專利名稱：高效降解半纖維素的雜合木聚糖酶基因fsi-a124的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可高效降解半纖維素的雜合木聚糖酶基因/ /12匆。
背景技術(shù)：
木聚糖是自然界中繼纖維素之后第二豐富的再生生物資源，廣泛存在于糠麩、玉米芯、稻草、甘蔗渣和秸桿等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品中。在養(yǎng)殖業(yè)、釀酒工業(yè)和造紙工業(yè)中木聚糖具有副作用，但其也可用于低聚木糖、液體燃料等高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)。木聚糖酶能夠特異性降解木聚糖，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料和造紙等工業(yè)中，深入開展木聚糖酶的研究對(duì)于相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有要作用。在工業(yè)應(yīng)用上，木聚糖酶的理想特性是同時(shí)具有較寬的最適溫度和pH,良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，以及具備較好的底物結(jié)合、水解性能，然而此類理想型的木聚糖酶很難從自然界直接獲取，因此需要利用基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造。木聚糖酶的性質(zhì)取決于酶分子的結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的菌種選育方法難以在短期內(nèi)達(dá)到預(yù)期 目的。因此，開展提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性和底物結(jié)合水解性能的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。微生物產(chǎn)生的木聚糖降解酶系復(fù)雜，同時(shí)分泌多種水解酶。如褐色高溫單孢菌木聚糖酶分泌降解木聚糖的酶包括內(nèi)切木聚糖酶、β -木糖苷酶和阿拉伯木聚糖酶;C thermocellum中包含至少15種纖維素酶基因、兩種木聚糖酶基因和兩種糖苷酶基因。這些酶性質(zhì)相近，有的為同工酶，使得野生型木聚糖酶分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究難度較大。近年來(lái)嗜極端酶成為研究的熱點(diǎn)，直接培養(yǎng)極端微生物來(lái)分離嗜極端酶相當(dāng)困難，而實(shí)現(xiàn)木聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)的必要條件是獲得能大量表達(dá)木聚糖酶的微生物菌株，只有采用分子生物手段構(gòu)建基因工程菌才能使耐熱木聚糖酶的生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。蛋白質(zhì)分子改良是改造酶基因的有效手段，將不同來(lái)源的序列進(jìn)行融合重組，所得到的雜合木聚糖酶有可能集中其親本的優(yōu)良特性。黑曲霉木聚糖酶A {Aspergillusniger xylanase A, AnxA)為G/11家族真核生物來(lái)源的木聚糖酶，比活較高,但熱穩(wěn)定性較差。褐色高溫單孢菌木聚糖酶A (7 fusca xylanase A, TfxA)為原核生物來(lái)源木聚糖酶，是目前G/11家族中熱穩(wěn)定性最好的木聚糖酶之一，但酶比活較低。序列分析表明，TfxA等多數(shù)G/11家族木聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域氨基酸總體同源性較高，但N-末端氨基酸序列同源性很低且在二級(jí)結(jié)構(gòu)單元存在較大差異，這表明TfxA的N-末端結(jié)構(gòu)可能與其較高的熱穩(wěn)定性相關(guān)。目前，已見原核生物來(lái)源木聚糖酶與TfxA雜合提高其熱穩(wěn)定性的研究，但有關(guān)真核生物來(lái)源木聚糖酶與TfxA雜合，以提高其熱穩(wěn)定性和催化活性的研究報(bào)道甚少。本研究采用“半理性”設(shè)計(jì)雜合AnxA和TfxA的N段36個(gè)氨基酸序列，獲得酶活性和穩(wěn)定性提高的雜合木聚糖酶基因atx,之后采用“非理性”設(shè)計(jì)得到催化活性進(jìn)一步提高的突變體基因FSI-A124,并構(gòu)建了能高效表達(dá)突變體基因的重組畢赤酵母工程菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效降解半纖維素的雜合木聚糖酶基因
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種高效降解半纖維素的雜合木聚糖酶基因匆，該基因通過兩個(gè)異源木聚糖酶基因a/沒(GenBank: FJ772090)和 /χ(GenBank: U01242)基因經(jīng)N-端交叉重組得到的雜合基因aix, aix再經(jīng)蛋白質(zhì)體外定向進(jìn)化改造而來(lái);/^/17匆的基因序列和氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所
/Jn ο本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的雜合木聚糖酶FSI-A124獲得了高活性木聚糖酶Anx高的A和高熱穩(wěn)定性木聚糖酶TfxA的雙重優(yōu)良特性，即具有高活性的同時(shí)也具有較穩(wěn)定性。其最適溫度為55°C，最適pH為6. 0，在70°C以下較為穩(wěn)定，其殘余活性均大于60%，可進(jìn)行工業(yè)化加工及生產(chǎn)。


