專利名稱：一種耐高糖高酸的乳酸桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種新型的乳酸桿菌，及其在發酵エ藝中的應用，屬于微生物領域。
背景技術：
乳酸是自然界中最小的手性分子，其結構中含有I個不對稱碳原子，因此具有旋光性，按構型可分為D-乳酸和L-乳酸。L-乳酸為哺乳動物代謝的中間產物，由于人體只能代謝L-乳酸，因此在用于食品及醫藥エ業時必然要用L-乳酸代替D，L-乳酸。而L-乳酸最具應用潛カ的是生產聚乳酸(PLA)，制造生物可降解塑料。近年來，人們對D-乳酸、L-乳酸及其衍生物的理化性能和生理活性有了深入的了解，在手性藥物、手性溶剤、生物農藥及功能性材料等領域拓寬了乳酸對映體的應用范圍，市場對高光學純度的乳酸需求也不斷増加。微生物發酵法是目前乳酸生產的主要方法。雖然發酵法乳酸生產技術在日益進歩，但是仍存在乳酸發酵糖轉化率低，發酵周期長，生成乳酸濃度低，光學純度不夠等，這與乳酸發酵菌在高糖高酸條件下發酵效能低有夫。“高產L-乳酸干酪乳桿菌的選育及發酵條件研究”(秦浩、張偉國、葛向陽、康傳利《食品エ業科技》2011年07 Si)記載以ー株產L-乳酸的干酪乳桿菌G-02為出發菌，采用硫酸ニこ酯(DES)和亞硝基胍(NTG)進行誘變，選育出一株L-乳酸發酵活力較強的菌株G-04。實驗結果表明在適當的發酵條件下，該菌株可積累L-乳酸濃度達到188g/L，糖轉化率大于90%，發酵周期小于44h。但是該菌種糖轉化率仍然偏低，影響產品的質量，發酵周期偏長，設備的利用率不高。CN02145142 發明公開了一 種嗜熱乳酸桿菌(Lactobacillusthermophilus)(SNGBL100),保藏號為CGMCC No. 0784和采用該菌種發酵生產L-乳酸的方法，此發明的菌種(SNGBL100)，L-乳酸的轉化率在93_95%，L-乳酸的純度在97_99%。該發明中L-乳酸的轉化率偏低，光學純度偏低。

發明內容
本發明的目的在于提供一種耐高糖高酸的乳酸桿菌，能有效地提高乳酸的光學純度及糖轉化率和產酸率，并縮短發酵周期。本發明的目的是通過以下措施實現的
ー種乳酸桿菌，其分類命名為Lactobacillus sp.，保藏登記號為CCTCC NO: M2012090。形態特點細胞桿狀，(2. 0-9. O) umX (O. 5-0. 8)um,單個或者短鏈，瓊脂平板上菌
落小，扁平。生理理化特點革蘭氏陽性，不運動，能利用葡萄糖等單糖生成L-乳酸，生長溫度為 52-55 0C ο上述乳酸桿菌采用如下方法制備將德氏乳酸桿菌作為出發菌進行誘變育種，高糖高酸條件下篩選馴化，得到所述乳酸桿菌。上述誘變育種是指采用6tlCtl r射線誘變德氏乳酸桿菌。上述的高糖高酸是指酸的濃度為17g/l -21g/l，糖的濃度為150g/l_220g/l。上述乳酸桿菌能利用單糖生產L-乳酸。上述乳酸桿菌，其特征在于所述單糖為葡萄糖。上述乳酸桿菌可應用于發酵生產乳酸。
本發明的乳酸桿菌Lactobacillus sp.的保藏日期是 2012年3月23日，保藏編號是CCTCC NO M 2012090，保藏單位是中國典型培養物保藏中心。有益效果
本發明提供的乳酸桿菌在特定的高酸，高糖的環境下經過反復馴化篩選，對高酸高糖環境具備了良好的耐受性，體內積累了能夠抵御高酸高糖環境的特殊物質，用以調節體內的滲透壓以維持菌體的完整，并對菌體自身的生理調節機制產生特定的影響，避免乳酸根離子對菌種本身生長的抑制，從而提高糖轉化率和乳酸生成率，并改善L-乳酸的光學純度，其中糖轉化率不低于95 %，L-乳酸的光學純度不低于99. 3 %，且縮短發酵周期，節約時間和成本。本發明的乳酸桿菌在大規模生產時仍能保持良好的生理生化功能和高發酵效，適合于工業化生產。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步說明本發明，但本發明不局限于這些實施例。實施例I本發明提供的乳酸桿菌的制備方法。一.材料與方法
1.菌種德氏乳酸桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)(實驗室保藏菌種，自命名F-AlO)
2.培養基配方和培養條件
分離檢測培養基一GYP培養基葡萄糖I. 0g，酵母膏I. Og,蛋白胨O. 5 g,肉汁浸膏
