專利名稱：一種唾液乳桿菌及其凍干制劑與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別涉及一株豬源唾液乳桿菌菌株及其凍干制劑與應用。
背景技術：
動物腸道內存在著約30個屬500多種微生物，相互依賴，相互競爭，共同維持著腸道的微生態平衡。但長期以來，抗生素作為飼料添加劑的大量使用，在抑制和殺滅病原菌的同時也抑殺了動物機體內正常共生的菌群，使腸道長期處于失衡狀態，對動物的健康甚至人類的健康構成直接的威脅。因此，加速開發安全、優質、高效的綠色飼料添加劑已迫在眉 睫。近年來的科學研究發現，在飼料中添加益生菌活菌制劑可以起到促進動物生長、抑制病原菌繁殖及提高機體免疫能力等功能，該類添加劑也越來越受到人們的關注。目前，美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協會(AAFCO)公布了可以直接飼喂的微生物菌種有43種，我國對飼用微生物的研究起步較晚，可飼用菌種較少，農業部1126號公告中公布的允許使用的菌種僅有16種，因此，研究開發新型的益生菌菌種有著廣闊的應用前景。研究表明，同源性菌群對宿主的益生作用優于異源菌群(Timmerman等，2006)，即理想的菌株應該來自同種動物的消化道，同時，作為益生菌菌株還必須具有生長速度快，產酸能力強以及較強的耐胃酸、耐腸膽鹽等特性，這樣才能保證益生菌能夠以足夠活菌含量到達動物腸道后并快速生長繁殖，凈化腸道環境，真正發揮其益生作用。依據上述篩選原貝U，本發明分離得到一株性能優良的乳酸桿菌-唾液乳桿菌，目前，國內關于唾液乳桿菌的研究主要集中于人類發酵食品方面，而作為動物飼用方面的報道較少，本發明對該菌進行了分離篩選、增殖培養、凍干工藝制備及動物應用試驗等系統的研究，從而驗證了其高效性和實用性，并為益生菌菌種的開發和推廣應用奠定基礎。

發明內容
本發明提供一株乳桿菌，該乳桿菌生長、產酸、耐酸耐膽鹽等性能優良，并提供適合該菌株的凍干保護劑配方從而制備得到凍干制劑，使其能夠應用于實際動物飼料中，并充分發揮其優良益生菌作用。一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株，名稱為唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius ZLS006，其保藏號為=CGMCC No. 5761。本發明還提供一種唾液乳桿菌凍干制劑，其特征在于采用所述的唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius ZLS006 菌株，其保藏號為=CGMCC No. 5761。所述唾液乳桿菌活菌數為3. 5 X 109cfu/g。本發明還提供了所述唾液乳桿菌凍干制劑的制備方法，包括如下步驟將唾液乳桿菌菌種進行發酵培養，得到發酵液，將所述發酵液離心分離菌體，得到菌泥，向所述菌泥中加入凍干保護劑，混勻、凍干，即得到所述唾液乳桿菌凍干制劑。
所述發酵培養的培養基由如下質量百分比的物質組成以MRS培養基為基礎，其中蛋白胨0. 6 I. 2%，酵母浸粉0. 3 0. 6%，牛肉膏0. 6 I. 2%，葡萄糖I. 6 2. 2%。所述發酵培養的培養基優選為由如下質量百分比的物質組成以MRS培養基為基礎，其中蛋白胨I. 0%，酵母浸粉0. 6%，牛肉膏I. 2%，葡萄糖I. 6%。所述發酵培養的接種量為1% 3%，發酵溫度為37°C，發酵時間為20 24h。所述發酵培養的發酵罐的裝液量為50%，培養轉速為100r/min，pH6. 5，罐壓維持在0. 05MPa ;發酵結束后，采用管式離心機19000rpm連續離心，收取菌泥，加入凍干保護劑，凍干保護劑體積與離心前發酵液體積相等，混勻，置于凍干機中凍干23h，收取凍干粉。所述凍干保護劑由如下重量百分比的物質組成12%脫脂乳，5%糊精，2%聚乙烯吡咯烷酮，4%乳糖，0. 1%谷氨酸鈉，0. 1%半胱氨酸，0. 3%乙酸鈉，其余為水。所述唾液乳桿菌的凍干制劑在動物飼料添加劑中的應用也屬于本發明的保護范圍。其中動物包括但不限于豬、牛、羊、雞等動物，其優選豬。