圖I是水解產(chǎn)物木寡糖(X-X5)的保留時(shí)間示意圖；圖2是水解產(chǎn)物木寡糖(X-X5)的含量圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅限于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I. 基因的分子設(shè)計(jì)(半理性設(shè)計(jì))
以TfxA的N-末端的43個(gè)氨基酸殘基取代AnxA中對(duì)應(yīng)區(qū)域的36個(gè)氨基酸殘基構(gòu)建出雜合木聚糖酶基因?yàn)榱吮阌诘谋磉_(dá)，在其5’和3’端分別引入及和AfoiI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 4 所示
EcoRl
Pl (SEQ ID NO. I) :5’ - CG^AATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3，
P2 (SEQ ID NO.2) :5’-TCCAGTATTACGCCAAGAGGTGCTGTAGTTTCC-3’
P3 (SEQ ID NO. 3) :5’-ACCTCTTGGCGTAATACTGGAGATTTTGTCGTTGGTCTG-3’
Notl ；
P4 (SEQ ID N0.4) :5’ _AG(TGGCCGCAGAGGAAATCGTGACACTG-3，。以pBS-Τ/ Λ為模板，Pl和P2為引物擴(kuò)增A片段，得到約100 bp的條帶，A片段的理論長(zhǎng)度為136 bp ;以pBS-T/a/^r模板，P3和P4為引物擴(kuò)增B片段，得到約500 bp的條帶，B片段的理論長(zhǎng)度為474 bp。再以A和B為模板，Pl和P4為引物，PCR擴(kuò)增得到雜合木聚糖酶基因得到約600 bp的條帶，的理論長(zhǎng)度為573 bp。雜合木聚糖酶基因atx的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，并割膠回收目的條帶。對(duì)擴(kuò)增得到的eitx進(jìn)行核苷酸測(cè)序分析,aiz全長(zhǎng)573 bp ο實(shí)施例2. 基因的分子改良(非理性設(shè)計(jì))
采用定向進(jìn)化技術(shù)，對(duì)a 基因進(jìn)行分子改良，獲得優(yōu)勢(shì)突變體FSI-A124。在易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上,通過降低退火溫度來(lái)進(jìn)一步增加錯(cuò)配率，回收目的產(chǎn)物，與表達(dá)載體相連接，之后轉(zhuǎn)化萬(wàn).coli BL21 (DE3)獲得突變體庫(kù)。通過IPTG誘導(dǎo)宿主菌表達(dá)木聚糖酶，在96微孔板上篩選活性改良的突變體，并對(duì)突變體進(jìn)行分析。具體實(shí)施如下
(I)易錯(cuò)PCR構(gòu)建突變庫(kù)
利用DE-atxF和DE-atxR引物，擴(kuò)增pBST/aix模板。引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ IDNO. 6所示
DE-atxF (SEQ ID NO.5) :5’ -CGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3’ DE-atxR (SEQ ID NO.6) :5’ -AGCGGCCGCAGAGGAAATCGTGACACTG-3，
進(jìn)而采用以下經(jīng)優(yōu)化的最佳突變組合引入突變
(UlH2O23 μ
IO Pi R Bmfei (with 15 mM Ms2+)5 ill
MgCl2 (55 inM)5 ill
_S_—……、___E_
MiiCl2 (I mM)23 ill
(INTPflO inM eacli)I ill
dCTP(10 ηΛ·Ι)4 pi
ClTTPiio inBI)4 ill
DE-jitxF(iO iiM)2 ill
_VWW^VW、_ _^__·■_
DE-atxRflO iiM)2 ill
、kJf
pBST/rtii*0.5 ill
Tail DNA PolMiiei iiNei5 TJ ill)I ill
vWVW^ *、* ^*
共計(jì)__50 μ
置于 PCR Mastercycler (Eppendorf)中，94°C預(yù)變性 4 min, 94°C 50 s, 68°C 50 s(-0. TC per cycle), 72°C 50 s，共35個(gè)循環(huán)，之后72°C繼續(xù)延伸10 min，即為降落式易錯(cuò)PCR (EPTD-PCR)0 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠分離20 min (120 V, 40 mA)，割膠回收600 bp左右的條帶，經(jīng)&01 1和況^1雙酶切，再與同樣雙酶切的pET30a(+)載體連接，并轉(zhuǎn)化到疋coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞得到突變庫(kù)。(2)優(yōu)勢(shì)突變體的篩選
