專利名稱：一種采用自克隆工程菌高效發(fā)酵生產(chǎn)l-山梨糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種高效發(fā)酵生產(chǎn)L-山梨糖的方法，特別是一種采用自克隆工程菌提高細胞膜上山梨醇脫氫酶活性來強化山梨醇氧化脫氫途徑，從而調(diào)控山梨醇快速化地導向目標代謝產(chǎn)物山梨糖的方法。
背景技術：
L-山梨糖，一種己酮糖，為D-果糖的C-2位和C-3位差向異構體。是エ業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)維生素C(VC)的中間體，目前エ業(yè)上主要用“萊氏法”和“兩步發(fā)酵法”生產(chǎn)VC，ニ法初始均經(jīng)發(fā)酵將D-山梨醇轉化為L-山梨糖。其中，以D-山梨醇為底物的發(fā)酵エ藝是唯一用于、エ業(yè)生產(chǎn)的方法，但是現(xiàn)有技術發(fā)酵周期長，導致生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品質(zhì)量不易控制。國內(nèi)外關于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-山梨糖的研究主要集中于對發(fā)酵條件的優(yōu)化和控制，但是簡單的發(fā)酵優(yōu)化并不能很好地縮短發(fā)酵周期等，代謝工程作為ー種理性的菌種改造方法能夠更加有效地實現(xiàn)目標產(chǎn)物的高產(chǎn)。雖然，目前采用代謝工程手段來強化L-山梨糖積累的研究鮮有報道，但是鑒于山梨醇脫氫酶(sldh)是Gluconobacter oxydans ATCC621H將D-山梨醇轉化為山梨糖的關鍵酶，強化這一途徑，應該能夠使D-山梨醇高效脫氫氧化為L-山梨糖，從而成為進ー步強化G. oxydans 621H生產(chǎn)山梨糖時表現(xiàn)的有效策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種采用自克隆工程菌高效發(fā)酵生產(chǎn)L-山梨糖的方法，其通過過量表達山梨醇脫氫酶基因，強化山梨醇氧化脫氫的代謝途徑，實現(xiàn)L-山梨糖的過量積累。以下是本發(fā)明技術方案的詳細描述。目的基因sldh擴增與表達質(zhì)粒的構建根據(jù)Genbank: NC_006677. I所示山梨醇脫氫酶基因，通過化學全合成方法獲得山梨醇脫氫酶基因，再酶切連接到到含卡那霉素(Kan)抗性標記基因的質(zhì)不立 pBBRlMCS-2(Four new derivatives of the broad-host-range cloning vectorpBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes),得至丨J 表達載體pBBRlMCS-2-sldh。過量表達sldh的G. Oxydans 621H重組菌的篩選將重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2-sldh經(jīng)電激法轉化G. oxydans ATCC 62IH感受態(tài)細胞，將能在山梨醇培養(yǎng)基+Ceporex+Kan平板上生長的菌落,在山梨醇+Ceporex+Kan平板上連續(xù)轉接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組子。挑取陽性重組子若干提基因組，利用引物sldh-F和sldh-R進行PCR驗證，得到大約9. 2kb的片段，表明sld基因已成功整合到G. oxydans ATCC621H基因組中，所得重組菌命名為G. oxydans 621H_sldh。該菌在以山梨醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長時，山梨醇脫氫酶活性有了顯著提高，是出發(fā)菌株的I. 33倍。微生物菌株的種子培養(yǎng)與發(fā)酵
種子培養(yǎng)基山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，自來水定容至1し發(fā)酵培養(yǎng)基山梨醇250g，酵母膏2g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，自來水定容至1し種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌溫度為115-121° C，15min。將實驗菌株接種到種子培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液50mL，溫度為30° C，轉速200rpm，培養(yǎng)時間為20_24h。按15%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，500mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為50mL,30° C、200rpm條件下每批培養(yǎng)36h。細胞干重的測定取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加2mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸I丐，加入去離子水定容至IOmL,搖勻,用UV 7500型可見分光光度計,于600nm處比
