cc849共培養(yǎng)的生長情況萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫的第一階段是衣藻在正常TAP培養(yǎng)基中的營養(yǎng)生長階段,以獲得最大生物量的積累。在此階段,分別將上述分離得到的細菌L2、L3、L4和根瘤菌按照 2ml 30ml的菌藻體積比與純凈的萊茵衣藻cc849混合培養(yǎng),以純凈萊茵衣藻cc849為對照,每天檢測培養(yǎng)液的藻細胞數(shù)(如圖3所示),結果顯示萊茵衣藻cc849與上述細菌分別共培養(yǎng)時,其生長的時間動態(tài)趨勢與純凈萊茵衣藻cc849的相似,細胞數(shù)都在培養(yǎng)的第四天達到最大,分別約為 3. 67X IO7 個 /mL、3. 48X IO7 個 /mL、2. 90X IO7 個 /mL 和 3. 50X IO7 個/mL,純凈的萊茵衣藻cc849約為3. 56 X IO7個/mL。此結果表明L4菌明顯抑制萊茵衣藻的生長,使細胞數(shù)降低了約18. 5%,是在萊茵衣藻培養(yǎng)中應該盡量避免污染的細菌。根瘤菌和其它兩種細菌對萊茵衣藻的生物量積累無顯著影響。實施例4分離菌和根瘤菌對萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫的影響萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫技術的第二階段是在缺硫培養(yǎng)基中的光合產(chǎn)氫培養(yǎng)階段,分別上述三株分離菌L2、L3、L4和根瘤菌按照不同的體積比與萊茵衣藻cc849混合,在產(chǎn)氫條件下共培養(yǎng)并連續(xù)檢測產(chǎn)氫量的差別(如圖4所示)。結果表明這些細菌對衣藻產(chǎn)氫量的影響與藻菌的體積比有關。當細菌的濃度為0D_ = 1、萊茵衣藻cc849的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L時,在適當?shù)脑逡壕?體積比)組合下都使衣藻的產(chǎn)量顯著增加,尤其是衣藻與根瘤菌按照100 1的體積比共培養(yǎng)條件下,產(chǎn)氫量是純凈萊茵衣藻cc849單獨培養(yǎng)產(chǎn)氫量的5. 5倍,約為82. 95 μ mol ;其次是分離菌L2和L4在藻液菌液(體積比) 為80 1時,氫氣積累量達到約60. 16 μ mol和62. 66 μ mol,是純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的4. 0和4. 1倍;分離菌L3對衣藻產(chǎn)氫的促進作用較小,它在藻液菌液(體積比)為 200 1時,氫氣累積量最大,約為43. 83 μ mol,為純凈萊茵衣藻cc849產(chǎn)氫量的2. 9倍。結果表明,在產(chǎn)氫培養(yǎng)條件下,上述分離菌和根瘤菌、尤其是根瘤菌在適當?shù)谋壤履茱@著提高衣藻的產(chǎn)氫積累量,可以在兩步法衣藻產(chǎn)氫技術的第二階段引入衣藻培養(yǎng)體系以促進萊茵衣藻產(chǎn)氫量的提高。實施例5藻菌共培養(yǎng)體系的光合放氧和呼吸耗氧在正常TAP培養(yǎng)基和光照條件下,純凈萊茵衣藻cc849分別與分離菌L2、L3、L4 和根瘤菌按照anl 30ml的菌藻體積比混合共培養(yǎng),但是用氧電極法檢測不到光合放氧現(xiàn)象,只能檢測到呼吸耗氧速率。如圖5所示,在7天連續(xù)培養(yǎng)中的前3天,純凈萊茵衣藻 cc849的呼吸速率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢,在第三天達到最低,約為4. 22 μ mol O2. mg^chl. h"1, 之后又略有回升,但基本穩(wěn)定在4. 46 4. 49 μ mol O2. mg—chl. h—1之間。當衣藻cc849分別與上述細菌共培養(yǎng)后,培養(yǎng)體系的呼吸耗氧速率均明顯地呈現(xiàn)一直升高的趨勢,尤其是與根瘤菌共培養(yǎng)體系的呼吸速率最高,最高達到5. 940 μ mol O2. mg—chl. h—1,提高了 32%, 與L2、L3和L4共培養(yǎng)體系的最高呼吸速率分別為5. 514 μ mol O2. mg^chl. 310 μ mol O2. mg^chl. IT1 和 5. 609 μ moIO2. mg^chl. tT1,分別提高了 23%、18%禾口 25%和。此結果表明這些細菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)時,均顯著加速了培養(yǎng)體系內的呼吸耗氧速率。在缺硫培養(yǎng)基中,即兩步法產(chǎn)氫技術的第二階段,上述細菌分別與萊茵衣藻cc849 共培養(yǎng)的體系中仍然檢測不到光合放氧現(xiàn)象,但呼吸速率均非常顯著地升高。如圖6所示, 在產(chǎn)氫培養(yǎng)的第一天,藻菌共培養(yǎng)體系的呼吸速率均呈現(xiàn)最高值,與根瘤菌共培養(yǎng)體系的呼吸速率最高,約為34. 80 μ mol O2. mg^chl. h—1,提高了約5. 0倍之多,與L2、L3和L4共培養(yǎng)體系的呼吸速率分別約為 30. 80 μ mol 02.mg_1chl.r\26. 80 μ mol O2. mg-1chl. IT1 禾口 32. 27 μ mol O2. mg^chl. h—1,分別提高了 6. 6倍、5. 7倍和6. 9倍。在產(chǎn)氫培養(yǎng)的第二天,藻菌共培養(yǎng)液的呼吸速率開始迅速下降,下降了約39% 43%,到第三天時候降到零。在這一過程中,純凈的萊茵衣藻cc849的呼吸速率維持在5. 89 μ mol O2. mg^chl. IT1 6. 58 μ mol
Hig-1Chl. h—1。此結果表明呼吸耗氧速率的顯著增加是藻菌共培養(yǎng)體系產(chǎn)氫量提高的重要原因。實施例6最佳產(chǎn)氫條件下藻菌混合培養(yǎng)體系中的氫氣和氧氣含量在兩步法產(chǎn)氫技術的第二階段,將萊茵衣藻cc849分別與上述各細菌按照產(chǎn)氫量最大的體積比混合,進行產(chǎn)氫培養(yǎng)。各體系中培養(yǎng)管上方的氧氣含量和氫氣含量的時間動態(tài)變化如圖7所示。圖7A顯示所有藻菌共培養(yǎng)體系中的氧氣含量都明顯快速降低,基本都在培養(yǎng)的第三天就降到了最低值,約為5. 7% 6. 4%,并保持在這一水平。與根瘤菌共培養(yǎng)體系的氧氣含量更是在共培養(yǎng)后的第一天就降到約6. 2 %,后期一直保持在4% 5%。 而純凈萊茵衣藻cc849在這一培養(yǎng)過程中的氧氣含量下降緩慢,直到培養(yǎng)的第六天才逐漸降到最低,約為7.6%,并保持在這一較高的水平。