本發明還提供一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)凍干保護劑，由如下重量百分比的物質組成12 16%脫脂乳，5 10%糊精，2 4%聚乙烯吡咯烷酮，4飛％乳糖，0. I 0. 5%谷氨酸鈉，0. I 0. 5%半胱氨酸，0. 3 0. 8%乙酸鈉，其余為水。本發明所提供的唾液乳桿菌(LactobaciIIus salivarius)凍干保護劑,優選為由如下重量百分比的物質組成12%脫脂乳、5%糊精、2%聚乙烯吡咯烷酮、4%乳糖、0. 1%谷氨酸鈉、0. 1%半胱氨酸和0. 3%乙酸鈉，其余為水。本發明從健康仔豬盲腸黏膜分離篩選得到一個唾液乳桿菌菌株，保藏號為CGMCCNo. 5761。該菌株能夠提高豬群飼料轉化效率；增加豬群糞便中有益菌活菌數，降低有害菌含量，并具有刺激機體特異性免疫應答，加強機體免疫力的功能，是優良的益生菌候選材料。基于對唾液乳桿菌在動物腸道中的益生功能，為了使唾液乳桿菌在動物飼料中得到良好的應用并充分發揮其益生菌的作用，本發明提供了一種制備唾液乳桿菌凍干制劑的保護劑配方。該凍干菌保護劑對唾液乳桿菌的凍干保護率達到85. 16% ;使其在常溫保存3個月后，菌存活率達到80. 35%。本發明進一步提供了制備唾液乳桿菌凍干制劑的方法，特別是中式生產的參數。本發明提供的菌劑在動物飼喂試驗中發揮出優良的益生作用，見實施例2的數據。由于本發明提供的唾液乳桿菌凍干制劑，雖然僅僅對豬做了試驗，但是由于該菌種廣泛存在于動物腸道的有益乳酸桿菌，因此，該菌凍干制劑在動物飼料中都可以添加，并不限于添加于豬飼料中。生物保藏存活信息存活菌株命名唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius ZLS006保藏號CGMCCNo. 5761保藏日期2012年02月16日保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101
具體實施方法實施例I、豬源優良乳桿菌的制備I. I豬源乳酸菌的分離、篩選及鑒定仔豬剖殺，無菌刮取黏膜lg，置于盛有9ml無菌生理鹽水的帶有玻璃珠的三角瓶中，充分震蕩搖勻，然后吸取1.0ml菌液于盛有9. Oml無菌生理鹽水的試管中，此稀釋度為10—1，重復以上過程，依次制成10_2、10' 10_4、10_5、10_6的菌液。選擇10_4、10_5、10_6三個稀釋度，吸取0. Iml菌液分別滴于MRS培養基平板上，置于厭氧罐中于37°C培養24 48h，挑取形態不同的菌落在MRS培養基上劃線接種做純培養，而后置于4°C冰箱保存備用。 然后挑取純培養物進行染色，鏡檢，選取無芽孢革蘭氏陽性桿菌進行接觸酶、硝酸鹽還原、明膠液化等生化實驗，以及糖醇發酵試驗，結果與《常見細菌系統鑒定手冊》、《乳酸細菌分類及實驗方法》對照，以初步確定乳酸菌屬，經試驗，初步篩選出80株乳酸菌。菌株是決定乳酸菌制劑使用效果的關鍵因素，其中，菌株生長速度快可以使得菌株到達腸道后能夠快速生長繁殖，而產酸則可以達到抑制有害菌，凈化腸道環境的效果，另夕卜，益生菌在進入腸道后還應具有較強的耐胃酸、耐腸膽鹽性能，以保證乳酸菌能夠以足夠活菌數到達腸道而真正發揮益生作用。依據上述篩選原則，本發明對80株菌進行生長、產酸及耐酸耐膽鹽抗逆性試驗，篩選出一株性能優良的乳酸菌菌株，篩選結果見表I。(I)生長試驗篩選菌株活化后，接種于MRS液體培養基中，培養24h后取一定量菌液測定OD6tltol值，以不接菌為對照，觀察菌株生長性能；(2)產酸試驗菌株活化后，接種于含有溴甲酚藍指示劑的MRS液體培養基中，分別培養24、48h測定OD45tlnm值，通過菌株產酸使培養基顏色變黃而使OD45tol值變化來判定菌株產酸情況；( 3 )耐酸耐膽鹽性能試驗菌種活化后，接種于MRS液體培養基中培養24h，取3ml發酵液于3000rpm離心5分鐘，加入3ml含有0. 2%膽鹽pH=3的液體培養基中，保溫2h，而后以10%接種于新鮮培養基中保溫4h，測定OD6tltlnm值，觀察菌株耐酸耐膽鹽性能。 