專利名稱：一株大豆抗原蛋白降解菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物領域，涉及一株大豆抗原蛋白降解芽孢桿菌菌株及其在發酵豆柏生產中的應用。
背景技術：
豆柏是一種優質的植物蛋白飼料，具有蛋白含量高，氨基酸組成合理，動物對其利用率高的特點。近年來又發現大豆中含有豐富的提高動物免疫力的大豆異黃酮等物質，更是受到人們的歡迎。但是豆柏中存在的大豆抗原蛋白是一種熱穩定性抗營養因子，嚴重影響到仔豬等幼齡動物的機體健康和生長速度，表現為小腸結構受損，食糜滯留時間縮短，營養物質的轉運、吸收紊亂，導致消化不良、腹瀉和生長受阻。現已確定仔豬對大豆抗原蛋白的過敏反應是引起仔豬腹瀉的主要原因之一。如何降低和去除豆柏中的大豆抗原蛋白，進而提高豆柏的營養價值和安全性成為飼料工作者研究的熱點。大豆抗原蛋白的熱穩定性強，是大豆中對動物(特別是幼齡動物)影響最大的一類抗營養物質。在去除豆柏中大豆抗原蛋白的方法中，利用生物酶處理豆柏效果較好，但是成本較高，而微生物發酵法作為一種無害的、高效的、低成本的處理方法成為目前處理豆柏的一種趨勢。但是從目前市場來看，質量良莠不齊，同一產品質量不穩定，是發酵豆柏產品的主要問題。這主要是由于發酵用的菌種性能不穩定，產酶能力不高，針對性差等原因所導致。因此獲得能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白、高產蛋白酶和性能穩定的菌株是生產質量穩定的發酵豆柏，提高豆柏的營養價值和安全性的基礎。

發明內容
本發明的目的就是針對豆柏中存在的大豆抗原蛋白會引起仔豬腹瀉和生長受阻 這一問題，提供一株能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白的高產蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株。本發明生產的菌株能夠降解豆柏中的大豆抗原蛋白，降低其對仔豬的抗營養作用，提高豆柏在仔豬飼料中的應用價值。本發明的另一個目的在于提供該枯草芽孢桿菌菌株在發酵豆柏中的應用。本發明是通過以下技術方案實現的
一株大豆抗原蛋白降解菌株，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(feci77i/5· subtil is)HN013，已于2012年2月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 5788。所述的枯草芽孢桿菌菌株的個體形態特征為細胞大小通常為(0.7μπι
O.8 μ m) X (2. O μ m 3. O μ m),桿狀,很少成連,無莢膜,芽孢呈橢圓形或柱形，中生或偏生。菌落形態為規則圓形，白色，表面濕潤，中間隆起，邊緣光滑。所述的枯草芽孢桿菌菌株的主要生理生化特性為革蘭氏反應陽性，接觸酶陽性，能發生乙酰甲基甲醇反應；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖產酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；培養溫度20°C 40°C，最適生長溫度23°C 25°C，pH6 8，最佳pH7. 2。產蛋白酶能力較高，達到539. 5 U/mL。該菌株的16 S rDNA序列全長共1463 bp,經Genbank比對相似性達至Il 99. 8% 確定為枯草芽孢桿菌。有益效果
本試驗通過初篩、復篩，最終得到一株能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白的高產蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株HN013，對其生物學特性和產蛋白酶能力進行了研究，并在發酵豆柏中的得到了成功應用。該菌株能夠降解豆柏中的大豆抗原蛋白，降低其對仔豬的抗營養作用，提高豆柏在仔豬飼料中的應用價值。具體實施例方式實施例I枯草芽孢桿菌subti I is) HNO13菌株的獲得
I、培養基
富集培養基牛肉膏3g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水lOOOmL，調節pH至7. 2 ;初篩培養基牛肉膏3 g，酪素10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水lOOOmL，調節pH至7. 2 ;種子培養基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g, KH2PO4 I g, MgSO4 0. 2 g, Na2CO3 10 g,蒸懼水IOOOmL,調節pH至7. 2 ;發酵培養基豆柏40 g，蒸餾水IOOOmL,調節pH至7. 2 ;固體斜面培養基葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母膏5 g，KH2PO4 I g，MgSO4 0· 2 g，Na2CO3 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水IOOOmL,調節pH至7. 2 ;
分離培養基(以大豆抗原蛋白為唯一氮源)的制備粉碎過60目篩的豆柏樣品5g,以
0.03mol/L pH 8. 8 的 Tris-HCl 緩沖液(含 0. 01mol/L 亞硫酸鈉)按 I 20 (ff/V, g/mL)料液比浸提。37°C下，180r/min提取I h，取出，將pH值調回8. 8。再置搖床180r/min提取I. 5 h, 8000r / min離心20min,取上清并調pH至4. O,上清渾池,4000r/min離心5min,棄去上清。用蒸懼水溶解沉淀，調pH至 · 2,加上2. 5g葡萄糖、NaCl 0. 2g、K2HPO4 0. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 2g，加蒸餾水定容至 1000mL，加瓊脂 15g，115°C滅菌 20min。2、菌株的分離純化