相對應的,與根瘤菌共培養(yǎng)體系的氫氣積累量最高(如圖7B所示),達到約83 μ mol,比純凈萊茵衣藻cc849體系的高約4. 5倍,與L2和L4共培養(yǎng)體系的最高氫氣積累量達到約60. 1 61. 5 μ mol,比純凈衣藻體系的高約4倍;與L3共培養(yǎng)體系的最大氫氣積累量略低,約為44. Oumol,比純凈衣藻體系的高約 3倍。此結果表明,根瘤菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)最利于產(chǎn)氫作用,本發(fā)明分離純化得到的嗜麥芽寡食單胞菌菌株776、假單胞菌菌株A8和微桿菌菌株591對促進衣藻產(chǎn)氫代謝的作用則依次次之。參考文獻[1]Hemschemeier A, Melis A, Thomas Happe. Analytical approaches to photobiological hydrogen production in unicellular green algae. Photosynthesis Research. 2009,102 :523-540[2]韓志國,李愛芬,龍敏南,韓博平.微藻光合作用制氫-能源危機的最終出路 [J].生態(tài)科學· 2003,22 ) :104-108.[3]吳雙秀,王全喜.衣藻生物制氫的研究進展[J].中國生物工程雜志.2006, 26(10) :88-92.[4]Happe T,Mosler B,Naber J D. Induction,isolation and characterization metal content of hydrogenase in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. European Journal of Biochemistry. 1994, 222 :769-774.[5]Melis, A. , Zhang, L. , Forestier, Μ. , Ghirardi, Μ. L. , Seibert, Μ. ,2000. Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.Plant Physiol. 122,127—136.[6]趙亞蘭,尉亞輝,等.豆血紅蛋白的研究進展.西北植物學報.2000, 20 (4) 684-689[7]Harris Ε. H. , The Chlarmydomonas Sourcebook -.a comprehensive guide to biology and laboratory use, Academic Press, New York,1989.[8]Russell, David W. ; Sambrook, Joseph (2001). Molecular cloning :a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y :Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN 0-87969-576-5.[9] Regensburger B. , Meyer L. , FUser M. , Weber J. , Studer D. , Lamb J. W., Fischer H. -M. , Hahn Μ. , and Hennecke H. . Bradyrhizobium japonicum mutants defective in root-nodule bacteroid development and nitrogen fixation, Arch Microbiol. 1986,144 :355-366.
權利要求
1.一種在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)兩步法產(chǎn)氫技術中提高產(chǎn)氫量的方法,其特征在于將好氧細菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1的方法,其中所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849。
3.根據(jù)權利要求1的方法,其中所述好氧細菌選自嗜麥芽寡食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株 776、 微桿菌(Microbacterium paraoxydans)菌株591、假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株A8和慢生大豆根瘤菌 (Bradyrhizobiumjaponicum)。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項的方法,其中在兩步法產(chǎn)氫技術的第二階段中將好氧細菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)。
5.根據(jù)權利要求4的方法,其中所述好氧細菌為慢生大豆根瘤菌,在共培養(yǎng)體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為OD6tltl = 1、萊茵衣藻的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L,藻液與菌液的體積比為100 1。
6.根據(jù)權利要求4的方法,其中所述好氧細菌為嗜麥芽寡食單胞菌菌株776或假單胞菌菌株A8,在共培養(yǎng)體系中好氧細菌的濃度為0D_ = 1、萊茵衣藻的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L,藻液與菌液的體積比為80 1。
7.根據(jù)權利要求4的方法,其中所述好氧細菌為微桿菌菌株591,在共培養(yǎng)體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為OD6tltl = 1、萊茵衣藻的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L,藻液與菌液的體積比為200 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制氫技術,具體涉及一種利用細菌與萊茵衣藻共培養(yǎng)提高產(chǎn)氫量的方法。將以慢生大豆根瘤菌為代表的一些好氧細菌按一定比例與萊茵衣藻混合培養(yǎng),能顯著提高產(chǎn)氫量。本發(fā)明為萊茵衣藻兩步法產(chǎn)氫技術中進一步提高產(chǎn)氫量提供了一種新方法。
文檔編號C12R1/01GK102559832SQ20121000763
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權日2012年1月11日
發(fā)明者吳雙秀 申請人:中國科學院北京基因組研究所