O.2g, NaAc ·3Η20 O. 2g，MgS047H20 20mg，MnS044H20 lmg, FeS047H20 lmg，NaCl lmg，吐溫80分析純0. 5ml,瓊脂I. 2g，CaCO30 0. 5g,水100ml ;培養條件溫度121 °C，培養時間20min。種子培養基配方(單位g/l):葡萄糖50，酵母膏10，蛋白胨10，肉汁浸膏O. 2，NaAc · 3H20 O. 5，MgS047H20 O. 2，MnS044H20 O. 01，FeS047H20 0. 01 NaCl 0. 01 ;培養條件PH=4. 0-5. 0，溫度 121 °C，培養時間 20min。發酵培養基配方(單位g/l):葡萄糖200，硫酸銨I. 44，磷酸氫二鉀O. 08，磷酸二氫鉀O. 08，酵母膏O. 2 ;培養條件PH=4. 0-5. 0，溫度121°C，培養時間20min。耐高酸酸性培養基配方(單位g/l):在GYP培養基的基礎上，添加如下濃度的L-乳酸(g/1) 17,18,19,20,21,22o3. 葡萄糖濃度和L一乳酸的測定采用山東科學院生物研究所研制的BA — 40Ε生物傳感儀測量。體積是有電子液位計顯示。轉化率的計算體積X產酸+葡萄糖量X 100%。L-乳酸的光學純度采用ΧΤΥ-ΑΗ3000高效液相色譜檢測儀檢測。二.制備方法
I.將德氏乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)(實驗室保藏菌種,自命名F-A10)，制成菌種懸浮液(菌種含量為IX IO6個/ ml)4. 5ml,加入硫酸二乙酯O. 5% (體積t匕)于45°C下震蕩處理5min，再加入75 %硫代硫酸鈉10 ml反應lOmin，稀釋10倍后涂布于含有CaCO3的GYP平板，于54 °C恒溫培養20h ；
GYP平板培養基葡萄糖I.0g，酵母膏I.0g，蛋白胨0.5 g，肉汁浸膏0.2g，NaAc · 3H20 O. 2g, MgS047H20 20 mg，MnS044H20 I mg, FeS047H20 lmg, NaCl I mg,，吐溫80 分析純 0. 5ml,瓊脂 I. 2 g, CaCO30 0. 5g,水 100ml ；
2.挑選單個，菌落小而透明圈大的菌落接種于麥芽汁CaCO3試管斜面上54°C培養；
3.將培養好的試管菌種制成懸浮液(含量為10個/ml) 20ml,置于25ml比色管中于6tlCtl r射線下照射，劑量為800-1200Gy，照射后的懸浮液稀釋成10_4，取O. Iml涂平板，于54°C溫度下培養12-16h，該平板為不同乳酸濃度的CaCO3的GYP培養基平板；
4.4-1.耐高酸菌種的選育
將經過誘變后的菌株F-AlO用種子培養基活化18h后，于無菌環境下進行梯度稀釋并涂布于不同乳酸濃度的GYP培養基上，54°C培養20h。結果如表I。由表I可知，出發菌株經過誘變后，在不同乳酸濃度的酸性培養基中表現出不同的生長情況，隨著乳酸濃度的遞增，培養基上的菌落逐漸減少，21%的乳酸濃度是誘變后菌株的臨界乳酸耐受濃度，在21%的酸性平板上挑選優勢菌落作為目的菌落。表I
權利要求
1.一種乳酸桿菌，其分類命名為Lactobacillus sp.，保藏登記號為CCTCC NO: M2012090。
2.如權利要求I所述乳酸桿菌，其特征在于采用如下方法制備將德氏乳酸桿菌作為出發菌進行誘變育種，高糖高酸條件下篩選馴化，得到所述乳酸桿菌。
3.如權利要求2所述乳酸桿菌，所述誘變育種是指采用6tlCtlr射線誘變德氏乳酸桿菌。
4.如權利要求2所述乳酸桿菌，所述篩選馴化的高糖高酸條件下是指酸的濃度為17g/I_21g/l，糖的濃度為 150g/l-220g/l。
5.如權利要求I所述乳酸桿菌，其特征在于能利用單糖生產L-乳酸。
6.如權利要求5所述乳酸桿菌，其特征在于所述單糖為葡萄糖。
7.如權利要求I所述乳酸桿菌在發酵生產乳酸中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種耐高糖高酸的乳酸桿菌，其在高糖高酸環境下仍能保持高發酵效能，進而提高糖轉化率和乳酸生成率，并改善L-乳酸的光學純度，且縮短發酵周期，節約時間和成本。當應用于工業化進行大規模生產時，本發明的乳酸桿菌仍能保持良好的生理生化功能和高發酵效，適合于工業化生產。
文檔編號C12N1/20GK102676429SQ201210144510
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者劉海濤, 劉鋒, 張亞巍, 李進, 程小龍 申請人:劉海濤, 劉鋒, 張亞巍, 李進, 程小龍