專利名稱：一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法
技術領域：
本發明涉及一種尿蛋白提取方法，尤其涉及一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法。
背景技術：
人尿中含有三百多種蛋白質，目前已開發提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑和人尿激肽原酶等，這些組分在臨床上具有重要的治療價值。人尿激肽原酶(Urinary Kallidinogenase,以下簡稱為KN),是從人尿中分離提取的一種由238個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在4左右，分子量約54000D，屬于絲氨酸蛋白酶。它能夠激活人血漿激肽原轉化為激肽。目前，已經被開發成用于治療急性腦梗死的藥物。人尿胰蛋白酶抑制劑(Urinary trypsin inhibitor,以下簡稱為UTI)是一種從人尿中分離純化的由143個氨基酸組成的糖蛋白，等電點在2左右，分子量65000D，具有抑制多種蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；從而抑制炎癥介質的過度釋放；改善微循環和組織灌注。而在機體受到嚴重損傷時起抑制全身性炎癥反應(SIRS)的發生發展、繼而阻斷多臟器功能障礙(MODS)，保護臟器功能等作用。尿蛋白產品目前主要的生產過程是首先，在各地經過尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品經過下游的分離純化和精制，制備尿蛋白原料藥；最后灌裝成品制劑，用于臨床。中國人尿資源非常豐富，依賴于這一有利條件，尿蛋白產業從上世紀七十年代末就已經開始發展起來，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的規模化生產方式主要有兩種，方法一收集尿液，運輸到加工點，用吸附劑吸附尿蛋白，由于尿液來源分散，收集成本高，加上城市衛生改造，收集已經越來越困難；方法二 直接將吸附尿蛋白的樹脂放置在廁所進行連續在線吸附，然后收集吸附后的樹脂運回加工點進行分離純化。這種方法對環境無污染，可以在大中城市進行收集，尿源集中，運輸成本較低，極大地擴大了尿蛋白的收集區域。目前，KN粗品主要按照第一種方法制備，需要首先收集尿液，再用吸附KN的吸附劑單獨對尿液進行吸附處理。尿液中的KN含量低、不穩定、容易降解，導致生產的收率很低、成本很高，后續純化難度大。在采用第二種方法制備KN粗品時，采用高效陰離子吸附劑，放置尿斗或尿池中， 其可以在人尿流經吸附劑的同時，把其中KN和UTI等蛋白有效吸附，從而實現這些尿蛋白的高度富集，再經過集中洗脫、沉淀等步驟得到粗品。該方法中，KN迅速被固定化，大大提高了其穩定性，由于避免了尿液的大規模運輸，也明顯降低了成本。但是，該方法中，由于吸附劑較強的吸附性能，同時吸附了較多蛋白，給下游的純化帶來較大的難度。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均為酸性蛋白，常規的純化方法對其較難分離，影響了 KN的后續純化。

發明內容
發明目的本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種高效分離出尿液中的KN和UTI，便于KN和UTI后續純化的制備人尿激肽原酶粗制品的方法。技術方案為了實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實現二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，包含以下步驟 I)將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白；2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理；3)用O. 5 — I. OM的NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫峰；4)超濾濃縮；5)超濾濃縮液調節pH和電導，上樣已經用平衡液平衡好的金屬螯合親和層析柱，再用平衡液沖洗；6)繼續用洗脫溶液洗脫，收集洗脫峰；7)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 — 10小時后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。可采用離心或者板框過濾收集沉淀。步驟5的金屬螯合親和層析柱，其螯合的金屬離子可以是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。優選Cu2+。步驟5中，金屬螯合親和層析柱平衡液為O. 01 - O. 2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為O — 2M。優選O. 02M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為O. 2M。步驟5中，超濾濃縮液調節pH和電導，pH6 — 9，電導O. 5 — 10mS/cm。優選ρΗ8· 0，電導 2. 2mS/cm ο在步驟5和步驟6之間，增加一個沖洗步驟，使用pH5 — 8，NaCl濃度彡O. 2M的沖洗金屬螯合親和層析柱，所述的沖洗液緩沖介質為O. 01 - O. 2M磷酸鹽或者醋酸鹽。加入低PH沖洗步驟，以提高人尿激肽原酶粗制品粗制品的比活，優選配方為0. IM醋酸一醋酸鈉(PH5. 0),0. IM 氯化鈉。步驟6中，金屬螯合親和層析柱洗脫溶液為O. 01 - O. 2M醋酸一醋酸鈉溶液，PH4. 5 — 2. 8。優選洗脫液配方為20mM醋酸一醋酸鈉(pH3. 8)。在步驟5中，收集上樣和平衡液沖洗穿透，加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 — 10小時后，收集沉淀，制備人尿激肽原酶含量極低的人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品。可采用離心或者板框過濾收集沉淀。有益效果本發明與現有技術相比，其有益效果是I、由于使用了對KN和UTI有高效分離效果的金屬螯合親和層析工藝，實現了兩種蛋白的有效分離，大大降低了兩種產品后續純化的難度；2、實現了兩種蛋白粗制品的聯產，生產成本較低；