取10 g遼寧錦州地區長期存放豆柏的土壤置于已加入90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，漩渦混合儀上震蕩2min，靜止30min，80°C水浴加熱20min，殺死營養細胞。取IOmL所得液加入到IOOmL富集培養基中，25°C，160r/min搖床培養24h。用無菌生理鹽水對富集培養后的菌液進行梯度稀釋至10_4，分別取10_2、10_3、10_4稀釋液各0. ImL涂布于分離培養基平板上，25°C培養24 h,挑選出不同菌落形態的革蘭氏陽性菌接入固體斜面培養基中，置于25°C培養箱中培養24h，放入4°C冰箱中保藏，待篩選。、3、產蛋白酶菌株的初篩
大試管(2.0 cmX 20 cm)內裝5 mL富集培養基，分別接入上述分離菌株，25°C條件下160 r/min旋轉搖床培養48 h,發酵液經3500r/min離心后，以0. 5 cm直徑圓形濾紙片沾上清液貼于初篩培養基平板上，于25°C保溫24 h，形成蛋白酶水解圈，然后用直尺測蛋白酶水解圈直徑，選出水解圈直徑和菌落直徑的比值(R/r)大于3的菌株。4、搖瓶發酵試驗復篩高產蛋白酶的菌株
將初篩得到的菌株經斜面活化后，接一環于種子培養基中，25°C條件下160 r/min振蕩培養12h，按5%的接種量轉接至發酵培養基中，25°C繼續振蕩培養48 h，3500 r/min離心30min，取上清液測蛋白酶活力。采用Folin-酚法測定蛋白酶的活力。酶活定義1 mL酶液在pH 7. 2、40°C下，每分鐘水解酪蛋白產生Iyg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位，以“U /mL”表示。篩選酶活力大于538. O U/mL的菌株。5、菌種鑒定通過菌體的群體形態觀察、個體形態觀察、生理生化試驗結果及菌株的16 S rDNA序列對菌株進行菌種鑒定。經產蛋白酶能力的初篩、復篩最終得到I株能夠降解豆柏中大豆抗原蛋白的高產蛋白酶枯草芽孢桿菌菌株，通過菌體的群體形態觀察、個體形態觀察、生理生化試驗結果及菌株的16 S rDNA序列比對，確定該菌株為芽孢桿 菌科芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌(feci77心subtilis)mQn,已于2012年2月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院，中科院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 5788。實施例2枯草芽孢桿菌subti I is) HNO13在發酵豆柏中的應用
I、試驗材料
(1)普通豆柏；
(2)枯草芽孢桿菌UaciBm種子培養液；枯草芽孢桿菌Al (本實驗室保藏，一株發酵豆柏生產菌株，作為對照菌)種子培養液。2、試驗方法
豆柏粉碎后過10目篩，過篩后的豆柏與水按1:1 (ff/V, g/mL)混合均勻，分為3組，接種量為水體積的5%。I組為空白對照，加入蒸餾水5% ；2組為枯草芽孢桿菌Al對照組，加入Al種子培養液5% ；3組為試驗組，加入枯草芽孢桿菌subtiHsmQU種子培養液5% ;分別混合均勻，于25°C密閉條件下培養48h。3、指標測定
(1)發酵樣品抗原蛋白殘留率測定發酵結束后，將各組樣品在50°C烘箱中烘干。每種樣品各稱取I. OO g，加入20 mL O. 03 mo I / L的Tris — HCl抽提緩沖液研磨勻漿，修正各樣品pH值為8.0，浸泡I h后離心(轉速8000 r / min，時間10 min)去渣，調節上清液pH值為4. 5,離心(轉速10 000 r / min,時間15 min),上清液干燥稱重即為各樣品中抗原蛋白的質量，抗原蛋白的殘留率按下式計算
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(2)三氯乙酸可溶性氮(TCA-NSI)含量的檢測參考QB/T2653— 2004大豆肽粉，用于評定大豆蛋白的降解程度。4、結果
從表I中可以看出，枯草芽孢桿菌(feci77w5· 5^ii7i5·) HN013發酵豆柏后抗原蛋白殘留率最低，與枯草芽孢桿菌Al相比，抗原蛋白殘留率降低87. 4%，說明枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis)\MOl >菌株降解抗原蛋白的能力較強。
權利要求
1.一株大豆抗原蛋白降解菌株，該菌株保藏名稱為枯草芽孢桿菌{Bacillus保藏日期2012年2月24日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5788。
2.根據權利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株，其特征在于，個體形態特征為細胞大小通常為(0. 7iim 0. 8iim)X(2. Oiim 3. Oii m)，桿狀，很少成連，無莢膜，芽孢呈橢圓形或柱形，中生或偏生；菌落形態為規則圓形，白色，表面濕潤，中間隆起，邊緣光滑。
3.根據權利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株，其特征在于，主要生理生化特性為革蘭氏反應陽性，接觸酶陽性，能發生こ酰甲基甲醇反應；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖產酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；培養溫度20°C 40°C，最適生長溫度23。。 25°C，pH6 8，最佳pH7.2 ;產蛋白酶能力較高，達到539.5 U/mL。
4.根據權利要求I所述的ー株大豆抗原蛋白降解菌株的應用，其特征在于，用于發酵豆柏中。
全文摘要
一株大豆抗原蛋白降解菌株(Bacillussubtilis)HN013，該菌株于2012年2月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5788；該菌株具有降解豆粕中大豆抗原蛋白和高產蛋白酶的特性，在發酵豆粕生產中應用可以降低大豆抗原蛋白含量，同時增加發酵豆粕中大豆多肽的含量，提高豆粕的應用價值。
文檔編號C12N1/20GK102660480SQ20121014718
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者張莉力, 王安民, 田玉民, 蘇玉虹, 許云賀, 郭福來, 韓麗娟 申請人:沈陽華年飼料有限公司