專利名稱：一種提高酶熱穩定性的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高酶熱穩定性的方法，特別是ー種利用雙親短肽融合表達提高重組酶的熱穩定性的方法。
背景技術：
雙親短肽是具有親水和親油能力的小分子肽，廣泛存在于膜蛋白及脂肪代謝相關酶類的結構中。其雙親的特點能夠幫助酶分子與疏水性底物結合、實現酶分子的定位等。生物活性酶在エ業生產中具有廣泛的應用，而提高酶的熱穩定性是エ業酶的研究重點之一。目前，提高酶熱穩定性的方法主要包括I.定向進化通過定點突變，隨即突變，飽和突變等技術，篩選得到熱穩定的突變株；2.從嗜熱微生物中篩選熱穩定性的酶。但是，這些方法并不適用于所有酶分子熱穩定性改造中。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種提高酶熱穩定性的方法，通過在重組酶的N端或C端融合表達雙親短肽實現酶熱穩定性的提高。為解決上述技術問題提供如下技術方案第一歩雙親短肽基因的獲得根據雙親短肽的氨基酸序列，化學合成相應的DNA序列，并將其克隆至大腸桿菌表達質粒pET-22b (+)的Nde I和Nco I酶切位點之間上，構建成為pET_22b (+) /AP質粒；第二步融合雙親短肽的重組酶表達質粒的構建將重組酶基因克隆至pET_22b(+)/AP質粒的Nco I和Hind III位點之間。構建成為表達融合雙親短肽的重組酶表達質粒pET-22b (+) /AP-enzyme。第三步融合雙親短肽的重組酶表達菌株的構建將重組質粒pET_22b (+)/AP-enzyme 轉化宿主大腸桿菌(E. coli BL21(DE3)),構建高效表達目的酶的誘導型大腸桿菌基因工程菌。菌株經培養表達目的酶的方法為培養基組成(g/L)種子培養基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5 ；發酵培養基將下列組分溶解在O. 9L水中蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油
zHnL ο ;各組分溶解后高壓滅菌；冷卻到60 °C，再加IOOmL滅菌的170mmol/LKH2P04/0. 72mol/LK2HP04 的溶液(2. 31g 的 KH2PO4 和 12. 54gK2HP04 溶在足量的水中，使終體積為IOOmL ;高壓滅菌或用O. 22 μ m的濾膜過濾除菌)；培養方法種子培養，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養溫度37°C，搖床轉速200r/min，培養12h ;發酵培養，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養溫度37°C，當OD6tltl達到O. 6吋，將培養溫度降為16°C，同時加入終濃度為I. OmM的誘導劑IPTG。目的酶熱穩定的測定方法將目的酶分別應用疏水層析、離子交換層析等分離手段，得到電泳純的目的酶。將目的酶在一定溫度下保溫，測定酶活相比初始末保溫時損失50%所需要的時間(T1/2)。本發明提供了一種提高酶熱穩定性的方法，應用雙親短肽融合表達重組酶能夠提高目的重組酶的熱穩定性。該方法具有效果顯著、エ藝簡單、便于推廣。本發明為快速提高エ業酶熱穩定性提高了新的方法和思路。
具體實施例方式
以下通過實施例來進ー步闡明本發明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。材料和方法所用限制性內切酶，T4DNA連接酶，PCR試劑，DNA Marker等均購于TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態細胞E. coli JM109，引物，質粒提取試劑盒，PCR產物純化試劑盒均購于上海生エ生物工程公司。實施例I :雙親短肽的氨基酸序列并克隆至質粒pET_22b (+)I AEAEAKAKAEAEAKAK2. VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR3. DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADffLKAFYDKVAEKLKEAF4. DffLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDffLKAFYDKVAEKLKEAF5. DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDffLKAFYDKVAEKLKEAF6. DffLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADffLKAFYDKVAEKLKEAF按照以上氨基酸序列通過化學合成DNA序列，并克隆至質粒pET_22b (+)等到質粒pET-22b(+)/AP實施例2 :重組質粒pET_22b (+) /AP-enzyme的構建將目的酶基因克隆至表達載體pET_22b(+)/AP的Nco I和Hind III位點。連接產物轉化感受態大腸桿菌JM109進行轉化。轉化方法如下(I)無菌狀態下取感受態細胞200 μ L置于無菌的微量離心管中；(2)每管加入1-2 μ L重組質粒，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min ；(3)42°C熱休克90s (準確)，不要搖動離心管；(4)快速將離心管轉移至冰浴中，使細胞冷卻l_2min ；(5)每管加入無抗生素的普通LB培養液800 μ L ;(6)用無菌鋪菌器將200 μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板,37°C平放20min直至液體被吸收，然后倒置培養過夜，觀察。挑選陽性轉化子，測序驗證，結果表明連接成功。實施例3 :融合雙親短肽的重組酶表達菌株的構建感受態大腸桿菌BL21(DE3)進行轉化。轉化方法如下(I)無菌狀態下取感受態細胞200 μ L置于無菌的微量離心管中；(2)每管加入1-2 μ L重組質粒，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min ；(3)42°C熱休克90s (準確)，不要搖動離心管；