3、步驟5與步驟6之間增加一個沖洗步驟，能夠提高KN粗制品的比活；4、利用本發明方法得到的UTI和KN具有以下特性KN粗制品活性大于I. OPNA單位/g粗制品，比活(單位/A28tl)應彡O. 02PNA單位/A28tl, UTI粗制品活性大于3萬單位/g粗制品，比活(單位/A28tl)應> 200單位/A280O


圖I為本發明實施步驟示意圖；圖2為金屬螯合親和層析圖譜，縱坐標為280nm的光吸收，橫坐標為流出溶液體積。
具體實施方式

下面通過實施例對本發明技術方案進行詳細說明，但是本發明的保護范圍不局限于所述實施例。如圖I所示，一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法步驟為將大孔陰離子交換樹脂作為吸附劑，裝入透水性較好的濾布袋內，直接放在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白，一定時間后，收集吸附尿蛋白后的樹脂，集中解析，將洗脫出的尿蛋白溶液通過Cu2+金屬螯合親和層析柱，其中的UTI不吸附，而KN蛋白則結合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實現二者的分離，這樣可以得到UTI粗制品和KN蛋白粗制品。實施例I大孔型陰離子交換樹脂100公斤作為吸附劑，經過再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過樹脂，24小時后，收集吸附尿蛋白的樹脂，將吸附后樹脂用飲用水沖洗干凈，最后裝柱；用O. IM的NaCl進行沖洗，用O. SM的NaCl進行洗脫，收集洗脫峰。用截留分子量30K的超濾膜進行超濾濃縮，將超濾濃縮液調節pH至8. O和電導至2. 2mS/cm,上已經平衡好的金屬離子為Cu2+的金屬螯合親和層析柱(Chelating sepharoseFF);再用平衡液(平衡液配方0. 02M磷酸鹽緩沖，O. 2MNaCl, pH8. O)沖洗金屬螯合親和層析柱，收集上樣穿透液和沖洗穿透液(U液)，用20mM的醋酸一醋酸鈉緩沖液(pH3. 8)洗脫金屬螯合親和層析柱，收集洗脫峰(K液)。U液與K液分別加入硫酸銨粉末，邊加邊攪，至飽和，靜置4小時，U液加入硅藻土80g，K液加入硅藻土 40g，分別用板框過濾收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品190克。KN粗制品95克，詳見表I。從表I中可見，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而98%的KN活性集中在KN粗制品中，二者實現了很好的分離。表I :
I重量(g)~ UTI 含量(U)~IKN 含量(PNA)
UTI 粗制品 1901.21X 107 &KN 粗制品 [95~1.03X 104 [ 75UTI粗制品每克含UTI63000U，比活為250U/A28(I。KN粗制品每克含KNl. 85PNA,比活 O. 016PNA U/A28。。實施例2大孔型陰離子交換樹脂200公斤作為吸附劑，經過再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過樹脂，24小時后，收集吸附尿蛋白的樹脂，將吸附后樹脂用飲用水沖洗干凈，最后裝柱；用O. IM的NaCl進行沖洗；用O. SM的NaCl進行洗脫，收集洗脫峰。用截留分子量30K的超濾膜超濾濃縮，將超濾濃縮液調節pH至8. O和電導至 2. 2mS/cm，上已經平衡好的Cu2+金屬螯合親和層析柱；再用平衡液(平衡液配方0. 02M磷酸鹽緩沖，O. 2M NaCl, pH8. O)沖洗該金屬螯合親和層析柱，收集上樣穿透液和沖洗穿透液(U液)，用O. 2M醋酸一醋酸鈉(O. IM氯化鈉，PH5. O)溶液沖洗金屬螯合親和層析柱后，用20mM的醋酸一醋酸鈉緩沖溶液(pH3. 8)進行洗脫，收集洗脫峰(K液)，圖2為其層析圖譜。U液與K液分別加入硫酸銨粉末，邊加邊攪，至飽和，靜置4小時，U液加入硅藻土160g，K液加入硅藻土 60g，分別用板框過濾收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品412克。KN粗制品135克，詳見表2。從表2中可見，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而98%的KN活性集中在KN粗制品中，二者實現了很好的分離。表2
I重量(g)~ UTI 含量(U)~IKN 含量(PNA)
UTI 粗制品 4122. 35XIO7 5 76
KN 粗制品 1351.81XIO4 303UTI粗制品每克含UTI57000U，比活為226U/A28(I。KN粗制品每克含KN2. 24PNA,比活O. 039PNA UZA2800由于本實施例中增加一個低pH沖洗步驟，明顯提高了 KN粗制品的比活。實施例3大孔型陰離子交換樹脂100公斤作為吸附劑，經過再生處理后，水沖至中性，裝入孔徑為50目的濾布袋中，將裝好樹脂的濾布袋放置在人流量較多的廁所的便斗或便池中，使尿液或被水稀釋后的尿液流過樹脂，24小時后，收集吸附尿蛋白的樹脂，將吸附后樹脂用飲用水沖洗干凈，最后裝柱；用O. IM的NaCl進行沖洗，用O. 5M的NaCl進行洗脫，收集洗脫峰。用截留分子量30K的超濾膜進行超濾濃縮，將超濾濃縮液調節pH至6和電導至