經過篩選，Y29生長OD6tltol值、產酸OD45tlnm值、及耐酸耐膽鹽抗逆性能較好，因此，確定此菌為目的菌株，送至確定菌種為并送至中國工業微生物菌種保藏中心進行鑒定檢驗。具體結果如下中國工業微生物菌種保藏管理中心對該乳酸桿菌為豬源唾液乳桿菌(Lactobacillus saliarius)的鑒定結果為該豬源唾液乳桿菌生理生化特征如表2所示，其分子生物學鑒定結果見表3和序列表I。將該菌株于2012年02月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101)進行了保藏，菌株名稱為唾液乳桿菌Lactobacillussalivarius ZLS006，其保藏號為 CGMCC No. 5761。表I乳酸菌篩選試驗結果
權利要求
1.一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株，名稱為唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius ZLS006，其保藏號為=CGMCC No. 5761。
2.—種唾液乳桿菌凍干制劑，其特征在于采用權利要求I所述的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株。
3.權利要求2所述的唾液乳桿菌凍干制劑的制備方法，包括如下步驟 將唾液乳桿菌菌種進行發酵培養，得到發酵液，將所述發酵液離心分離菌體，得到菌泥，向所述菌泥中加入凍干保護劑，混勻、凍干，即得到所述唾液乳桿菌凍干制劑。
4.根據權利要求3所述的方法，所述發酵培養的培養基由如下質量百分比的物質組成以MRS培養基為基礎，其中蛋白胨0. 6 I. 2%，酵母浸粉0. 3 0. 6%，牛肉膏0. 6 I. 2%，葡萄糖I. 6 2. 2%o
5.根據權利要求4所述的方法，所述發酵培養的接種量為19T3%，發酵溫度為37°C，發酵時間為20 24h。
6.根據權利要求5所述的方法,所述發酵培養的發酵罐的裝液量為50%,培養轉速為100r/min, pH6. 5,罐壓維持在0. 05MPa ;發酵結束后,采用管式離心機19000rpm連續離心，收取菌泥，加入凍干保護劑，凍干保護劑體積與離心前發酵液體積相等，混勻，置于凍干機中凍干23h，收取凍干粉。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述凍干保護劑由如下重量百分比的物質組成12%脫脂乳，5%糊精，2%聚乙烯吡咯烷酮，4%乳糖，0. 1%谷氨酸鈉，0. 1%半胱氨酸，0.3%乙酸鈉，其余為水。
8.權利要求2所述唾液乳桿菌凍干制劑在動物飼料添加劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述動物指豬。
10.一種唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)凍干保護劑，由如下重量百分比的物質組成12 16%脫脂乳，5 10%糊精，2 4%聚乙烯吡咯烷酮，4 6%乳糖，0. 1 0. 5%谷氨酸鈉，0. I 0. 5%半胱氨酸，0. 3 0. 8%乙酸鈉，其余為水。
全文摘要
本發明公開了唾液乳桿菌及其凍干制劑與應用，涉及動物益生菌菌株及其凍干制劑。本發明所提供的唾液乳桿菌名稱為唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius ZLS006，其保藏號為CGMCC No.5761。本發明還提供了一種由唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius ZLS006制備得到的凍干制劑，該凍干制劑經試驗證明能夠提高豬群飼料轉化效率，增加豬群糞中乳酸菌活菌數，降低大腸桿菌含量，并具有提高機體免疫力的作用。
文檔編號C12N1/20GK102660478SQ20121014458
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉輝, 單達聰, 季海峰, 張董燕, 王四新, 王晶, 王雅民 申請人:北京市農林科學院