經(jīng)轉(zhuǎn)化的疋coli BL21 (DE3)涂于含有抗生素的LB平板(O. 5%酵母膏，1%蛋白胨，1% NaCl, I. 8% 瓊脂，100 μδ/πι1 kanamycin)上，在 37 °C下培養(yǎng) 12-16 h 后，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子至 I ml 含 Kana (100 μδ/πι1) LB 培養(yǎng)基中，在 37°C下培養(yǎng)至 OD6tltl=O. 5-1. O (約 8-10h)，加入 200 μδ/πι1 IPTG 誘導(dǎo) 16 h 后，12000 rpm 離心 5 min 收集細(xì)胞，用 O. 5 mL PBS 緩沖液(137 mM NaCl, 2. 7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7. 4)重懸細(xì)胞。在 96微孔板中分別加入上述150 μ 懸浮液與50 μ PopCulture ，混合均勻，在室溫(25°C )下緩慢震蕩30 min, 3000 Xg離心10 min，取上清液測(cè)定木聚糖酶活性。在另一 96微孔板中分別加入上述粗酶液50 μ 和50 μ 1%樺木木聚糖底物，在55°C下(氣浴)反應(yīng)30 min后，立即加入100 μ DNS，在100°C (氣浴)下顯色，10 min后取出，冷卻至室溫，測(cè)定OD54tl的吸光值，計(jì)算野生酶與突變體的活性。挑取活性高于野生酶的突變體,送至上海英駿公司測(cè)序。本設(shè)計(jì)中共利用96孔板共篩選了 671個(gè)轉(zhuǎn)化子，其中5個(gè)轉(zhuǎn)化子的活性高于野生酶。然而，經(jīng)擴(kuò)大體積培養(yǎng)表達(dá)木聚糖酶，其中僅FSI-A124的活性仍高于野生酶，由此篩選得到優(yōu)勢(shì)突變體/^/17匆，測(cè)得獲得的FSI-A124的基因序列和氨基酸序列分別如SEQ IDNO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。實(shí)施例3:
將1%的樺木木聚糖酶與I. 5 U的FSI-A124混合，在40°C、250 rpm下反應(yīng)24 h，分別在6 h、12 h、18 h 和 24 h 時(shí)間點(diǎn)取樣。利用 Waters Sugar-pak I 色譜柱(300 mm X 6. 5mm)和Waters Alliance 2695高效液相色譜儀對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行分離,利用Waters 2414示差折光檢測(cè)器分析產(chǎn)物含量。高效液相色譜分析條件是流動(dòng)相 為純水，柱溫為70°C，流速為0.5 ml/min。木糖(X)至木五糖(X5)保留時(shí)間分別為13. 666 minUl. 620 min,9. 924min、8. 760 min、和7. 790 min。以峰面積為橫坐標(biāo)(x)、糖濃度為縱坐標(biāo)(y),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各糖組分濃度。水解產(chǎn)物中木寡糖的種類包括木糖至木五糖，其中，木三糖的含量最高。水解24 h后,木二糖和木三糖的濃度分別為O. 620 mg/ml和I.240 mg/ml,分別占總水解產(chǎn)物的22. 6%和45. 6%。提示FSI-A124能有效水解木聚糖，產(chǎn)生低聚木寡糖。實(shí)施例4:
米用Nanoscope III MultiMode原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)分析木聚糖水解后的表面形態(tài)差異。取未經(jīng)處理和水解24 h后的樺木木聚糖樣品，稀釋10倍。將樣品點(diǎn)于云母片上，烤干15 min。樣品在室溫(約25°C)、濕度35%下進(jìn)行AFM分析，選擇輕敲模式，視野范圍10 Um XlO μ m。結(jié)果表明，未經(jīng)水解處理的樺木木聚糖結(jié)構(gòu)致密，表面粗糙不平，平均粗糙度峰值為261. 9 nm。多糖分子間粘連程度高，經(jīng)木聚糖酶FSI-A124處理24 h后,峰值下降至133. 3 nm。AFM分析提示,木聚糖酶能破壞木聚糖的分子粘連,成為排列較為均勻的寡糖分子。
權(quán)利要求
1.一種高效降解半纖維素的雜合木聚糖酶基因/^/17於，其特征在于，該基因通過兩個(gè)異源木聚糖酶基因anx和tfx基因經(jīng)N-端交叉重組得到的雜合基因atx，atx再經(jīng)蛋白質(zhì)體外定向進(jìn)化改造而來(lái)；所述匆具有如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示基因序列和氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效降解半纖維素的雜合木聚糖酶基因FSI-A124，該基因通過兩個(gè)異源木聚糖酶基因anx和tfx基因經(jīng)N-端交叉重組得到的雜合基因atx，atx再經(jīng)蛋白質(zhì)體外定向進(jìn)化改造而來(lái)；所述FSI-A124具有如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示基因序列和氨基酸序列；具有較好的穩(wěn)定性及較高的催化活性，在動(dòng)物生理溫度30-40℃下具有較好的水解性能，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)酶制劑的需要。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102676558SQ20121014785
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者夏偉, 王謙, 王賢勇, 錢利純 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)