O.5mS/cm，上已經平衡好的金屬離子為Zn2+的金屬螯合親和層析柱；再用平衡液(平衡液配方0. OlM磷酸鹽緩沖液，pH6. O)沖洗金屬螯合親和層析柱，收集上樣穿透液和沖洗穿透液(U液)，用O. OlM磷酸鹽緩沖液(O. 15M氯化鈉，PH8. O)溶液沖洗金屬螯合親和層析柱后，用O.OlM的醋酸溶液(pH2. 8)洗脫金屬螯合親和層析柱，收集洗脫峰(K液)。U液與K液分別加入硫酸銨粉末，邊加邊攪，至飽和，靜置4小時，離心，在U液沉淀中加入硅藻土 80g，K液沉淀中加入硅藻土 40g，得到UTI粗制品192克。KN粗制品86克，詳見表3。從表3中可見，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而約70%的KN活性集中在KN粗制品中。表3
權利要求
1.一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實現二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。
2.根據權利要求I所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于，包含以下步驟 .1)將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池和尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白； .2)收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理； .3)用O.5 — I. OM的NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫峰； .4)超濾濃縮； .5)超濾濃縮液調節pH和電導，上樣已經用平衡液平衡好的金屬螯合親和層析柱，再用平衡液沖洗； .6)繼續用洗脫溶液洗脫，收集洗脫峰； .7)在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2— 10小時后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。
3.根據權利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于步驟5的金屬螯合親和層析柱，其螯合的金屬離子可以是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一種。
4.根據權利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于步驟5中，金屬螯合親和層析柱平衡液為O. 01 - O. 2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為O — 2M。
5.根據權利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于步驟5中，超濾濃縮液調節pH和電導，pH6 — 9,電導O. 5 — 10mS/cm。
6.根據權利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于在步驟5和步驟6之間，增加一個沖洗步驟，使用pH5 - 8，NaCl濃度< O. 2M的沖洗液沖洗金屬螯合親和層析柱，所述的沖洗液緩沖介質為O. 01 - O. 2M磷酸鹽或者醋酸鹽。
7.根據權利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于，步驟6中，金屬螯合親和層析柱洗脫溶液為O. 01 - O. 2M醋酸一醋酸鈉溶液，PH4. 5 — 2. 8。
8.根據權利要求2所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于在步驟5中，收集上樣和平衡液沖洗穿透，加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2 - 10小時后，收集沉淀，制備人尿激肽原酶含量極低的人尿胰蛋白酶抑制劑粗制品。
全文摘要
本發明公開了一種制備人尿激肽原酶粗制品的方法。所述的制備人尿激肽原酶粗制品的方法為吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液通過金屬螯合親和層析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制劑不吸附，而人尿激肽原酶則結合到該金屬螯合親和層析柱上，從而實現二者的分離，收集洗脫峰，制備人尿激肽原酶粗制品。采用該技術方案可以實現尿液中的人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制劑的高效分離，便于人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制劑后續純化處理，提高純化收率；實現了兩種蛋白粗制品的聯產，生產成本較低。
文檔編號C12N9/64GK102660525SQ20121014834
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月15日 優先權日2012年5月15日
發明者池正昌, 蘇古方, 苗丕渠 申請人:揚州艾迪生物科技有限公司