色測OD值，用細胞干重標準曲線算得細胞干重。D-山梨醇與L-山梨糖濃度的測定高效液相色譜(HPLC)儀器=Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、示差折光檢測器和エ作站)。色譜柱AminexHPX-87H (Bio-Rad)；流動相0.005mol/L H2SO4 ；流速0.6mL/min ；柱溫35°C ；進樣量5yL;檢測器為示差折光檢測器。樣品制備500 μ L發(fā)酵液在8000rpm下離心lOmin，取上清液250 μ L移入5mL容量瓶中，超純水定容至刻度線，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。本發(fā)明提供的自克隆工程菌能以山梨醇唯一碳源，過量積累L-山梨糖。在發(fā)酵36h后，與出發(fā)菌株節(jié)相比將發(fā)酵時間縮短了 12h。這ー調(diào)節(jié)微生物細胞中山梨醇脫氫途徑，促進代謝流快速流向代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)代謝產(chǎn)物過量積累的策略，為エ業(yè)生物技術特別是采用代謝工程手段改造菌株來提高目的產(chǎn)物的生成提供了新的技術思路。
具體實施例方式實施例I重組菌G. oxydans 621H_sldh的構建及鑒定通過化學全合成法合成sldh基因，并將其克隆到表達載體ppBBRlMCS-2。構建好的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切分析，并進行DNA測序。基因測序結果與預期一致，表明重組質(zhì)粒構建正確。將重組質(zhì)粒ppBBRlMCS-2-sldh利用電激法轉化G. oxydans 621H感受態(tài)細胞，將能在山梨醇培養(yǎng)基+Ceporex+Kan平板上生長的菌落,在山梨醇+Ceporex+Kan平板上連續(xù)轉接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組子。挑取陽性重組子若干提基因組，進行PCR驗證，得到大約9. 2kb的片段，表明sldh基因已成功整合到G. oxydans 621H基因組中。所得重組菌命名為G. oxydans621H_sldh。該菌在以山梨醇為卩隹ー碳源的培養(yǎng)基上生長時，山梨醇脫氫酶活性顯著提高，是出發(fā)菌株的I. 33倍。其中山梨醇培養(yǎng)基山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，固體培養(yǎng)基添加20g瓊脂。
山梨醇+Ceporex+Kan平板山梨醇培養(yǎng)基+IOOmg頭孢霉素+IOOmg卡那霉素，固體培養(yǎng)基添加20g瓊脂。
實施例2重組菌G. oxydans 621H_sldh底物濃度的優(yōu)化根據(jù)G. oxydans 621H-sldh的培養(yǎng)特性，以不同初始濃度的山梨醇為碳源進行發(fā)酵實驗，并相互比較，根據(jù)實驗結果和原料成本綜合考慮，當山梨醇添加量為250g/L吋，山梨糖的生產(chǎn)強度最高，エ藝的經(jīng)濟指標最優(yōu)，此時山梨糖的產(chǎn)量達225g/L。實施例3山梨醇為唯一碳源時重組菌與對照菌發(fā)酵特性的比較以山梨醇為唯一碳源，發(fā)酵36h后，重組菌和對照菌相比(I)重組菌中山梨醇脫氫酶的活性提高了 I. 33倍；(2)以山梨醇為唯一碳源，發(fā)酵36h后，L-山梨糖產(chǎn)量達到225g/L，與出發(fā)菌株節(jié)相比將發(fā)酵時間縮短了 12h。過量表達sldh基因有效地加快了山梨醇脫氫步驟的速度，使L-山梨糖快速生成并過量積累。可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發(fā)明所附的權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種采用自克隆工程菌高效發(fā)酵生產(chǎn)L-山梨糖的方法，其特征在于以氧化葡萄糖酸桿菌工程菌為生產(chǎn)菌株，接種到種子培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液50mL，于30° C、200rpm條件下培養(yǎng)20-24h ;按15%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30° C，200rpm條件下培養(yǎng)36h ;所述氧化葡萄糖酸桿菌工程菌過量表達外源山梨醇脫氫酶基因，其構建方法為通過化學全合成方法獲得Genbank:NC_006677. I所示山梨醇脫氫酶基因，克隆到表達載體pBBRlMCS-2，進一步轉化氧化葡萄糖酸桿菌獲得自克隆基因工程菌。
2.根據(jù)權利要求書I所述的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基組成為山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO3 2g，pH 4. 8-5. 1，自來水定容至 1L。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基組成為山梨醇250g，酵母膏2g，CaCO3 2g，pH4. 8-5. 1，自來水定容至 1L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用自克隆工程菌高效發(fā)酵生產(chǎn)L-山梨糖的方法，屬于采用代謝工程調(diào)控策略優(yōu)化發(fā)酵過程技術領域。本發(fā)明采用代謝工程的手段，獲得自克隆氧化葡萄糖酸桿菌工程菌，以其為生產(chǎn)菌株，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化使山梨醇脫氫酶的活性提高了1.33倍；(2)以山梨醇為唯一碳源，發(fā)酵36h后，L-山梨糖產(chǎn)量達到225g/L，與出發(fā)菌株節(jié)相比將發(fā)酵時間縮短了12h。本發(fā)明通過調(diào)控山梨醇脫氫途徑，成功實現(xiàn)了山梨醇快速化地導向目標代謝產(chǎn)物山梨糖的目的。為今后利用代謝工程手段改造菌株促進目標產(chǎn)物過量積累提供了一定的借鑒意義。
文檔編號C12N15/53GK102660599SQ201210145148
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權日2012年5月10日
發(fā)明者周景文, 堵國成, 王小北, 陳堅 申請人:江南大學