(4)快速將離心管轉移至冰浴中，使細胞冷卻l_2min ；(5)每管加入無抗生素的普通LB培養液800 μ L ;(6)用無菌鋪菌器將200 μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板,37°C平放20min直至液體被吸收，然后倒置培養過夜，觀察。挑選陽性轉化子，提取質粒驗證，證明轉化成功。實施例4 :發酵生產融合雙親短肽的脂肪氧合酶 脂肪氧合酶基因序列如Genebank NO:PAl 19所示,根據實施例2，實施例3所述方法得到融合雙親短肽的重組脂肪氧合酶的表達菌株，以該菌株作為種子發酵生產重組脂肪氧合酶。培養基組成(g/L)種子培養基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5。發酵培養基將下列組分溶解在O. 9L水中蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60 °C，再加IOOmL滅菌的170mmol/LKH2P04/0. 72mol/LK2HP04 的溶液(2. 31g 的 KH2PO4 和 12. 54g K2HPO4 溶在足量的水中，使終體積為100mL。高壓滅菌或用O. 22 μ m的濾膜過濾除菌)。培養方法種子培養，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養溫度37°C，搖床轉速200r/min，培養12h ;發酵培養，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養溫度37°C，當OD6tltl達到O. 6吋，將培養溫度降為16°C，同時加入終濃度為I. OmM的誘導劑IPTG，發酵24h。將發酵液15000rpm離心IOmin得到菌體,將菌體溶解于150mM Tris-Hcl,pH 7. 5的緩沖液中，并依次通過疏水層析、離子交換層析得到電泳純的重組酶。在50°C下測定重組酶的熱穩定性，如表I所示表I.融合雙親短肽提高脂肪氧合酶的熱穩定性，以未融合雙親短肽的為對照
對照[1 Γ 2 Γ 3 I' 4 I 56 '
Tl/2min(50°C ) 10 18 39 38 22 ' 252 _ 187 '實施例5 :發酵生產融合雙親短肽的堿性淀粉酶以實施例2，實施例3所述方法得到融合雙親短肽的重組堿性淀粉酶的表達菌株，以該菌株作為種子發酵生產重組堿性淀粉酶。堿性淀粉酶基因序列如GenebankN0:HV220894. I 所示。培養基組成(g/L)種子培養基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5。發酵培養基將下列組分溶解在O. 9L水中蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60 °C，再加IOOmL滅菌的170mmol/LKH2P04/0. 72mol/LK2HP04 的溶液(2. 31g 的 KH2PO4 和 12. 54gK2HP04 溶在足量的水中，使終體積為100mL。高壓滅菌或用O. 22 μ m的濾膜過濾除菌)。
培養方法種子培養，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養溫度37°C，搖床轉速200r/min，培養12h ;發酵培養，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養溫度37°C，當OD6tltl達到O. 6吋，將培養溫度降為16°C，同時加入終濃度為I. OmM的誘導劑IPTG，發酵24h。將發酵液15000rpm離心IOmin得到菌體,將菌體溶解于150mM Tris-Hcl,pH 7. 5的緩沖液中，并依次通過疏水層析、離子交換層析得到電泳純的重組酶。在50°C下測定重組酶的熱穩定性，如表2所示表2.融合雙親短肽提高堿性淀粉酶的熱穩定性，以未融合雙親短肽的為對照
權利要求
1.一種提高酶熱穩定性的方法，其特征在于將雙親短肽與重組酶進行融合表達。
2.權利要求I所述的方法，其特征在于所述雙親短肽融合在重組酶的N端或者C端。
3.權利要求I所述的方法，其特征在于雙親短肽的序列為I) AEAEAKAKAEAEAKAK ；或 2) VNYGNGVSCSKTKCSVNWGQAFQERYTAGTNSFVSGVSGVASGAGSIGRR ；或 3) DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVEPLRADffLKAFYDKVAEKLKEAF ；或 4) DffLKAFYDKVAEKLKEAFGLLPVLEDffLKAFYDKVAEKLKEAF ；或 5) DffLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDffLKAFYDKVAEKLKEAF ； 或 6DWLKAFYDKVAEKLKEAFNGGARLADWLKAFYDKVAEKLKEAF ;中的一種。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于優選雙親短肽的序列為DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDffLKAFYDKVAEKLKEAF。
全文摘要
本發明公開了一種提高酶熱穩定性的方法，通過將雙親短肽與重組酶進行融合表達獲得熱穩定性的提高的重組酶。其中優選的雙親短肽的序列為DWLKAFYDKVAEKLKEAFKVQPYLDDWLKAFYDKVAEKLKEAF。該方法具有效果顯著、工藝簡單、便于推廣。本發明為快速提高工業酶熱穩定性提高了新的方法和思路。
文檔編號C12N9/02GK102660570SQ201210145190
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉松, 堵國成, 張娟, 陸信曜, 陳堅 申請人:江南大學